第13章2-細胞增殖及其調控

CELLCYCLE第二節(jié)細胞周期的調控

細胞周期周而復始地進行著，這種周期性的重復過程受到嚴格地控制，使得不同的細胞周期事件在空間和時間上相互協(xié)調。（一）研究背景1.MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用

1960年，Masui和Markert研究爪蟾卵母細胞，提出了成熟卵母細胞中存在一種促成熟因子（maturationpromotingfactor，MPF）。Rao和Johnson(1970、1972、1974)以Hela細胞為材料，發(fā)現(xiàn)M期細胞具有某種促進間期細胞進行分裂的因子，即促細胞分裂因子(mitosis-promotingfactor，MPF)。3M期細胞(Hela)融合的間期細胞染色體發(fā)生凝縮，稱為早熟凝集染色體(prematurelycondensedchromosome，PCC)。G1期PCC為單線狀，因DNA未復制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復制。G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復制已完成。甚至不同類的M期細胞也可誘導PCC產(chǎn)生，說明M期細胞具有促進間期細胞進行分裂的因子，即成熟促進因子(maturationpromotingfactor，MPF)。染色體超前凝集（PCC）細胞融合與PCC(Prematurechromosomalcondense)2.cdc基因

LelandHartwell、PaulNurse分別以不同的酵母為實驗材料，發(fā)現(xiàn)了許多與細胞分裂有關的基因(celldivisioncyclegene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。

如何發(fā)現(xiàn)的？進一步研究發(fā)現(xiàn)：P34cdc2與P34cdc28是同源物，二者本身并不具有激酶活性，只有當其與有關蛋白結合后，其激酶活性才能夠表現(xiàn)出來。例如：P34cdc2必須與另一種蛋白P56cdc13結合后才具有激酶活性。

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3.cyclin

1983年TimothyHunt首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過程中兩種蛋白質的含量隨細胞周期劇烈振蕩，在每一輪間期開始合成，G2/M時達到高峰，M結束后突然消失，在下一個周期中又重復這一消長現(xiàn)象，故命名為周期素或周期蛋白(cyclin)。隨后cyclin很快被分離和克隆出來，證明其廣泛存在于從酵母到人類等各種真核生物中，而且在功能上存在互補性。74.MPF－P34cdc2－Cyclin？？

1988年M.J.Lohka純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由34KD和45KD兩種蛋白組成，二者結合可使多種蛋白質磷酸化。

1990PaulNurse進一步的實驗證明P34實際上是P34cdc2的同源物，P45是cyclinB的同源物，而且，對于P34cdc2的活性而言，cyclin是必需的。從而將細胞周期三個領域的研究聯(lián)系在一起。8MPF=P34cdc2(CDK1)+CyclinB（催化亞單位）（調節(jié)亞單位）MPF的生化成分：含有兩個亞單位MPF

=Cdc2+cyclin（催化亞單位+調節(jié)亞單位）11TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2001"fortheirdiscoveriesofkeyregulatorsofthecell

cycle"LelandHartwell

TimothyHunt

PaulNurse

12（二）細胞周期的檢驗點1989年，Hartwell通過構建酵母細胞突變模型證實了細胞周期檢驗點（checkpoint）的存在，并首次提出檢驗點的概念。細胞周期的運行，是在一系列檢驗點的嚴格檢控下進行的，它保證前一個事件完成之后，才啟動下一個事件，檢查點是細胞的錯誤監(jiān)測機制。13主要檢驗點包括：G1/S檢驗點：在酵母中稱start點，在哺乳動物中稱R點(restrictionpoint)，控制細胞由靜止狀態(tài)的G1進入DNA合成期，相關的事件包括：DNA是否損傷？細胞外環(huán)境是否適宜？細胞體積是否足夠大？

S期檢驗點：DNA復制是否完成？14G2/M檢驗點：是決定細胞一分為二的控制點，相關的事件包括：所有DNA都正確復制了嗎？DNA是否有損傷？細胞體積是否足夠大？中-后期檢驗點（紡錘體組裝檢驗點）：所有染色體都排列在紡錘體上了嗎？任何一個著絲點沒有正確連接到紡錘體上，都會抑制APC活性，引起細胞周期中斷。1517（三）細胞周期蛋白cyclin的種類繁多，目前從芽殖酵母、裂殖酵母和各類動物中分離出的周期蛋白有30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分別參與細胞周期中不同時相的調節(jié)。分為G1型、G1/S型S型和M型4類。18人類細胞周期蛋白線性結構示意圖實心方框代表“cyclinbox”，方框代表“destructionbox”圓形框代表PEST序列19

cyclinbox：各類周期蛋白均含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白盒(cyclinbox)，介導周期蛋白與CDK(cyclin–dependentkinase)結合。Cyclin也含有降解盒（destructionbox）或PEST（脯氨酸－谷氨酸－絲氨酸－蘇氨酸）序列，它可以通過定時降解或恒定地迅速周轉來調節(jié)這些蛋白質的水平，起著CDK的調節(jié)亞基的作用。20

G1期

細胞在生長因子的刺激下，G1期cyclinD表達，并與CDK4、CDK6結合，使下游的蛋白質如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉錄因子E2F，促進許多基因的轉錄。21CyclinD與CDK結合使Rb釋放結合的轉錄因子E2F23

G1/

S期

cyclinE與CDK2結合，促進細胞通過G1/S限制點而進入S期。向細胞內(nèi)注射CyclinE的抗體能使細胞停滯于G1期，說明細胞進入S期需要CyclinE的參與。

S期

將CyclinA的抗體注射到細胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能抑制細胞的DNA合成，推測CyclinA是DNA復制所必需的。24

G2/M期

cyclinA、cyclinB與CDK1結合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如將組蛋白H1磷酸化導致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細胞周期事件。25

M期

在分裂中期當MPF活性達到最高時，通過一種未知的途徑，激活后期促進因子APC(anaphasepromotingcomplex)，負責將泛素連接在cyclinB上，導致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個細胞周期。26哺乳動物細胞周期中各時相不同cyclin的作用27（四）CDK及其調控

CDK即細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin–dependentkinase,CDK)，控制著細胞周期各期之間的順序轉換。CDK是一組相關聯(lián)的Ser/Thr蛋白激酶。不同類型的CDK/cyclin復合體*包括D1-3，各亞型cyclinD在不同細胞中的表達量不同，但具有相同的功效。酵母中細胞周期的進程主要由單一的CDK（P34cdc2/cdc28）所控制。多細胞生物中，細胞周期各期之間的轉換需要不同的CDK。30脊椎動物的CDKCDK結合的相應cyclin作用的細胞周期CDK1CDK2

CDK3CDK4CDK5CDK6CDK7CyclinA,BCyclinACyclinD1,D2,D3CyclinE

CyclinD1,D2,D3P35*,CyclinD1,D2,D3CyclinD1CyclinH,P36*G2/M轉換；M早期S期G1期G1/S轉換G1期G0/G1轉換、G1期神經(jīng)纖維的磷酸化、G1期G0/G1轉換活化CDK*P35，P36的結構與細胞周期蛋白無相似性31

1．Cyclin的結合是CDK激活的第一步CDK活性的最初調節(jié)者是cyclin亞單位。Cyclin與相應的CDK結合后，引起CDK空間構象改變，暴露其催化亞基。各種細胞周期蛋白程序化的合成和降解保證各對應CDK適時的活化，維持細胞周期的正確時序。細胞周期各時相MPF、P34、P56的變化332．CDK的磷酸化與去磷酸化

以P34cdc2(CDK1)為例，如果對P34cdc2磷酸化作用位點不同，則對該酶的活性分別產(chǎn)生正向和負向的控制。完整的P34cdc2-cyclin復合物需要磷酸化才能被激活，驅動細胞進入有絲分裂。35

P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2-cyclin復合物的失活，Weel是催化Tyr15磷酸化的激酶，Myt1是Thr14磷酸化的激酶；催化Thr14及Tyr15脫磷酸化的蛋白磷酸酶為雙特異性磷酸酶Cdc25蛋白。36P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。CDKs活化激酶CAK（CDKsactivitingkinase）應答Thr161的磷酸化，這是另一種蛋白激酶CDK7-CyclinH復合物。當磷酸酶-1將此位點的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。373．CDK抑制劑的作用

除了磷酸化／去磷酸化可以調節(jié)MPF活性外，另有一類CDK抑制因子（CDCkinaseinhibitor,CKI）可與CDK結合抑制其活性。38（1）Ink4(Inhibitorofcdk4)：如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，專一地與CDK4、CDK6結合，阻止CDK和cyclinD的結合。使細胞周期不能從G1期的調控點進入到下一個時相。39（2）Cip/Kip：包括P21cip1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能與多種cyclin-CDK復合物包括cyclinE–CDK2、cyclinD–CDK6、cyclinD–CDK4結合，抑制cyclin-CDK復合物的蛋白激酶活性，使一些細胞增殖所需要的蛋白質磷酸化受阻，細胞停留在G1期。40

此外P21cip1還可與DNA聚合酶δ亞單位PCNA(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)相互作用，抑制DNA復制，但不影響DNA修復。41CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化

CDK1的調節(jié)與活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase

在中期當MPF活性達到最高時，通過一種未知的途徑，激活后期蛋白復合體-APC，將遍在蛋白連接在cyclinB上，導致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個細胞周期·APC介導選擇性降解的靶蛋白與Ubiquitin結合

(通過泛素依賴性途徑降解)·APC主要介導兩類蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin.前者維持姐妹染色單體粘連,抑制后期啟動；后者的降解意味著有絲分裂即將結束，即染色體開始去凝集，核膜重建。