一種藥物注射劑類過敏反應高內(nèi)涵檢測方法的初步建立

一種藥物注射劑類過敏反應高內(nèi)涵檢測方法的初步建立類過敏反應是藥物注射劑最常見的不良反應，但現(xiàn)有檢測方法尚存在諸多不足。該研究采用熒光標記和高內(nèi)涵篩選技術建立了一種類過敏反應體外檢測方法，應用RBL2H3細胞脫顆粒模型，以細胞膜特異熒光染料FM464標記細胞脫顆粒囊泡回收來確定陽性細胞數(shù)，以細胞核特異熒光染料Hochest3334標記細胞核來確定細胞總數(shù)，從而計算藥物刺激后的細胞脫顆粒率。為了考察高內(nèi)涵檢測方法可靠性，首先采用陽性藥物Compound48/80驗證了高內(nèi)涵檢測方法與傳統(tǒng)過敏介質(zhì)卩氨基己糖苷酶釋放和小鼠耳廓皮膚藍染檢測方法間一致性，結果顯示高內(nèi)涵檢測方法與傳統(tǒng)檢測方法高度一致，且靈敏度高于傳統(tǒng)檢測方法；然后采用30批次臨床報告過敏癥狀丹紅注射液進一步驗證高內(nèi)涵檢測方法的可靠性，結果提示高內(nèi)涵檢測結果與臨床報告高度一致，而且高內(nèi)涵方法一定程度上能夠克服注射液自身顏色干擾問題。可見，類過敏反應高內(nèi)涵檢測方法是一種靈敏、可靠、簡便且可實現(xiàn)高通量篩選的新方法，適用于藥物注射劑類過敏反應評價，能夠為臨床安全用藥提供指導。標簽：類過敏反應；注射劑；高內(nèi)涵；細胞脫顆粒[Abstract]Anaphylactoidreaction（AR）isthemostcommonadversereactionofinjectionformulations，however，thereareobviousdrawbacksinavailablemethodsforARdetectionAnovelinvitrodetectionmethodforARwasestablishedbasedonfluorescentlabelingandhighcontentscreen（HCS）systeminpresentstudyWiththeuseofRBL2H3cellsdegranulationmodel，positivecellcountwasdeterminedwithspecificcellularmembranefluorescentdyeFM464labelingvesiclerecycle，andtotalcellscountwasdeterminedwithspecificnucleusfluorescentdyeHochest3334，andthentheratioofcellsdegranulationafterdrugstimulationwascalculatedInordertoverifythereliabilityofthisHCSmethod， positivedrugCompound48/80wasfirstusedtoconfirmtheconsistenceofHCSmethodwiththetraditional^hexosaminidasereleasetestandtheEvansbluestainingearstestinmiceTheresultsshowedhighconsistencebetweenHCSmethodandtraditionaltestingmethods，andtheHCSmethodshowedhighersensitivitythantheothertwotestsThen30samplesofDanhonginjection（DHI）withclinicalallergysymptomsfurtherwereusedtoconfirmthereliabilityofthisHCSmethodTheHCSresultsshowedhighconsistencewiththeclinicalreport，andtheHCSmethodhadtheadvantageinreducingtheinterferencebydrugcolorTherefore，thisHCSmethodisreliable，sensitive，simpleandhighthroughputmethodindetectionofAR，applicablefortheARevaluationofinjectionformulations，andcanprovideguidanceforsafetyofclinicalapplicationinclinicalpractice[Keywords]anaphylactoidreaction；injection；highcontentsystem；celldegranulationdoi：10.4268/cjcmm20161024類過敏反應是藥物注射劑最常見的不良反應。藥物注射劑因絕對生物利用度高導致不良反應的風險性增高［1］，據(jù)報道臨床類過敏反應占超敏反應的77%［2］，反映了類過敏反應發(fā)生的廣泛性；中藥注射劑引發(fā)的過敏性休克中有3/4屬于類過敏反應［3］，反映了類過敏反應發(fā)生的嚴重性；因此，預測藥物注射劑類過敏反應對指導臨床安全用藥非常必要。類過敏反應是機體首次接觸類過敏原就會誘發(fā)肥大細胞/嗜堿性粒細胞脫顆粒,釋放過敏介質(zhì)引起過敏癥狀，有別于過敏反應需經(jīng)致敏階段和IgE抗體介導，但兩者在細胞脫顆粒引起過敏癥狀方面相同，在臨床藥物不良反應報道中常將兩者混淆［46］。目前由于類過敏反應發(fā)生機制尚不清楚，缺乏特異性檢測方法［45］，現(xiàn)有檢測方法借鑒了過敏反應檢測，包括在體和體外檢測2類。在體檢測方法采用動物直接給藥，通過觀測過敏癥狀、測定血清生化指標、評價血管通透性等方式判斷類過敏反應發(fā)生［1，45，7］，優(yōu)點在于接近臨床反應狀況，是目前預測藥物類過敏反應的常用方法，不足之處在于動物用量大、癥狀評價主觀性強、不同種屬動物對同一藥物反應差別大、費用高昂等。體外檢測方法采用藥物直接刺激細胞，通過檢測釋放的過敏介質(zhì)、觀測細胞脫顆粒形態(tài)改變、監(jiān)測細胞脫顆粒過程等方式判斷細胞脫顆粒的發(fā)生［78］。過敏介質(zhì)測定多采用比色法，藥物顏色對比色法測定干擾大，由于中藥注射液多數(shù)具有顏色，因而限制了其應用；采用中性紅、甲苯胺藍和阿利新藍等染料染色計算細胞脫顆粒率，由于染料特異性低導致檢測結果準確率低；采用透射電鏡觀察脫顆粒細胞形態(tài)改變雖然準確率高，但實驗成本高、操作復雜且不能動態(tài)觀察，適用于研究機制但不適用于高通量篩選；采用標記囊泡特異蛋白方法，如AnnexinV［9］或CD63［10］，特異性高但實驗程序操作復雜，不適用于高通量篩選，因此，有必要發(fā)展簡單、快速、靈敏且特異的類過敏反應高通量監(jiān)測方法來預測藥物安全性。高內(nèi)涵篩選(highcontentscreen，HCS)系統(tǒng)是基于熒光顯微成像技術進行圖像定量分析的自動化平臺，能夠在細胞結構和功能完整條件下檢測藥物對細胞多種功能活動的影響，本研究基于高內(nèi)涵平臺建立類過敏反應檢測方法；細胞脫顆粒是類過敏反應的核心環(huán)節(jié)，包括囊泡轉(zhuǎn)運、定向、錨定、融合和回收等步驟［11］，本研究采用RBL2H3細胞脫顆粒模型,應用膜特異熒光染料FM464標記細胞脫顆粒囊泡回收，在HCS系統(tǒng)檢測藥物注射劑所導致細胞內(nèi)熒光強度增加來反映細胞脫顆粒狀況，通過細胞核熒光染料Hochest33342標記細胞核進行細胞計數(shù)，計算細胞脫顆粒率來預測類過敏反應發(fā)生，從而建立一種預測注射劑類過敏發(fā)生的HCS檢測方法。材料與方法試劑與儀器大鼠嗜堿粒性白血病細胞(RBL2H3)(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，CatNoTCR7)；MEM酚紅(LotNo1645771)/無酚紅(LotNo1663883)培養(yǎng)基，胎牛血清(LotNo1205330)(Gibco公司)；熒光染料FM464(LotNo1614994，Invitrogen公司)；熒光染料Hoechst33342(LotNo#4082，CellSingalingTechnology公司)；Compound48/80(LotNo014M4062V)，0氨基己糖(LotNoSLBL1919V)(Sigma公司)；伊文思藍(LotNo619C047，北京索萊寶公司）；丹紅注射液（國藥準字Z20026866，荷澤步長制藥有限公司）；高內(nèi)涵Operetta及Harmony分析軟件（PerkinElmer公司）；FlexStation3多功能酶標儀器（MolecularDevices公司）；48/96孔透明微孔板及96孔黑色微孔板（Corning公司）。12細胞培養(yǎng)及實驗動物RBL2H3細胞，在37°C,5%CO2條件下用MEM完全培養(yǎng)基（89%MEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%雙抗）培養(yǎng)，當細胞生長匯合度達到80%時按照1：5進行傳代，約3d傳代一次。ICR小鼠，SPF級，體重20?22g，購自軍事醫(yī)學科學院，許可證號SCXK（軍）20120004，飼養(yǎng)溫度（25±2）C，相對濕度40%?60%。本實驗操作經(jīng)由天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院動物福利倫理委員會批準實施（TJABJY2012001）。13建立類過敏反應HCS檢測為了建立類過敏反應的HCS檢測方法，采用Compound48/80作為工具藥優(yōu)化高內(nèi)涵檢測條件。131優(yōu)化熒光染料FM464染色濃度和染色時間RBL2H3細胞接種于96孔黑色微孔板中培養(yǎng)24h，為了優(yōu)化染色濃度，考察FM464在10,20,40,50mg?L-1染色效果；為了優(yōu)化染色時間，F(xiàn)M464與細胞共孵育時間在15,30,45,60min時進行HCS檢測。FM464激發(fā)波長520?550nm,發(fā)射波長650?760nm,在高內(nèi)涵Operetta系統(tǒng)獲得圖像信息，采用Harmony分析軟件進行圖像分析。實驗每次3個復孔，通過3次重復實驗（n=9）確定，細胞實驗設計除特殊強調(diào)外均與此相同。132優(yōu)化Compound48/80的HCS檢測濃度為了優(yōu)化Compound48/80刺激細胞脫顆粒濃度，設立對照組、Compound48/80終濃度100,150,200,500mg?L-1組，在37C與細胞共孵育30min進行HCS檢測。采用FM464特異染色囊泡膜回收來確定陽性細胞數(shù)，采用Hoechst33342特異染色細胞核確定細胞總數(shù)，Hoechst33342激發(fā)波長360?400nm,發(fā)射波長410?480nm,經(jīng)HCS系統(tǒng)檢測后計算細胞脫顆粒率。為了計算細胞脫顆粒率，首先根據(jù)文獻結果［13］確定了對照組RBL2H3細胞基礎細胞脫顆粒率40%,與對照組有顯著性差異（圖4）,在500mg.L-1時，HCS方法檢測結果細胞脫顆粒率可達到〉90%；但在Compound48/80100mg?L-l卩氨基己糖苷酶釋放率只有5%,與對照組無顯著性差異（圖5）,在500mg.L-1時只達到17%。這種現(xiàn)象可以從理論上得到解釋，細胞脫顆?？赏瑫r釋放多種過敏介質(zhì)，包括組胺、P氨基己糖苷酶、類胰蛋白酶等，因各種過敏介質(zhì)本身釋放量不同，加之測定方法靈敏度不同，導致檢測單一過敏介質(zhì)卩氨基己糖苷酶釋放率有其局限性；與之相對應，所有細胞脫顆粒過程均存在囊泡回收現(xiàn)象，采用膜特異熒光染料標記囊泡回收現(xiàn)象，從理論上較檢測單一過敏介質(zhì)釋放率靈敏度要高。在實際工作中，采用過敏介質(zhì)釋放評價類過敏反應常需要同時測定數(shù)種過敏介質(zhì)，增加了工作量和試驗成本；相比而言，囊泡回收是囊泡釋放之后的關鍵步驟，采用特異細胞膜染色法較之中性紅和甲苯胺藍等染料的特異性強，因而可靠性和準確性更高。HCS檢測方法與動物耳廓藍染方法結論一致，證實了HCS方法的可靠性，由于兩者劑量單位不同，無法比較兩者間靈敏度高低，但顯然基于細胞水平的HCS檢測方法比動物耳廓藍染方法在動物使用、操作便捷和高通量篩選方面具有顯著優(yōu)勢。30批次臨床報告過敏癥狀DHI樣品HCS檢測結果與臨床觀察結果符合率在866%，考慮到臨床報告過敏癥狀樣品的實際情況較復雜，其中可能包括了類過敏、過敏反應或藥物毒性反應等情況，本實驗結果屬于與臨床觀察符合度較高水平。測試樣品自身顏色是比色法測定的重要干擾因素，實驗結果提示HCS方法抗干擾能力強于比色法。過敏介質(zhì)測定多用比色法，包括組胺Elisa檢測法、卩氨基己糖苷酶和類胰蛋白酶檢測法等，由于中藥注射液多數(shù)具有顏色，會對試驗結果存在嚴重干擾，本研究在測定臨床報道過敏癥狀DHI樣品對卩氨基己糖苷酶釋放率影響時，確證了DHI自身顏色，尤其在稀釋倍數(shù)低時對測試結果存在嚴重干擾，因此比色法在這種情況下的應用受到限制。HCS檢測方法同樣受到測試樣品自身顏色干擾，在DHI樣品測試中，本研究采用考察正常DHI樣品對FM464熒光強度影響，計算出不同稀釋倍數(shù)DHI降低FM464熒光強度轉(zhuǎn)換系數(shù)，用于確定同等條件下脫顆粒細胞計數(shù)標準，從而獲得類過敏反應樣本在同樣稀釋倍數(shù)下的脫顆粒陽性細胞數(shù)，基于DHI初步實驗結果提示熒光檢測法比光譜吸收比色法在對抗測試樣品自身顏色干擾能力強，提示HCS檢測方法適用范圍可能較比色法更廣泛，同時考慮到中藥注射液化學成分復雜，需要結合具體研究對象進行系統(tǒng)考察?？傊?，Compound48/80結果顯示HCS方法結論與傳統(tǒng)過敏介質(zhì)檢測方法卩氨基己糖苷酶釋放率、整體動物耳廓藍染反應結論高度一致，證明高內(nèi)涵檢測方法可靠；基于30批次臨床報告過敏癥狀DHI樣品檢測結果證實HCS方法與臨床觀察結果高度一致，表明HCS方法能夠用于預測藥物臨床類過敏反應。因此，本研究建立了一種簡單、靈敏、高通量檢測藥物注射劑的類過敏反應高內(nèi)涵檢測方法。[參考文獻]⑴李佳，黃芝瑛注射用輔料類過敏反應的非臨床評價方法[J].藥物評價研究，2010，33（1）：9.SzeheniJ.Complementactivati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