酶聯(lián)免疫吸附測定

酶聯(lián)免疫吸附測定

（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）免疫學(xué)教研室用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，使微量的、不可見的反應(yīng)成為可見的或可測定的。CompanyLogo免疫熒光技術(shù)CompanyLogo用FITC-抗IgM單抗計數(shù)B細(xì)胞免疫熒光技術(shù)CompanyLogo課程內(nèi)容ELISA的原理ELISA的分類間接ELISA的具體操作ELISA在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用實例CompanyLogoELISA的原理

1.抗原抗體反應(yīng)的特異性2.抗原或抗體的固相化3.抗原或抗體的酶標(biāo)記ECompanyLogo間接ELISA實驗?zāi)康模簻y小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗體的效價實驗材料：包被抗原：小鼠血清待檢抗體/一抗：兔抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體/二抗：HRP-驢抗兔IgG聚苯乙烯酶標(biāo)板水浴箱

移液器槍頭包被液：pH9.6的碳酸鹽緩沖液

封閉液/

封：5%脫脂奶粉(ALB)稀釋液/?。簆H7.40.05M的PBS（磷酸鹽緩沖液）

洗液：PBST（PBS+0.1%吐溫20）

顯色液：OPD（鄰苯二胺）

終止液/終：2M硫酸鼠IgG(抗原)兔抗小鼠IgG(一抗)HRP-驢抗兔IgG(二抗)免疫Fc段CompanyLogo操作步驟包被：1：5000稀釋的正常小鼠血清，4℃過夜→→→洗滌：3次，1min/次加酶標(biāo)抗體：1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的驢抗兔IgG抗血清，37℃２0min洗滌：3次，1min/次封閉：5%脫脂奶粉，37℃20min加待檢抗體：倍比稀釋的兔抗鼠IgG抗血清，37℃30min加底物液顯色→洗滌：3次，1min/次→終止液終止顯色空白對照無顯色待測樣品顯色明顯EEEE底物液每孔加１００ul!CompanyLogo倍比稀釋法與加樣AB123456789101112

稀釋液

順序(每孔100ul)S稀釋液一抗試管S1一抗原液CompanyLogoAB

123456789101112

稀釋液

2-12號每孔１00uL稀釋液，１號孔加入100uL一抗，再加100uL一抗到２號孔中，混勻，從２號孔吸取100uL加到３號孔中，混勻，．．．．．１１號孔吸取１００uL，丟棄！CompanyLogoELISA的分類（一）直接法（二）間接法（三）雙抗體夾心法（四）競爭法CompanyLogo間接法的原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。其優(yōu)點在于只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法?？捎糜趥魅静〉脑\斷。（二）間接法（測抗體）酶標(biāo)二抗一抗AgwashBSAwashwashTMBCompanyLogo（三）雙抗體夾心法（測抗原）只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。包被Ab酶標(biāo)AbAgTMBwashwashwashCompanyLogo（四）競爭法（HBcAb

）

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體；如HBeAb，HBcAb；

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

washTMBHBcAg酶標(biāo)HBcAbwashHBcAbCompanyLogo病原微生物及其抗體檢測如:肝炎病毒,SARS等

臨床疾病診斷中的應(yīng)用蛋白質(zhì)測定:各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)記物

非肽類激素測定：T3、T4，性激素測定……ELISA在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用CompanyLogoELISA在其他相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用科研服務(wù)食品安全……環(huán)境衛(wèi)生CompanyLogoDH2+H2O2

D+2H2ODH2為供氫體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后氧化成為有色的產(chǎn)物。酶催化底物液顯色ECompanyLogo酶/E底物/DH2顯色反應(yīng)

測定波長nm

辣根過氧化物酶(HRP)鄰苯二胺(OPD)

四甲替聯(lián)苯胺(TMB)

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492450449

425

642

堿性磷酸酯酶(AP)

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶(GOD)

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶(β-Gal)甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

CompanyLogo結(jié)果的判定肉眼判定結(jié)果：于白色背景上直接肉眼觀察。顏色越深，反應(yīng)越強(qiáng)；陰性反應(yīng)為無色或極淺。根據(jù)顏色的深淺，以“＋”、“－”表示。測定A值：在酶標(biāo)儀上，根據(jù)不同底物設(shè)定波長（OPD底物為490nm，TMB底物為450nm），以空白孔調(diào)零后測各孔OD值。以高于陰性對照孔OD值2倍為陽性。CompanyLogo結(jié)果的判定空白對照無顯色，而樣品顯色明顯且逐漸變淺待檢樣品孔顯色明顯空白對照CompanyLogo注意事項對照的設(shè)定（陽性對照，陰性對照，空白對照）倍比稀釋時，要正確操作；加樣時從低濃度向高濃度方向進(jìn)行終止反應(yīng)的時間