探討有氧運動改善海馬組織氧化應激水平的機制,運動生理學論文

探討有氧運動改善海馬組織氧化應激水平的機制,運動生理學論文近年來，老年人學習記憶能力減退相關(guān)疾病的發(fā)生率逐年上升，已引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。Floyd等研究發(fā)現(xiàn)，活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)的增加與衰老的進程及老齡化經(jīng)過中認知功能的退化密切相關(guān)。大量研究結(jié)果已經(jīng)證實，長期適宜強度運動能夠降低氧化應激相關(guān)疾病的危險性，且能夠抵抗老齡化導致的認知功能減退，這一現(xiàn)象在人及動物模型中已經(jīng)得到廣泛驗證。盡管有氧運動改善腦組織氧化應激水平進而改善認知功能的現(xiàn)象不斷得到證實，但有氧運動改善腦組織氧化應激水平確實切機制仍然沒有完全說明。過氧化物酶體增殖活化受體輔助活化因子1(Peroxisomeproliferator－activatedreceptorgammacoactivator1－alpha，PGC－1)是ROS新陳代謝的重要調(diào)解因子，而AMP激活蛋白激酶(AMP－acti-vatedproteinkinase，AMPK)則是調(diào)解PGC－1磷酸化的一種蛋白激酶，其表示出變化可對PGC－1表示出產(chǎn)生重要影響。在肌肉組織內(nèi)，AMPK及PGC－1表示出的變化對改善肌肉組織氧化應激水平具有重要調(diào)控作用。但在腦組織內(nèi)，有氧運動能否通過改善以上蛋白表示出而到達了改善氧化應激水平的目的，當前尚未見到相關(guān)報道。為此，研究對8周有氧運動老年大鼠海馬ROS水平、抗氧化物酶活性(超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPx))、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(丙二醛，malondialdehyde，MDA)、PGC－1及AMPK表示出水平進行了檢測，旨在討論有氧運動改善海馬組織氧化應激水平的機制，進而為揭示有氧運動抵抗老齡人口認知功能減退的相關(guān)機制提供實驗根據(jù)和數(shù)據(jù)支持。1材料與方式方法1．1實驗動物及分組實驗選用鼠齡為24月的健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量為(34020)g，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由進食飲水，自然光照，動物房內(nèi)溫度(203)℃，相對濕度為40%～60%。動物隨機分為空白對照組(CG)、運動組(EG)，每組8只，共16只。1．2大鼠有氧運動方案運動組大鼠先進行一周的適應性跑臺訓練(隔天1次，共3次)，速度10m/min，每次15min。適應性訓練后，未見不良反響的大鼠于24h后進行正式實驗。大鼠有氧運動方案采用修改后的Bedford遞增負荷跑臺運動方案。運動組大鼠共進行8周有氧跑臺訓練，每周5次，訓練均布置在每周的周一至周五晚間進行，運動負荷如表1所示。1．3樣本的制備最后一次運動24h后，用2%戊巴比妥鈉(3mL/kg)腹腔麻醉大鼠，斷頭取腦，冰玻片上迅速剝離出兩側(cè)海馬，－80℃冰箱保存待測。1．4ROS、SOD、GPx及MDA含量的測定采用化學熒光法對大鼠海馬ROS含量進行測定。取大鼠海馬0．1g，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶20的比例參加勻漿介質(zhì)(100mmol/L磷酸緩沖液)，冰水浴條件下機械勻漿，1000g離心10min，取部分上清采用考馬斯亮藍法對其進行蛋白定量檢測(A045－2試劑盒，南京建成)。另取勻漿上清液參加熒光探針(E004，南京建成)，37℃孵育30min，對其熒光強度進行測定(激發(fā)波長500nm，發(fā)射波長525nm)，測定結(jié)果以熒光強度/毫克蛋白表示。大鼠海馬SOD、GPx及MDA的含量采用相應試劑盒進行檢測(南京建成)，操作經(jīng)過嚴格根據(jù)試劑盒講明書進行?！颈?】1．5PGC－1及AMPK的測定大鼠海馬PGC－1及AMPK的測定采用west-ernblot方式方法進行，實驗經(jīng)過如下:取適量海馬勻漿處理后參加裂解液(包含137mMNacl，20mMTris－HClpH8．0，2%NonidetP－40，10%甘油及蛋白酶抑制因子)，將其超聲處理30s后，4℃環(huán)境下15300g離心15min，收集上清，采用BCA蛋白定量方式方法測定總蛋白濃度，分裝，于－80℃保存待測。取20g蛋白進行SDS－PAGE凝膠電脈(8～12%，V/V)，PVDF膜轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉(室溫，2h)。參加經(jīng)過TBS－T緩沖液稀釋的一抗(PGC－1，1∶1000，貨號13067，SantaCruzBiotechnology，美國;AMPK，1∶2000，貨號2532，CellSignalingTechnolo-gy，美國)，4℃過夜后，將膜放入TBS－T緩沖液進行沖洗，參加HRP標記二抗，室溫孵育1h，TBS－T緩沖液中反復沖洗之后，與加強化學發(fā)光劑孵育。在暗室中使用X膠片曝光，顯影，定影后觀察結(jié)果。使用Quantityone(Bio－Rad)軟件對目的蛋白和內(nèi)參蛋白進行光密度分析，以actin蛋白為內(nèi)參。目的蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。1．6統(tǒng)計學處理所得數(shù)據(jù)均用平均數(shù)標準差(xs)表示，利用SPSS10．0對所有數(shù)據(jù)進行處理并進行獨立樣本T檢驗，P＜0．05表示差異顯著。2研究結(jié)果2．1不同組別大鼠海馬ROS含量的比擬如此圖1所示，8周有氧運動訓練使大鼠海馬ROS含量較對照組顯著降低(P＜0．05，相對濃度分別為0．690．03和0．390．02)，提示有氧運動訓練可顯著減少海馬活性氧自由基水平?！緢D1】2．2不同組別大鼠海馬SOD及GPx活性的比擬實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖2－A及圖2－B)，運動訓練組大鼠海馬SOD及GPx活性較對照組均顯著上升(P＜0．05)，運動組與對照組SOD活性分別為(88．077．46)U/mgprot及(105．0315．17)U/mgprot;GPx活性分別為(2．830．42)U/mgprot及(4．370．73)U/mgprot)?！緢D2】2．3不同組別大鼠海馬MDA含量的比擬實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖3)，對照組大鼠海馬MDA含量為(3．090．41)U/mgprot，而運動訓練組含量為(1．510．34)U/mgprot，兩組間呈現(xiàn)差異顯著(P＜0．05)，提示長期有氧運動訓練可顯著降低海馬脂質(zhì)過氧化損傷水平?！緢D3】2．4不同組別大鼠海馬PGC－1表示出的比擬如此圖4所示，對照組海馬PGC－1表示出水平為0．640．19，與對照組相比，運動組海馬PGC－1表示出顯著升高(1．180．29，P＜0．05)?！緢D4】2．5不同組別大鼠海馬AMPK表示出的比擬實驗結(jié)果顯示(見圖5)，運動組海馬AMPK含量為2．10．37，與對照組相比(1．640．29)顯著升高(P＜0．05)。提示有氧運動訓練可顯著增加海馬AMPK表示出水平。3分析與討論海馬是與認知功能高度相關(guān)的腦區(qū)之一，研究對8周有氧運動訓練后大鼠海馬氧化應激水平進行了觀察，發(fā)現(xiàn)運動組大鼠海馬ROS含量及反響脂質(zhì)過氧化水平的MDA含量顯著降低(P＜0．05，見圖1、圖3)，而反映腦組織抗氧化水平的SOD、GPx活性顯著升高(P＜0．05，見圖2)。已經(jīng)知道體內(nèi)ROS去除的第一道防線是由抗氧化劑的酶促作用組成的，首先在SOD的作用下，ROS轉(zhuǎn)化為過氧化氫，過氧化氫再在GPx和/或過氧化氫酶的作用下被去除，由于腦內(nèi)過氧化氫酶的含量非常低，因而，腦組織中過氧化氫的去除主要依靠GPx來完成。隨著年齡的增長，第一道防線的抗氧化能力逐步降低，又由于老齡化經(jīng)過中，海馬對氧化損傷的敏感性增加，因而，老齡化經(jīng)過中海馬極易遭到氧化損傷，只能通過降低神經(jīng)容量來維持氧化復原的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，神經(jīng)容量的減少影響到學習記憶的能力，繼而導致認知功能的損害。而長期有氧運動訓練后，隨著SOD、GPx活性的升高，其抗氧化能力得到加強，氧化應激相關(guān)疾病的危險性降低，繼而使老齡化導致的認知功能減退得以緩解，這一途徑可能是運動訓練預防老齡化經(jīng)過中認知功能減退的重要機制之一。以往研究證實，不同的運動強度對不同組織氧化復原狀態(tài)的調(diào)節(jié)幅度不同。Radak等研究發(fā)現(xiàn):一次力竭運動和重復力竭運動會增加肌肉和肝臟中ROS的含量和氧化損傷，而適宜強度的規(guī)律性運動則會降低大鼠腦內(nèi)氧化應激水平，這一結(jié)果提示，運動訓練經(jīng)過中訓練的強度和訓練量是關(guān)鍵，否則不僅不會起到有益作用，反而會適得其反，加重老齡化經(jīng)過中認知功能障礙等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的程度。【圖5】長期有氧運動訓練可改善大鼠海馬氧化應激水平，這一現(xiàn)象在以往研究中已經(jīng)有少量報道。本研究除進一步證實該經(jīng)過外，還對運動訓練改善其氧化應激水平的深層機制進行了初步探尋求索。PGC－1是神經(jīng)細胞氧化復原平衡的調(diào)節(jié)因子，是誘導SOD－1、SOD－2和GPx等抗氧化酶基因表示出的必要因素，PGC－1表示出的上調(diào)能夠緩解神經(jīng)元由于氧化應激介導的細胞死亡，在防止神經(jīng)變性經(jīng)過中發(fā)揮作用。因而，PGC－1被以為是調(diào)解ROS新陳代謝重要調(diào)解因子之一。除此之外，PGC－1還可作用于與調(diào)控線粒體電子傳遞活動有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，影響線粒體的功能，進而影響能量代謝。Koltai等研究結(jié)果顯示，運動訓練能夠提高老年大鼠肌肉PGC－1的蛋白表示出。Steiner等研究結(jié)果顯示，8周運動訓練可導致特定腦區(qū)PGC－1mRNA表示出的上調(diào)。然而，有關(guān)長期有氧運動對老年大鼠海馬PGC－1表示出影響的研究至今尚未見到相關(guān)報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長時間有氧運動能夠提高老年大鼠海馬中PGC－1蛋白表示出的水平，該途徑可能是導致海馬SOD、GPx活性上升，ROS、MDA含量下降，進而使海馬氧化應激水平得以改善的機制之一。AMPK作為調(diào)解PGC－1磷酸化的一種蛋白激酶，其表示出變化可對PGC－1表示出產(chǎn)生重要影響。Yu等研究發(fā)現(xiàn)，藥物刺激AMPK能夠促進視覺皮層神經(jīng)元PGC－1的轉(zhuǎn)錄激活。Jager等研究結(jié)果顯示，骨骼肌AMPK的激活可介導PGC－1的表示出。因而，討論長期有氧運動對大鼠海馬AMPK表示出的影響對于理解PGC－1及下游SOD、GPx活性變化具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，長時間有氧運動使大鼠海馬AMPK蛋白表示出增加。筆者揣測，運動對AMPK表示出變化的影響可能是通過鈣調(diào)節(jié)蛋白依靠性激酶(Calmodulin－dependentkinase，CaMKK)及氧化復原狀態(tài)變化介導的。已經(jīng)知道CaMKK是調(diào)節(jié)AMPK表示出變化的上游調(diào)節(jié)因子之一，Hescham等研究報道，運動可導致CaMKK的變化，繼而可能介導AMPK表示出的上調(diào)。除此之外，運動經(jīng)過中產(chǎn)生的ROS及運動造成的腦組織適度缺氧也會誘導CaMK