陳娜娜 開題報告

浙江大學·動物科學學院蛋氨酸鋅絡（螯）合物在產蛋雞上的耐受性研究ResearchoftheEnduranceofZinc-MethioneininLayingHens陳娜娜214170712015-4-28主要內容

研究內容2試驗方案3

立題依據1試驗創(chuàng)新4進度安排5立題依據1蛋氨酸鋅概念及營養(yǎng)學特性2蛋氨酸鋅在蛋雞生產中的應用2蛋氨酸鋅應用中存在的問題立題依據蛋氨酸鋅由蛋氨酸與無機鋅以1：1或2：1的摩爾比例在特定條件下生成的具有獨特環(huán)狀結構的金屬絡（螯）合物，是一種類似動物體內吸收和發(fā)揮生物功能形式的有機微量元素添加劑。蛋氨酸鋅是農業(yè)部“1224號公告”中允許使用的有機微量元素添加劑，在畜禽生產上使用廣泛。Zn(C5H10NO2S)2（C5H10NO2SZn）HSO4立題依據1、蛋氨酸鋅絡（螯）合物的營養(yǎng)學特性與無機鋅相比，蛋氨酸鋅具有生物學效價高、雙重營養(yǎng)功能、毒副作用小等營養(yǎng)特點。（1）生化性質穩(wěn)定，對飼糧成分破壞小在蛋氨酸鋅中，鋅離子以共價鍵和離子鍵兩種鍵合形式與蛋氨酸配位體結合形成特殊的環(huán)狀結構?！@種特殊的環(huán)狀結構可以抵抗或緩解鋅與其它礦物質元素（例如鈣、銅、錳）的拮抗作用；——同時避免或減少植酸、纖維與鋅離子在腸道內螯合，從而可以提高鋅的吸收率；——同時還能減輕金屬離子氧化還原反應對飼糧維生素的破壞，從而減少營養(yǎng)物質的損失。一、項目任務來由（背景）（2）蛋氨酸鋅的生化特性接近鋅在動物體內的吸收利用方式，生物學效價高蛋氨酸鋅的生化特性接近鋅在動物體內的吸收利用方式，能有效促進鋅離子運輸到特定靶組織和酶系統并發(fā)揮相應生物學功能，具有良好的組織定向，減少許多生化過程，節(jié)約體能消耗，生物學效價高，能滿足禽類在生長發(fā)育、繁殖、應激等特殊時期的需求，并減少鋅的排放。（3）蛋氨酸鋅的雙重營養(yǎng)功能此外，蛋氨酸鋅既可以滿足機體所需微量元素——鋅，又可以補充禽類玉米豆粕型飼糧中第一限制性氨基酸——蛋氨酸，具有雙重營養(yǎng)功能，其作用效果優(yōu)于無機鋅。立題依據（4）蛋氨酸鋅作為“獨立單元”發(fā)揮特殊的營養(yǎng)功能蛋氨酸不僅能夠提高鋅的生物學利用率，還能作為“獨立單元”發(fā)揮特殊的營養(yǎng)功能，如增強抗菌能力、抗應激、改善畜禽繁殖性能等，從而最大程度提高動物生產性能，可起到部分代替抗生素的作用。立題依據2蛋氨酸鋅在蛋雞生產中的研究進展（1）國外關于蛋氨酸鋅在蛋雞生產中的研究進展Jackson等對63~88周齡的商品蛋雞進行試驗，發(fā)現飼糧中添加蛋氨酸鋅可顯著降低蛋雞的死亡率（8.9%）,并且產蛋率提高8.57%%，其產蛋性能明顯提高。Kienholz等報道，蛋氨酸鋅能緩解產蛋雞的應激，增強其對室內高溫、低鈣日糧的適應能力。還有研究表明，蛋氨酸鋅能顯著提高7周齡T淋巴細胞轉化指數（18.06%)、抗體IgG含量（12.02%),降低死亡率（7.65%）及球蟲病發(fā)病率（1.66%）。立題依據2蛋氨酸鋅在蛋雞生產中的研究進展（2）國內關于蛋氨酸鋅在蛋雞生產中的研究進展目前國內外對蛋氨酸鋅在蛋雞日糧中的添加量報道不一。許甲平等報道海蘭褐蛋雞飼糧中添加40mg/kg蛋氨酸鋅生產性能最佳，可使產蛋率提高4.37%；張亞男等研究發(fā)現，產蛋后期海蘭灰蛋雞飼糧中使用硫酸鋅且添加水平為70mg/kg時生產效果效果最佳，140mg/kg蛋氨酸鋅組蛋殼質量最好。但也有報道稱，高劑量的蛋氨酸鋅不僅會導致資源浪費和環(huán)境污染，而且會導致動物生長受阻，生產性能下降，免疫力低下、抗氧化能力降低。Mabe等報道，飼糧中添加100mg/kg蛋氨酸鋅會導致產蛋率下降。立題依據3蛋氨酸在蛋雞應用中存在的問題：2013年7月，歐盟（EU)發(fā)布No.636/2013號法規(guī)，批準蛋氨酸鋅作為飼料添加劑使用，并規(guī)定在家禽中的最大添加量為200mg/kg。在我國，蛋氨酸鋅雖為農業(yè)部《飼料添加劑安全使用規(guī)范》（1224號公告）中規(guī)定允許使用的飼料添加劑，并且在蛋雞生產中取得了較好的效果，但在實際應用中尚存在以下問題；無行業(yè)標準、蛋雞日糧使用的安全性、有效劑量、使用條件、有效的飼用方式（飲水或飼料)等均有待研究確定，在《飼料添加劑安全使用規(guī)范》（1224號公告）中未給出安全限量，所以對蛋氨酸鋅在蛋雞上的應用進行安全性評價是很有意義的。立題依據根據《飼料和飼料添加劑畜禽靶動物耐受性評價指南（試行）》（農辦牧【2011】21號）以及蛋氨酸鋅對家禽營養(yǎng)的特殊性，設計了蛋氨酸鋅在蛋雞上的耐受性試驗。主要內容

研究內容2試驗方案3

立題依據1試驗創(chuàng)新4進度安排5研究內容對蛋雞進行6個不同劑量的蛋氨酸鋅添加處理，探究不同劑量的蛋氨酸鋅處理對蛋雞臨床表現、蛋雞生產性能、蛋品質、血液學指標的影響及對蛋雞器官組織的毒性作用；通過分析，確定蛋氨酸鋅在蛋雞玉米-豆粕型日糧中的安全限量值，為蛋氨酸鋅在蛋雞生產中應用提供指導。主要內容

研究內容2

試驗方案3

立題依據1試驗創(chuàng)新4進度安排5試驗方案1材料和方法2試驗設計3飼養(yǎng)管理及試驗記錄4指標及測定方法5統計學分析試驗方案飼養(yǎng)試驗試驗記錄、采樣及指標測定臨床觀察生產性能雞蛋品質血液學指標測定組織學檢查技術路線統計分析統計分析試驗方案表2蛋氨酸鋅對蛋雞耐受性試驗設計試驗處理蛋氨酸鋅添加量（以鋅計）試驗組Ⅰ基礎日糧+0mg/kgZn-Met試驗組Ⅱ基礎日糧+70mg/kgZn-Met試驗組Ⅲ基礎日糧+140mg/kgZn-Met試驗組Ⅳ基礎日糧+350mg/kgZn-Met試驗組Ⅴ基礎日糧+700mg/kgZn-Met試驗組Ⅵ基礎日糧+1400mg/kgZn-Met注:添加蛋氨酸鋅后調整每組蛋氨酸水平使其保持一致試驗方案1材料和方法1.1試驗材料1.1.1蛋氨酸鋅絡（螯）合物產品市場采購蛋氨酸鋅絡（螯）合物產品，預混合，隨同其他飼料原料一起混合。1.1.2試驗動物及安置將采食正常、體重相近的健康開產海蘭白蛋雞540只（19周齡，整齊度90%以上），隨機分為6個處理，檢驗各處理間雞的體重、產蛋率、平均蛋重等差異不顯著，每個處理6個重復，每個重復15只雞，每3只雞一個單籠（45cm×30cm×30cm）。本試驗分為預試期、正試期兩個階段。預試期1周，正試期8周。預試期飼喂正常的蛋雞全價料，在一個周內逐漸換為參試日糧。試驗方案1.2試驗設計1.2.1試驗處理與安排本試驗采用單因子隨機區(qū)組設計。根據有效性試驗得出的有效劑量，設計：0、有效劑量組、2倍有效劑量組、5倍有效劑量組、10倍有效劑量組、20倍有效劑量組，即0、70mg/kg、140mg/kg、350mg/kg、700mg/kg、1400mg/kg。全期需要制作6種全價配合飼料約4t,共需要蛋氨酸鋅絡（螯）合物10.5kg。消耗飼糧：540×56×120g/h/d=3628.8kg盡量使每個重復分開，6個處理的各重復均勻分布于雞舍內。試驗方案

試驗蛋雞消耗飼糧預測表處理1處理2處理3處理4處理5處理6小計消耗飼糧/kg604.8604.8604.8604.8604.8604.83628.8消耗蛋氨酸鋅/kg00.2490352940.4980705881.2451764712.4903529414.9807058829.463341176消耗鋅/kg00.0423360.0846720.211680.423360.846721.608768注:蛋氨酸鋅絡（螯）合物中含鋅量為17%試驗方案1.2.2試驗日糧試驗日糧將在參照NRC（1994）和NY/T33-2004的基礎上，并結合海蘭白產蛋雞飼養(yǎng)手冊配制，試驗擬采用玉米-豆粕日糧，日糧組成及營養(yǎng)成分含量見下表。試驗方案試驗日糧組成和營養(yǎng)成分？試驗方案注：1)預混料為每千克日糧提供：VA12500IU；VD34125IU；VE15IU；VK2mg；硫胺素1mg；核黃素8.5mg；泛酸鈣50mg；煙酸32.5mg；吡哆醇8mg；葉酸5mg；VB125mg；膽堿500mg；Mn65mg；I1mg；Fe60mg；Cu8mg；Se0.3mg。2)添加蛋氨酸鋅后調整蛋氨酸水平，使其水平保持一致。3)營養(yǎng)水平中除鋅為實測值，其他均為計算值。試驗方案1.3飼養(yǎng)管理及試驗記錄——飼養(yǎng)方式：采用半開放式雞舍3層立體籠養(yǎng)，每排相連的5個雞籠作為一個重復，每籠3只雞（共用180個雞籠），各重復平均分布在上中下三排階梯式籠養(yǎng)架上?！庹罩贫龋翰捎米匀还庹蘸腿斯ぱa光方式，光照時間為16小時，并保持恒定，采用早晚補光保證光照時間，光照強度為20lx。試驗方案——溫濕度：每天14:00記錄溫度和濕度、天氣情況；隨氣候、季節(jié)和陽光而變化，試驗期間溫度變化范圍為20.0±5℃；相對濕度在40%~70%?！L方式：自然通風和橫向負壓通風相結合；——其他：飼料為干粉料，自由采食，每天加料2次，勻料4次；乳頭式飲水器，自由飲水；專人管理，每日撿蛋兩次；每周帶雞消毒和清理雞糞一次；依本地區(qū)商品代蛋雞常規(guī)防疫制度進行免疫。試驗方案1.4指標及測定方法1.4.1臨床觀察試驗期內每天觀察試驗動物臨床表現、采食和飲水情況、生長情況，發(fā)現打蔫雞只，及時淘汰；詳細觀察和記錄蛋雞的不良反應。對試驗中出現的不明原因的死亡進行尸檢，進行組織學分析，確定病因。1.4.2生產性能以重復為單位，記錄每天產蛋數（包括軟殼蛋、破殼蛋）、日產蛋總質量、死亡雞數，每周記錄雞的耗料量一次。最后計算出每周和全期的產蛋率、日采食量、平均蛋重、料蛋比、軟殼蛋率等生產性能指標。試驗方案日期室溫病死只數淘汰只數實存只數采食量/kg產蛋量蛋重/kg不合格蛋（破、軟）備注重復1重復2重復3重復4重復5重復6產蛋期日常管理記錄表試驗方案1.4.3雞蛋品質以重復為單位，每重復、每周采樣5枚，每周共采180枚雞蛋，當日測定雞蛋品質相關指標。采用蛋品質測定儀（以色列OPK公司生產）測定蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度、蛋黃顏色、雞蛋分級、哈氏單位和蛋重等指標。雞蛋采樣試驗方案雞蛋品質測定采樣記錄表周次12345678小計重復6×66×66×66×66×66×66×66×6288雞蛋數量1801801801801801801801801440試驗方案每個重復雞蛋品質測定記錄表編號測定項目蛋重wt(g)蛋殼厚度thk(mm)蛋殼強度str(kgf)蛋白高度height（mm)蛋黃顏色YCF哈氏單位HU雞蛋分級RK12345試驗設計1.4.4血液學指標檢測分別于2、4、6、8周末，以重復為單位隨機選擇1只產蛋雞，分別用一支抗凝管、一支促凝管采血2ml、5ml。一份全血立即測定血常規(guī)指標，包括白細胞計數（WBC)、紅細胞計數（RBC)、血紅蛋白（HGB)、紅細胞壓積（HCT）、血小板計數（PLT)。另一份血樣于3000r/min離心10min制備血漿，上清液分裝于1.5mlEP管中，置于-20℃冰箱保持備用。試驗方案血液學指標檢測周次2468小計重復6×66×66×66×6144血清36363636144全血36363636144試驗方案測定指標如下：（1）基本生化指標谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、總蛋白、白蛋白、肌酐、尿酸、血糖、總膽紅素、尿酸氮、堿性磷酸酶等指標。采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，在酶標儀上進行測定。（2）抗氧化指標谷胱甘肽過氧化物酶、銅鋅超氧化物歧化酶、丙二醛含量和總抗氧化能力的測定。采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，測定時嚴格按照試劑盒說明書操作。（3）免疫學指標IgA、IgG、IgM、溶菌酶水平。采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，測定時嚴格按照試劑盒說明書操作。試驗方案基本生化指標測定項目測定方法測定意義1AKP微量酶標法評價含鋅酶活2GOT賴氏法評價肝臟功能3GPT賴氏法評價肝臟功能4TPRO考馬斯亮藍法評價血清總蛋白指標5UA比色法評價腎臟功能6CRE除蛋白苦味酸比色法評價腎臟功能7GLU葡萄糖氧化酶-過氧化酶法評價血糖指標8TBILI苯甲酸鈉-咖啡因比色法評價肝臟功能9BUN脲酶法評價腎臟功能10ALB溴甲酚綠比色法評價肝臟功能115‘-NT評價含鋅酶活試驗方案抗氧化指標測定項目測定方法測定意義1GSH-PX比色法評價該酶活性2CuZn-SOD抽提法評價含鋅酶活3MDATBA法（硫代巴比妥酸法）評價氧化狀態(tài)4T-AOC比色法測定血清總抗氧化能力試驗方案免疫學指標測定項目測定方法測定意義1IgA抗原抗體特異性結合評價免疫能力2IgM抗原抗體特異性結合評價免疫能力3IgG抗原抗體特異性結合評價免疫能力4溶菌酶比濁法評價免疫能力試驗設計（4）血漿含鋅量：經濃硝酸在MARS5高壓密閉微波消解器（CEM，USA）中濕消化后，在IRISIntrepidⅡ等離子體發(fā)射光譜儀（TE，USA）上測定Zn的含量。試驗方案1.4.5組織學檢測（1）內臟器官指數（2）腸粘膜免疫（3）肝臟含鋅酶活（4）組織鋅含量測定（5）小腸和胰臟MT含量測定（6）小腸、胰臟MT和ZnT-2mRNA水平（7）組織病理學檢查試驗方案1.4.5組織學檢測分別于飼養(yǎng)期的第8、24周，以重復為單位，每個重復選取1只空腹稱重，屠宰，解剖。分別按照如下要求采集、制備、保存樣品。(1)內臟器官指數：剖取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎、胸腺，剔除脂肪組織，并用濾紙吸取血漬，然后迅速稱重。內臟器官指數=內臟器官鮮重（g)/活體重（kg）。（2）腸道粘膜免疫：測定空腸食糜SIgA含量。收集空腸內容物，將內容物與生理鹽水1:1稀釋，混勻后5000rpm4℃離心15min,分離上清液，測定SIgA含量。采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作。試驗方案1.4.5組織學檢測（3）肝臟含鋅酶活：銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD)、堿性磷酸酶（AKP）、5‘-核苷酸酶（5’-NT)活性測定。測定項目測定方法測定意義1CuZn-SOD抽提法評價含鋅酶活2AKP微量酶標法評價含鋅酶活35‘-NT評價含鋅酶活試驗一蛋氨酸鋅絡（螯）合物對產蛋雞的有效性試驗研究主要操作步驟：準確稱取肝臟0.40g,加入生理鹽水4ml生理鹽水，冰浴勻漿5min后，4℃3000r/min離心15min，取上清液。采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作。（4）組織鋅含量測定：摘取肝臟、胰臟、腎臟、左側脛骨、蛋黃于-20℃保存，以備分析組織鋅含量。測定方法：經濃硝酸在MARS5高壓密閉微波消解器（CEM，USA）中濕消化后，在IRISIntrepidⅡ等離子體發(fā)射光譜儀（TE,USA）上測定Zn的含量。試驗方案（5）小腸、胰臟MT含量：取部分胰臟、小腸于-196℃液氮保存，以備分析MT、ZnT-2mRNA水平。采用鎘血紅蛋白親和力分析法分析小腸、胰臟中MT的含量。主要操作步驟：取大約1g組織樣品（小腸、胰臟），加3倍體積的冰10mMTris-HCl緩沖液（pH7.4），勻漿1~2min，4℃4000rpm離心30min，取上清沸水浴5分鐘，冰浴速冷，4℃10000rpm離心5min，吸取上清液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）小腸、胰臟MT和ZnT-2mRNA水平：采用SYBRGREEN實時熒光定量RT-PCR法（QRT-PCR)測定小腸和胰臟中MT和ZnT-2mRNA水平。試驗方案主要操作步驟：用Trizol試劑（購于Invitrogen公司）一步抽提法提取小腸和胰臟細胞中的總RNA。用UltraspecⅢ紫外可見分光光度計測定其OD260、OD280，計算OD260/OD280,比值均在1.8以上。用0.8%的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA的完整性。檢測后立即對總RNA進行反轉錄，-80℃冷凍保存待用。采用2–△Ct值法，計算出MTmRNA、ZnT-2mRNA的相對表達量。按照SuperScriptⅢTMFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR試劑盒（購自Invitrogen公司）使用說明，合成cDNA模板。根據MT、ZnT-2序列和β-actincDNA序列，分別設計合成其擴增引物，如下表所示。試驗方案試驗方案（7）組織病理學檢查試驗第8周結束時，每重復選擇1只健康蛋雞，稱重，進行組織病理學檢查。針對出現中毒癥狀的劑量組及更高劑量組及尸檢異常的動物的主要器官（心、肝、脾、肺、腎、胸腺、胰臟、胃、十二指腸、回腸、直腸、淋巴結、輸卵管、卵巢等組織）進行系統的組織病理學檢查，并與對照組合有效劑量組進行對比。檢查方法采用適宜的染色方式，進行石蠟切片觀察定性和定量。試驗方案1.5統計分析采用SPSS20.0軟件的ANOVA程序進行統計分析，用LSD和Ducan法進行顯著性檢驗。以P<0.05為差異顯著性標準，P<0.01為極顯著。預期結果通過耐受性試驗，探究長期高劑量蛋氨酸鋅對蛋雞生產性能、蛋品質、免疫指標、抗氧化能力、血漿生化指標的影響及對機體器官組織的毒性作用；通過分析，確定蛋氨酸鋅在蛋雞玉米豆粕型日糧中的安全限量值，即開始出現毒性反應處理組的前一組處理組的蛋氨酸鋅添加量，以期為蛋氨酸鋅在蛋雞生產中應用提供指導。主要內容

研究內容2

試驗方案3

立題依據1

試驗創(chuàng)新4進度安排5可行性分析浙江大學飼料所是農業(yè)部認定的“肉雞和蛋雞飼料有效性評價機構”之一，有資格開展新飼料和新飼料添加劑的評價試驗，飼料所試驗基地有能力承擔新飼料和飼料添加劑評價。浙江大學飼料所擁有儀器設備總價值達5000多萬元，擁有先進細胞分子生物學儀器能充分保證項目研究的順利進行。本試驗設計方案是在國內外研究基礎上，嚴格參照農業(yè)部《飼料和飼料添加劑畜禽靶動物有效性評價試驗指南（試行）》和《飼料和飼料添加劑畜禽靶動物耐受性評價試驗指南（試行）》（農辦牧[2011]21號）進行設計。創(chuàng)新性分析目前，農業(yè)部“1224號公告”中將蛋氨酸鋅絡（螯）合物列為允許使用的飼料添加劑，但在蛋雞生產中尚