第1章遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)2

復習提問1.試解釋染色體、同源染色體、染色單體的概念。2.有絲分裂的遺傳學意義是什么?三、細胞的減數(shù)分裂

1．概念:減數(shù)分裂：性母細胞成熟時配子形成過程中發(fā)生的一種特殊有絲分裂

使體細胞的染色體數(shù)目減半。例如:豬2n=38、牛2n=60、山羊2n=60

減數(shù)分裂

n=19

n=30

n=30

n

(卵)+n(精)→

2n(體)

受精作用可保證物種染色體數(shù)恒定。(一)減數(shù)分裂（meiosis）過程：2．特點:

(1).各對同源染色體在細胞分裂前期配對（或聯(lián)會）；(2).細胞分裂過程中包括兩次分裂:

第一次分裂中染色體減數(shù)，這次分裂的前期較復雜，又可細分為五期（細線期→偶線期→粗線期→雙線期→終變期）；

第二次分裂染色體等數(shù)。●減數(shù)分裂是性母細胞成熟時，配子形成過程中所發(fā)生的一種特殊的有絲分裂，又稱成熟分裂(maturationdivision)。其結(jié)果是產(chǎn)生染色體數(shù)目減半的性細胞，所以稱為減數(shù)分裂。減數(shù)分裂的特殊性表現(xiàn)在：●具有一定的時間性和空間性：生物個體性成熟后，動物性腺和植物造孢組織細胞中進行。●連續(xù)進行兩次分裂：遺傳物質(zhì)經(jīng)過一次復制，連續(xù)兩次分裂，導致染色體數(shù)目的減半?！裢慈旧w在第一次分裂前期(前期I，PI)相互配對(paring)，也稱為聯(lián)會(synapsis)；并且在同源染色體間發(fā)生片段的交換。

減數(shù)分裂的過程(一)、間期(前間期,

preinterphase)(二)、減數(shù)第一分裂

(meiosisI)(三)、中間期

(interkinesis)(四)、減數(shù)第二分裂

(meiosisⅡ)前期I中期I后期I末期I前期II中期II后期II末期II減數(shù)分裂的過程

——間期(interphase)●性母細胞進入減數(shù)分裂前的間期稱為前減數(shù)分裂間期，也稱為前間期?！襁@一時期是為性細胞進入減數(shù)分裂作準備。其準備的內(nèi)容包括：染色體復制；有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)化.特征：●持續(xù)時間比有絲分裂間期長，特別是合成期較長；●合成期間往往僅有約99.7%的DNA完成合成，而其余的0.3%在偶線期合成。

減數(shù)分裂的過程——前期I(prophaseI,PI)●這一時期細胞內(nèi)變化復雜，所經(jīng)歷的時間較長，細胞核比有絲分裂前期核要大些?！窀鶕?jù)核內(nèi)變化特征，可進一步分為五個時期：(1)細線期(leptotene，PI1).(2)偶線期(zygotene，PI2).(3)粗線期(pachytene，PI3).(4).雙線期(diplotene，PI4).(5)終變期(diakinesis，PI5).減數(shù)分裂的過程——細線期(leptonene，PI1)●染色體開始螺旋收縮，在光學顯微鏡下呈細長線狀；有時可以較為清楚地計數(shù)染色體數(shù)目?！襁@時每個染色體含有兩染色單體，由著絲點連接，但在光學顯微鏡下還不能分辨染色單體。減數(shù)分裂的過程——偶線期(zygotene，PI2)●同源染色體的對應部位相互開始緊密并列，逐漸沿縱向配對在一起，稱為聯(lián)會(synapsis)。●細胞內(nèi)2n條染色體可配對形成n對染色體。配對的兩條同源染色體稱為二價體(bivalent)?！窦毎麅?nèi)二價體(n)的數(shù)目就是同源染色體的對數(shù)。聯(lián)會復合體(synaptonemalcomplex)的結(jié)構(gòu)兩條同源染色體在聯(lián)會時形成一種特殊的結(jié)構(gòu)——聯(lián)會復合體，其構(gòu)成如圖所示：●兩條同源染色體的主要部分(染色質(zhì)DNA)分布在聯(lián)會復合體的外側(cè)；●中間部分(中央成分，centralelement)以蛋白質(zhì)為主，也包含部分DNA(稱為橫絲)。減數(shù)分裂的過程——粗線期(pachytene，PI3)隨著染色體的進一步螺旋，二價體逐漸縮短加粗，二價體具有四條染色單體，所以又稱為四合體或四聯(lián)體(tetrad)；聯(lián)會復合體的結(jié)構(gòu)完全形成；

●姊妹染色單體與非姊妹染色單體；

●非姊妹染色單體間成交換，導致同源染色體發(fā)生片段交換(exchange)，導致同源染色體間發(fā)生遺傳物質(zhì)重組(recombination)。粗線期細胞形態(tài)圖非姊妹染色單體片斷交換非姊妹染色單體片斷交換減數(shù)分裂的過程——雙線期(diplotene，PI4)●染色體繼續(xù)縮短變粗；●非姊妹染色單體之間由于螺旋卷縮而相互排斥，同源染色體局部開始分開；●非姊妹染色單體間的交換部位仍由橫絲連接，因而同源染色體間仍由一至二個交叉(chiasmata)聯(lián)結(jié)。減數(shù)分裂的過程——終變期(diakinesis，PI5)●染色體進一步濃縮，縮短變粗；●同源染色體間排斥力更大，交叉向二價體兩端移動，逐漸接近于末端，該過程稱為交叉端化(terminalization)?！穸r體在核內(nèi)分散分布，因而常用以鑒定染色體數(shù)目，二價體數(shù)目就是同源染色體的對數(shù)。染色體交叉動態(tài)變化減數(shù)分裂的過程——中期I(metaphaseI,MI)●核仁和核膜消失，紡錘體形成，紡錘絲附著在著絲點上并將二價體拉向赤道板位置?！衩總€二價體的兩同源染色體分布在赤道板的兩側(cè)，同源染色體的著絲點分別朝向兩極，赤道板位置上是將同源染色體相連交叉部分(已經(jīng)端化)?！裨诙r體趨向赤道板的過程中，兩條同源染色體的排列方向(著絲粒取向)是隨機的?！駨募忓N體的極面觀察，n個二價體分散排在赤道板的附近，因而這也是可用于鑒定染色體數(shù)目的重要時期之一。中期I二價體的隨機取向●如果某生物有兩對同源染色體：AA’和BB’，產(chǎn)生的性細胞具有AA’中的一條和BB’中的一條?！穹峭慈旧w在性細胞中可能有22=4種組合（配子）。減數(shù)分裂的過程——后期I(anaphaseI,AI)●紡錘絲牽引染色體向兩極運動，使得同源染色體末端脫開，一對同源染色體分別移向兩極?！衩繕O具有一對同源染色體中的一條(共有n條染色體)，使得子細胞中染色體數(shù)目從2n減半到n。●此過程并不進行著絲粒分裂，沒有發(fā)生染色單體分離；每條染色體都仍然具有兩個染色單體，并且由著絲粒相連。

減數(shù)分裂的過程——末期I(telophaseI,TI)●染色體到達兩極之后，松散、伸長、變細(但通常并不完全解螺旋)；●核仁、核膜逐漸形成(核分裂完成)，產(chǎn)生兩個子核?！窦毎|(zhì)也隨之分裂，兩個子細胞形成，稱為二分體(dyad)。

減數(shù)分裂的過程——

中間期(interkinesis)中間期是減數(shù)分裂的兩次分裂之間的一個間歇。此時期與有絲分裂的間期相比有顯著不同：●時間很短暫。在許多動物之中，甚至沒有明顯的停頓和間歇存在。●不進行DNA復制，中間期前后細胞中DNA的含量也沒有變化?！袢旧w的螺旋化程度較高。

減數(shù)分裂的過程——

減數(shù)第二分裂(meiosisⅡ)減數(shù)第二分裂是第一分裂所產(chǎn)生的兩個子細胞繼續(xù)進行同步分裂，與有絲分裂沒有實質(zhì)區(qū)別,仍可分為前、中、后、末四個時期：動物細胞減數(shù)分裂的模式圖植物細胞減數(shù)分裂模式圖(二)減數(shù)分裂的遺傳學意義

減數(shù)分裂是有性生殖生物產(chǎn)生性細胞所進行的細胞分裂方式；而兩性性細胞受精結(jié)合(細胞融合)產(chǎn)生合子是后代個體的起始點。減數(shù)分裂不僅是生物有性繁殖必不可少的環(huán)節(jié)之一，也具有極為重要的遺傳學意義。保證了親代與子代之間染色體數(shù)目的恒定性。雙親性母細胞(2n)經(jīng)過減數(shù)分裂產(chǎn)生性細胞(n)，實現(xiàn)了染色體數(shù)目的減半；雌雄性細胞融合產(chǎn)生的合子(及其所發(fā)育形成的后代個體)就具有該物種固有的染色體數(shù)目(2n)，保持了物種的相對穩(wěn)定。子代的性狀遺傳和發(fā)育得以正常進行。染色體數(shù)目的恒定(二)減數(shù)分裂的遺傳學意義

為生物的變異提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。減數(shù)分裂中期I，二價體的兩個成員排列方向是隨機的，所以后期I分別來自雙親的兩條同源染色體隨機分向兩極，因而所產(chǎn)生的性細胞就可能會有2n種非同源染色體組合形式(染色體重組，recombinationofchromosome)。另一方面，非姊妹染色單體間的交叉導致同源染色體間的片段交換(exchangeofsegment)，使子細胞的遺傳組成更加多樣化，為生物變異提供更為重要的物質(zhì)基礎(chǔ)(染色體片斷重組，recombinationofsegment)。這也是連鎖遺傳規(guī)律及基因連鎖分析的基礎(chǔ)。如果某生物有兩對同源染色體：AA’和BB’，產(chǎn)生的性細胞具有AA’中的一條和BB’中的一條。非同源染色體在性細胞中可能有22=4種組合。中期I二價體的隨機取向非姊妹染色單體交叉與片斷交換減數(shù)分裂有絲分裂第三節(jié)遺傳物質(zhì)的分子基礎(chǔ)1、DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù)2、DNA是遺傳物質(zhì)的直接證據(jù)(1)細菌轉(zhuǎn)化試驗(2)噬菌體侵染與繁殖試驗(3)煙草花葉病毒感染和繁殖實驗一、核酸是遺傳物質(zhì)●

DNA含量的恒定性；●

DNA代謝的穩(wěn)定性；●存在的普遍性；●基因突變與紫外線誘變波長的關(guān)系。DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù)(一)細菌轉(zhuǎn)化試驗●肺炎雙球菌光滑型（S型）：SI、SII、SIII有毒性粗糙型（R型）：RI、RII、RIII無毒性●由于菌株間含有不同的多糖和蛋白質(zhì)，感染動物以后誘導生成的抗體不同，區(qū)分為SI、SII、SIII等；R型由S型突變而來，相應為RI、RII、RIII等。1928年Griffith實驗：DNA是遺傳物質(zhì)的直接證據(jù)●

1944年，Avery重復了上述實驗，并把SIII型的DNA，Pr，夾膜提取物分別加入RII型培養(yǎng)基，結(jié)果只有DNA使少量RII型轉(zhuǎn)化為SIII型，并能穩(wěn)定的遺傳下去。說明引起轉(zhuǎn)化的物質(zhì)是DNA?！裆鲜龉ぷ魇沁z傳學和生物化學發(fā)展史上的一個里程碑。

1952年，Hershey等用放射性同位素標記

32P標記T2噬菌體的DNA（DNA中無S）

35S標記T2噬菌體的Pr（Pr中無P）噬菌體侵染大腸桿菌實驗煙草花葉病毒（TMV）感染實驗煙草花葉病毒（TMV）感染實驗Frankel-Conrat,Singer(1956)試驗二、核酸的化學結(jié)構(gòu)三、DNA的分子結(jié)構(gòu)◆1953年Watson和Crick提出DNA分子雙螺旋(doublehelix)模型，是分子遺傳學及以之為核心的分子生物學建立的標志。DNA的二級結(jié)構(gòu)(雙螺旋)兩條多核酸鏈間氫鍵相連A-T和C-G兩種核苷酸對分子鏈內(nèi)排列的位置和方向只有四種形式:A---TC---GA---TG---CC---GA---TG---CA---T

假設(shè)某一段DNA分子鏈有1000bp，則該段就可以有41000種不同的排列組合形式，反映出來的就是41000種不同性質(zhì)的基因.DNA分子的一種不同構(gòu)型現(xiàn)代顯微鏡下的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)我們今天認識的DNA結(jié)構(gòu)四、DNA的復制(一)DNA復制的一般特點

1、復制方式：半保留復制2、復制起點：大多數(shù)細菌及病毒只有一個復制起點，一個復制子；真核生物是多起點的，多個復制子

3、復制方向：一般為雙向復制

DNA半保留復制真核生物染色體多起點DNA復制電鏡照片

1、半保留復制，雙向復制2、有引物的引導，為RNA3、延伸方向為5'－3

'

。4、一條鏈一直從5'向3'方向延伸，稱前導鏈，連續(xù)合成；另一條先沿5

'－3

'合成岡崎片段，再由連接酶連起來鏈，后隨鏈，不連續(xù)合成

(二)原核生物DNA合成DNA解旋DNA合成之模型*在前導鏈上，DNA引物酶只在起始點合成一次引物RNA，DNA聚合酶III開始DNA的合成*在后隨鏈上，每個岡崎片段的合成都需要先合成一段引物RNA，然后DNA聚合酶III才能進行DNA的合成。

后隨鏈DNA的合成RNA病毒中RNA的自我復制

先以自己為模板（“＋”鏈）合成一條互補的單鏈（“－”鏈），然后這個“－”鏈從“＋”鏈模板釋放出來，它也以自己為模板復制出一條與自己互補的“＋”鏈，形成了一條新生的病毒RNA。

(三)真核生物DNA合成真核生物DNA的復制與原核生物的主要不同點：1、DNA的合成只是在S期進行，原核生物則在整個細胞生長過程中都進行DNA合成2、原核生物DNA的復制是單起點的，真核生物染色體的復制則為多起點的3、所需的RNA引物及后隨鏈上合成的“岡崎片段”的長度比原核生物要短4、有二種不同的DNA聚合酶分別控制前導鏈（δ）和后隨鏈（α）的合成；在原核生物中由聚合酶III同時控制二條鏈的合成5、染色體端體的復制：原核生物的染色體大多數(shù)為環(huán)狀

真核生物DNA復制五、RNA的轉(zhuǎn)錄及加工

(一)三種RNA分子

1、mRNA2、tRNA：最小的RNA，由70到90個核苷酸組成，具有稀有堿基的特點

3、rRNA：核糖體的主要成分。在大腸桿菌中：rRNA量占細胞總RNA量的75～85％tRNA占15％mRNA占3～5％tRNA的三維結(jié)構(gòu)========================================================================================================================================================================================================================================(二)RNA合成的一般特點1、所用原料為核苷三磷酸；在DNA合成時為脫氧核苷三磷酸2、只有一條DNA鏈被用作模板；DNA合成時，兩條鏈分別用作模板3、RNA鏈的合成不需要引物；DNA合成一定要引物的引導4、RNA鏈的合成與DNA鏈的合成同樣，也是從5′向3′端，由RNA聚合酶催化(三)原核生物RNA的合成*轉(zhuǎn)錄后形成一個RNA分子的一段DNA序列稱為一個轉(zhuǎn)錄單位

*一個轉(zhuǎn)錄單位可能剛好是一個基因，也可能含有多個基因

*RNA轉(zhuǎn)錄分三步：(1)RNA鏈的起始；(2)RNA鏈的延長；(3)RNA鏈的終止及新鏈的釋放

RNA的轉(zhuǎn)錄過程啟動子的結(jié)構(gòu)RNA鏈的延伸(四)真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄及加工真核生物與原核生物RNA的轉(zhuǎn)錄的不同點1、真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄是在細胞核內(nèi)進行，而蛋白質(zhì)的合成則是在細胞質(zhì)內(nèi)2、原核生物的一個mRNA分子通常含有多個基因；而少數(shù)較低等真核生物外，真核生物一個mRNA分子一般只編碼一個基因3、原核生物只有一種RNA聚合酶催化所有RNA的合成；真核生物中則有RNA聚合酶I、II、III，分別催化不同種類型RNA的合成4、原核生物RNA聚合酶直接起始轉(zhuǎn)錄合成RNA；真核生物三種RNA聚合酶都必須在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)助下才能進行RNA的轉(zhuǎn)錄

真核生物mRNA在轉(zhuǎn)錄后的加工：

1、5′端加上帽子(7－甲基鳥嘌呤核苷)在蛋白質(zhì)翻譯時識別起始位置及防止被RNA酶降解2、3′端加上尾巴(聚腺苷酸,polyA)對增加mRNA的穩(wěn)定性及從細胞核向細胞質(zhì)的運輸具有重要作用3、切除非編碼序列(內(nèi)含子)，將編碼序列(外顯子)連接起來，才能進行蛋白質(zhì)的翻譯

真核生物mRNA的加工六、遺傳密碼與蛋白質(zhì)的翻譯

(一)遺傳密碼（1）三聯(lián)體密碼（2）通用性（3）簡并現(xiàn)象（4）遺傳密碼間不能重復利用：除少數(shù)情況外，一個mRNA上每個堿基只屬于一個密碼子（5）起始密碼子：AUGGUG和終止密碼子:UAAUAGUGA(6)遺傳密碼間無逗號,即在翻譯過程中，遺傳密碼的譯讀是連續(xù)的核糖體的結(jié)構(gòu)原核生物70S核糖體哺乳動物原核生物80S核糖體

蛋白質(zhì)合成的起始蛋白質(zhì)合成鏈的延伸蛋白質(zhì)合成的終止多聚核糖體中心法則及其發(fā)展第四節(jié)基因工程簡介、基因工程概述、限制性內(nèi)切核酸酶、載體、基因的分離與鑒定、基因工程的應用果蠅轉(zhuǎn)基因

–半乳糖苷酶基因工程概述★遺傳工程一般可分為廣義和狹義的兩種。廣義的遺傳工程包括細胞工程、染色體工程、細胞器工程等。狹義的遺傳工程即是通常講的基因工程。本節(jié)只介紹基因工程。★基因工程中的DNA重組主要是指創(chuàng)造自然界中沒有的DNA分子的新組合。這種重組不同于經(jīng)典遺傳學中經(jīng)過遺傳交換產(chǎn)生的重組?；蚬こ淌遣捎梅肿由飳W、核酸生物化學以及微生物遺傳學的現(xiàn)代方法和手段建立起來的基因操作技術(shù)。１.概念：

基因工程：在分子水平上，采取工程建設(shè)方式

按照預先設(shè)計的藍圖

借助于實驗室技術(shù)將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一生物中去

使后者定向獲得新遺傳性狀的一門技術(shù)。

基因工程技術(shù)的建立，使實驗生物學領(lǐng)域產(chǎn)生巨大變革。2.發(fā)展：1971年史密斯（SmithH.O.）等人從細菌中分離出的一種限制性酶

酶切病毒DNA分子，標志著

DNA重組時代的開始。1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來

得到新的DNA分子。1973年科恩（CohenS.）等進一步將酶切DNA分子與質(zhì)粒

DNA連接起來，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.cloi

細胞中。1982年

美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準，用基因工程在細菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。1983年轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯獲得成功。1994年

延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄

商品生產(chǎn)。1997年

克隆羊“多莉”誕生（蘇格蘭科學家利用6歲成年母羊乳腺細胞）。1998年

美國夏威夷大學用一只實驗鼠的細胞克隆了3代共50只實驗鼠。2000年

美國用無性繁殖技術(shù)克隆猴子“泰特拉”，意味克隆人體已無技術(shù)障礙。2001年

美國宣布首次克隆成功處于早期階段的人體胚胎。2002年

12月法國研究者宣布克隆出第一個女嬰，但一直未獲得證實。2003年

5月意大利宣布克隆成功克隆馬“普羅梅泰亞”

（世界上首次由哺乳動物生下它自己的克隆體，即是母女、又是姐妹關(guān)系）

。2003年

12月美國德州農(nóng)業(yè)機械大學

宣布克隆成功白尾鹿。

2005年

12月韓國克隆狗斯努皮

Snuppy（中）。

1996年全世界轉(zhuǎn)基因植物種植面積為170萬ha，1997年為1100萬ha，1998年2780萬ha，1999年3990萬ha，2000年4420萬ha，2001年5260萬ha，2002年5000萬ha。1996199719981999

2000

2001

20022001年全世界轉(zhuǎn)基因作物占相應作物種植總面積的比較2001年種植面積>100萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物：大豆（3330萬ha，

占全世界轉(zhuǎn)基因作物的63%，

均為抗除草劑大豆）、玉米（980萬ha

，占19%）、棉花（680萬ha，占13%）、油菜（270萬ha

，占5%

）；其它還有水稻、

小麥、

花生、

向日葵、

亞麻、

甘藍、馬鈴薯，番茄、煙草、南瓜、木瓜、番木瓜、若干草坪草等多種轉(zhuǎn)基因作物已培育成功。主要分布在美國（3570萬ha）、阿根廷（1180萬ha

）、加拿大（320萬ha

）和中國（150萬ha

）等國。

2001年我國的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木已達22種，其中轉(zhuǎn)基因棉花、大豆、馬鈴薯、煙草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麥等進行了田間試驗，轉(zhuǎn)基因棉花已經(jīng)大規(guī)模商品化生產(chǎn)。3．內(nèi)容：

①．從細胞和組織中分離DNA；②．限制性內(nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；③．將酶切DNA分子與載體DNA連接

構(gòu)建能在宿主細胞內(nèi)自我復制的重組DNA分子；④．把重組DNA分子引入宿主受體細胞

復制；⑤．重組DNA隨宿主細胞的分裂而分配到子細胞

建立無性繁殖系（clone）或發(fā)育成個體；⑥．從細胞群體中選出所需要的無性繁殖系

并使外源基因在受體細胞中正常表達，翻譯成蛋白質(zhì)等基因產(chǎn)物、回收；或篩選出獲得定向性狀變異的個體。目的基因的獲得目的基因與載體的連接成重組DNA分子重組DNA分子導入受體細胞篩選重組克隆基因表達與產(chǎn)物分離基因工程的內(nèi)容重

組

DNA

技

術(shù)二限制性內(nèi)切核酸酶

★限制性內(nèi)切核酸酶或限制性酶(restrictionenzymes)是細菌中這些酶的功能是降解外來DNA分子的一類酶。以限制(restriction)或阻止病毒侵染?！锵拗菩悦笓?jù)其作用特點，可分為兩類。

※第Ⅰ類限制性酶每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性。

※第Ⅱ類限制性酶能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列。第Ⅱ類限制性酶識別的序列是對稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種從兩個方向閱讀而序列相同的序列稱為回紋對稱序列(palindrome)。二限制性內(nèi)切核酸酶

二限制性內(nèi)切核酸酶

三載體

一個DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA連接構(gòu)成重組DNA后，在載體DNA的運載下，才可以高效率地進入宿主細胞(hostcell)，并在其中復制、擴增、克隆出多個拷貝。可作為DNA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。作為載體DNA分子，需要具備以下四個條件：★具復制原點(ori)，在宿主細胞中不僅能獨立地自我復制，而且能帶動攜帶的外源DNA片段一起復制，★具有多克隆位點(multiplecloningsite,MCS)，而每一種酶的切點只有一個，用于克隆外源DNA片段。這些酶切位點不存在于復制原點或抗性選擇標記基因內(nèi)?！镏辽倬哂幸粋€選擇標記基因，使有或無載體的宿主細胞具有易鑒別的表型?！镆讖乃拗骷毎谢厥?。

四基因的分離與鑒定(一)從基因庫中分離基因(二)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因(三)人工合成基因

構(gòu)建基因庫基因庫(library)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因，首先要構(gòu)建基因庫。只有利用合乎要求的基因庫才有可能篩選出所需要的基因，很多分子遺傳學工作才能繼續(xù)深入下去。(一)從基因庫中分離基因

2.篩選基因庫

◆從基因庫中篩選、分離基因，可據(jù)對待選基因相關(guān)信息的了解程度，確定篩選方法和條件。◆大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫?！羧缇唠s交法(plaquehybridization)篩選λ噬菌體核基因庫。3.陽性克隆的分析與鑒定（1）限制性酶圖譜

◆構(gòu)建陽性克隆的限制性酶圖譜常是分析陽性克隆的第一步。根據(jù)同源性分析，可以了解陽性克隆片段的酶切位點及相對位置，用于進一步亞克隆(subcloning)或同已知的其它序列比較?！粢粋€15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建方法?！飳嶒炦^程：首先將陽性克隆DNA分裝在3個管中，分別用不同的酶及酶的組合酶切DNA。酶切的產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，染色，在紫外燈下就可見到DNA帶。各條帶的分子量大小可根據(jù)分子量標記估測。★結(jié)果分析●從凝膠電泳結(jié)果可見，用NotⅠ酶切產(chǎn)生二條帶，用SalⅠ酶切也產(chǎn)生二條帶。根據(jù)模式Ⅱ預計的三個片段長度與實驗結(jié)果一致，因此模式Ⅱ就是這個15kbDNA片段用上述兩種酶酶切后的限制性酶圖譜?！癫捎妙愃频姆椒?，將不同DNA用限制性酶消化，根據(jù)其產(chǎn)生的多型性，即限制性酶片段長度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，來分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標記進行基因組圖譜分析。（1）限制性酶圖譜

◆采用類似的方法，可將不同DNA用限制性酶消化，根據(jù)其產(chǎn)生的多型性，即限制性酶片段長度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，來分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標記進行基因組圖譜分析?！舸送?，上述經(jīng)NotⅠ或SalⅠ消化的片段，可以亞克隆到pUC18等質(zhì)粒上，進一步用于限制性圖譜分析或序列測定。（1）限制性酶圖譜（2）核酸分子雜交——Southern雜交(Southernblotting)（4）核酸序列分析◆測定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，還要用計算機軟件或生物學實驗進一步分析，才能最后得出結(jié)論。●同源性比較?？蓪y出的核酸序列同雜交的探針序列進行比較，或?qū)⒌玫降男蛄邪l(fā)到BLAST等DNAData庫的網(wǎng)址上比較，明確測得的序列與所有的已知序列之間的同源程度?！穹治龊怂嵝蛄械拈喿x框架。一個ORF就是一段能編碼一條多肽鏈，并通常具有翻譯起始信號以及一種終止信號的核苷酸序列?！魧τ谀切┩阎蛄袩o任何同源性的新序列，可能還要進行基因功能性研究。(二)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因◆聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)是體外快速擴增DNA的方法。

◆

PCR反應包括三個步驟：

●變性：在94-95℃使模板DNA的雙鏈變性成單鏈。

●復性：兩個引物分別與單鏈DNA互補復性，復性的溫度在50-60℃

●延伸：在引物的引導及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互補鏈

◆

這三個步驟稱為一個循環(huán)，PCR反應常有25-35個循環(huán)。◆PCR.EXE(三)人工合成基因

◆根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來，可以很快地人工合成基因?！衾?，首先化學合成多個含有80-100個核苷酸的寡核苷酸，每個寡核苷酸之間具有19-24個核苷酸的重疊序列(圖9－16)，再將各個寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補齊成為雙鏈，再用兩個PCR引物，經(jīng)PCR擴增出DNA片段。若將兩個DNA片段放在一起，經(jīng)SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)擴增出完整的基因片段。目的基因與載體連接(DNA分子重組)DNA分子重組目的基因?qū)胧荏w

目前，基因工程研究發(fā)展迅速，已取得一系列重大突破?；蚬こ碳夹g(shù)已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學、法學等領(lǐng)域，為人類創(chuàng)造了巨大的財富。五、基因工程的應用：具有生長激素的轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因的方法和技術(shù)

：㈠基因工程工業(yè)：

最早應用基因工程生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)的方法是在細菌中表達人的胰島素（1982）。

基因工程生產(chǎn)人的胰島素的方法如圖所示。

現(xiàn)已在細菌中生產(chǎn)10多種藥品，例如表皮生長因子、人生長激素因子、干擾素、乙型肝炎工程疫苗等。目前，酵母菌、植物懸浮細胞、植株和動物培養(yǎng)細胞均成功地應用于表達外源蛋白?；蚬こ虘么竽c桿菌生產(chǎn)人類生長激素㈡植物基因工程：

植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達的過程。許多植物基因已經(jīng)被分離、克隆。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法應用最多。對照轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲品種對照抗蟲稻轉(zhuǎn)基因花卉如：轉(zhuǎn)基因康乃馨、

矮牽牛等轉(zhuǎn)基因康乃馨（1999年開始在日本銷售）1.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)：

根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)應用最早（雙子葉植物單子葉植物）。

過程：將目的基因與啟動子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)構(gòu)成重組質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細胞

利用重組農(nóng)桿菌去感染植物細胞

使質(zhì)粒部分DNA包括目的基因，整合到植物染色體，實現(xiàn)

遺傳轉(zhuǎn)化。

利用抗草甘膦（glyphosate）

E.coli中分離克隆的EPSP合成酶基因

培育出高抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：2.基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)：

以高壓氣體為動力，高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒將目的基因直接導入植物細胞整合到染色體上。轉(zhuǎn)化的載體多以

pUC系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建通常具有細菌復制原點及抗性選擇標記、可在植物中表達的啟動子終止子及調(diào)控序列、植物抗性選擇標記（如除草劑、潮霉素等抗性）。

不同基因槍類型的共同特點：是用一種動力系統(tǒng)將金屬微粒和包被DNA導入受體細胞或組織進行轉(zhuǎn)化。

1.位于高壓氣體桶底部的爆破片；

2.載有重組DNA和金屬微粒的大載體；

3.阻擋板；

4.包裹有重組DNA

的金屬微粒；

5.被轟擊樣品。抽真空

1991年，國家啟動“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”研究。

單價抗蟲棉：Bt（蘇云金桿菌）殺蟲晶體蛋白基因

（CryIA）；雙價抗蟲棉：CryIA

CpTI（豇豆胰蛋白酶抑制劑

基因），更持久抗蟲。

轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲品種對照抗蟲方面主要采用的基因是蘇云金桿菌的毒蛋白基因（Bt），害蟲在轉(zhuǎn)基因植株上取食會出現(xiàn)厭食癥狀而死亡。

利用抗草甘膦（glyphosate）

E.coli中分離克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)已育成稻米胚乳中含有胡蘿卜素的“黃金稻”（Ye等，Science，2000，287（14））。我國至2001年，農(nóng)業(yè)部批準商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因食物有耐貯番茄、抗黃瓜花葉病番茄和甜椒3種作物。浙江農(nóng)科院原子能所陳錦清等利用基因工程改良的甘藍型油菜超油2號含油量達到52.8%（普通油菜含油量約35%），2001年通過專家鑒定。㈢轉(zhuǎn)基因動物:

轉(zhuǎn)基因動物：目的基因

載體

重組DNA

微量注射法將重組DNA導入受體合子細胞核

遺傳轉(zhuǎn)化。如：利用轉(zhuǎn)基因羊大量表達人類的抗胰蛋白酶。

可分泌人類生長因子Ⅸ的轉(zhuǎn)基因羊“Polly”

。（Wilmut等，Nature385,1997）受精卵細胞注射法

轉(zhuǎn)基因牛：受精卵注射法轉(zhuǎn)移有人類生長激素轉(zhuǎn)基因鼠同胞鼠對照人類生長激素轉(zhuǎn)基因豬轉(zhuǎn)基因發(fā)光魚（新加坡育成）㈣遺傳疾病診斷：

利用重組DNA技術(shù)進行遺傳疾病診斷，是直接從DNA即基因水平進行診斷

準確度高，速度快。如進行產(chǎn)前診斷，分析胎兒是否有遺傳疾病。1.RFLP法：

①.原理：限制性內(nèi)切酶能識別并切割特異核苷酸序列。某位點核苷酸序列發(fā)生突變

有可能導致缺失或產(chǎn)生新的限制性酶切位點。若突變只發(fā)生在同源染色體的一條上，另一條正常，限制性內(nèi)切酶酶切

DNA片段帶型可用于鑒別同源染色體的差異。酶切后產(chǎn)生的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態(tài)性

（restriction

fragment

lengthpolymorphisms，RFLP）。

RFLP差異具有共顯性特點。BamHI

酶切位點②.鐮刀性貧血病的診斷：

該病由

－球蛋白基因一個核苷酸突變（由GAG變成GTG）導致的，這個核苷酸改變也正好導致一個限制性酶切位點改變。雜合體經(jīng)酶切產(chǎn)生帶型差異，識別該位點。2.

等位基因特異寡核苷酸法（allele-specific

oligonucleotide,ASO）：

當已知突變基因的核苷酸序列時，可用人工合成的寡核苷酸進行PCR反應，將PCR產(chǎn)物用作點雜交分析，鑒定基因型。這種用于檢測單個核苷酸變異的方法，稱為ASO法。

許多遺傳疾病可用該法診斷。㈤基因治療：

特異基因?qū)氩⒄系接羞z傳缺陷患者基