第三章 植物細(xì)胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)

第三章植物細(xì)胞工程的

基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)一、植物組織培養(yǎng)（PlantTissueCulture）：指通過無菌操作分離植物體的一部分，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。

植物組織培養(yǎng)是植物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)第一節(jié)、植物細(xì)胞工程基本原理狹義：愈傷組織培養(yǎng)廣義：植株、器官、細(xì)胞、組織等的離體培養(yǎng)。二、植物細(xì)胞工程研究的意義1、基礎(chǔ)理論研究

試驗(yàn)體系的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，廣泛用于細(xì)胞、組織的代謝生理及其它生化等方面的研究（如分化問題）。2、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用研究

無性繁殖系快速繁殖的生產(chǎn)、試管苗的商品化，遺傳育種，種質(zhì)保存，克服遠(yuǎn)緣雜交，種質(zhì)資源創(chuàng)新，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

組織培養(yǎng)三、植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)1902年，德國科學(xué)家Haberlandt提出細(xì)胞的全能性假說1943年，美國科學(xué)家White正式提出植物細(xì)胞具有全能性的學(xué)說。1958年Steward通過培養(yǎng)胡蘿卜根懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)出完整植株，證實(shí)植物細(xì)胞全能型理論基本概念植物細(xì)胞全能性（plantcelltotipotency）指植物體的任何一個(gè)細(xì)胞都攜帶有該植物的全部遺傳信息，細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后仍具有產(chǎn)生完整植株的潛在能力或特性。分化細(xì)胞如何實(shí)現(xiàn)全能性？1、一個(gè)已分化的細(xì)胞要實(shí)現(xiàn)全能性一般要經(jīng)歷兩個(gè)過程：脫分化和再分化2、實(shí)現(xiàn)全能性必須滿足的條件：具有較強(qiáng)全能性的細(xì)胞從植株組織抑制性影響下解脫出來，使其處于獨(dú)立發(fā)育的離體狀態(tài)賦予離體細(xì)胞一定的刺激，包括營養(yǎng)物質(zhì)、植物激素、光照、溫度、酸堿度等等。一種類型的分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變成另一種類型的分化細(xì)胞的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)分化細(xì)胞分化（differentiation）細(xì)胞分裂過程中，細(xì)胞后代在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程。脫分化（dedifferentiation）：在組織培養(yǎng)時(shí)，放在一定的培養(yǎng)基上后，外植體的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胚性細(xì)胞，從而獲得不斷分裂的能力。

即由已高度分化的、失去分裂能力成熟細(xì)胞回復(fù)到具有分裂能力的分生細(xì)胞組織或胚性細(xì)胞狀態(tài)的過程叫脫分化。

再分化（redifferentiation）：脫分化后的分生細(xì)胞（愈傷組織）在一定條件下，重新恢復(fù)細(xì)胞分化能力再轉(zhuǎn)變成具有一定結(jié)構(gòu)，執(zhí)行一定生理功能的細(xì)胞團(tuán)或組織胞，并進(jìn)一步發(fā)育成完整植株。外植體（explant）：進(jìn)行體外組織培養(yǎng)時(shí)被研究或被培養(yǎng)的那部分材料。愈傷組織（Callus）：原指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞，在組培養(yǎng)中則指人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)無序生長的，無組織結(jié)構(gòu)、松散的細(xì)胞團(tuán)。

是高度分化的細(xì)胞經(jīng)脫分化后，細(xì)胞分裂增殖形成的組織。即細(xì)胞脫分化的產(chǎn)物。草莓花藥愈傷組織草莓葉片愈傷組織波蘿愈傷組織煙草暗培養(yǎng)愈傷組織再生植株的發(fā)生（再分化）器官發(fā)生發(fā)生途徑體細(xì)胞胚發(fā)生1、器官發(fā)生植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。器官發(fā)生形成再生植株大體上有三種方式：

第一種方式是先芽后根

第二種方式為先根后芽

第三種方式是在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株草莓愈傷組織誘出不定芽寒蘭根誘導(dǎo)不定芽草莓愈傷組織誘出不定芽和根2、胚狀體發(fā)生離體培養(yǎng)組織形成類似于種子的胚的結(jié)構(gòu)，同時(shí)產(chǎn)生芽端和根端的結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。胚狀體（embryoid）的特點(diǎn)：1、不同于合子胚，因?yàn)樗皇莾尚约?xì)胞融合產(chǎn)生。2、不同于孤雌/雄胚，因?yàn)樗皇菬o融合生殖的產(chǎn)物。3、不同于器官發(fā)生方式形成的莖芽和根，因?yàn)樗?jīng)歷了與合子胚相似的發(fā)育過程且成熟的胚狀體是雙極性結(jié)構(gòu)植株再生成熟細(xì)胞再生植株胚狀體發(fā)生器官發(fā)生愈傷組織分生細(xì)胞脫分化分裂再分化離體條件下細(xì)胞脫分化和再分化分為三個(gè)階段：誘導(dǎo)期：外植體接受外界條件刺激，改變原有的代謝，距傷口較近的薄壁細(xì)胞略有增大，細(xì)胞質(zhì)增多等細(xì)胞恢復(fù)到分裂能力狀態(tài)。分裂期：被啟動(dòng)的細(xì)胞全面的進(jìn)行活躍分裂分化期：即形成期，出現(xiàn)組織分化第二節(jié)、植物組織培養(yǎng)的一般條件一、培養(yǎng)基基本組成無機(jī)鹽；碳源和能源；維生素；氨基酸和有機(jī)附加物生長調(diào)節(jié)劑（植物激素）瓊脂1、無機(jī)鹽類組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如植物激素、酶以及酶的活化劑，參與植物的代謝活動(dòng)；元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等生物電化學(xué)方面的作用；大量元素（濃度>

0.5mmol/l),N、P、K、Ca、Mg微量元素（濃度<

0.5mmol/l)FeMnCuZnMommol/l是國際通用單位；但也經(jīng)常有用mg/g表示這些元素以怎樣的方式添加呢2、碳源和能源糖類:既可作為C源，又可維持培養(yǎng)基的滲透壓。植物組織培養(yǎng)中常使用蔗糖2-5%

。3、維生素常參與酶的合成及蛋白質(zhì)、脂肪代謝等生命活動(dòng)。常用的維生素B族類：包括VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、Vpp(煙酸)、VH(生物素)、VB9（葉酸）、VB5（泛酸鈣）等。

肌醇：化學(xué)名稱環(huán)己六醇。肌醇本身并沒有促進(jìn)生長的作用，但它在糖類的相互轉(zhuǎn)化、維生素、激素的利用相應(yīng)具有重要的促進(jìn)作用，所以它能使培養(yǎng)物快速生長，對胚狀體和芽的形成有良好的影響。4.氨基酸和有機(jī)附加物氨基酸主要作為氮源提供，常用的有甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸等。有機(jī)添加物主要有：椰子汁、麥芽汁、香蕉泥、土豆泥、蘋果汁等。注意：有機(jī)添加物根據(jù)需要添加，并不是所有的都要添加。5、植物激素

生長素auxin

吲哚乙酸（IAA）。赤霉gibberellinGA細(xì)胞分裂素cytokininCTK

脫落酸abscisicacid，ABA乙烯ethylene;etheneETH

生長素類：在組培中用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。常用的有IAA(吲哆乙酸)、NAA(奈乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。溶于95%的酒精或0.1mol/LNaOH溶解，常用量0.05-5mg/L細(xì)胞分裂素類：促進(jìn)細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)芽的分化。

常用的有KT(激動(dòng)素)、6-BA(6-卞基腺嘌呤)、玉米素等。溶于0.5-1mol/LHCl溶解或稀薄的NaOH,常用量0.05-10mg/L植物組培常用激素及其作用

一般情況下生長素濃度約等于細(xì)胞分裂速濃度愈傷組織生長生長素濃度大于細(xì)胞分裂速濃度促進(jìn)生根生長素濃度小于細(xì)胞分裂速濃度促進(jìn)生芽6、瓊脂一種海藻多糖累物質(zhì)，并非一種必需成分，一般使用濃度0.7%~1%。作用：凝固培養(yǎng)基，支撐培養(yǎng)材料。其他附加物：Vc、活性炭、PVP、抗壞血酸等作用，防止愈傷組織褐化，活性炭吸收代謝的有毒物質(zhì)等。二、常用培養(yǎng)基類型MS和B5培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基是1962年Murashige和Skoog發(fā)明的。B5培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基成分組成培養(yǎng)基的配制市售粉末直接溶解或者如MS培養(yǎng)基，用儲(chǔ)備液稀釋后混合然后加入3％的蔗糖，加入瓊脂，溶解定容,調(diào)節(jié)PH約5.8,分裝入各瓶，牛皮紙封口，121℃，高壓滅菌約15分鐘。加熱易分解的激素等要無菌水配制，過慮除菌，然后與滅菌過的培養(yǎng)基混合。例如GA3、IAA、ABA、玉米素加熱易分解。思考：選擇培養(yǎng)基時(shí)激素的濃度怎樣確定？正交實(shí)驗(yàn)NAAumol/l

BAP(umol/l)00.52.551000.52.5510（三）、培養(yǎng)條件PH值一般5.5~6.0溫度，一般24℃～28℃光照，光強(qiáng)濕度一般80％1、培養(yǎng)基的物理性質(zhì)固體、液體培養(yǎng)的選擇；培養(yǎng)基中瓊脂的量很重要。2、光照包括光照時(shí)間，光質(zhì)，光強(qiáng)等，愈傷組織的形成雖然不需要光照提供能量，但光照對其是一種誘導(dǎo)效應(yīng)。3.溫度、濕度及氣體溫度過高或過低對器官發(fā)生的數(shù)量和質(zhì)量均有影響，一般24℃～28℃4、培養(yǎng)基的pH一般5.5~6.0。培養(yǎng)基的 pH可通過影響培養(yǎng)物的營養(yǎng)吸收、呼吸代謝、DNA合成，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞等直接或間接的影響愈傷組織的形成及器官再生。

第三節(jié)、植物組織培養(yǎng)的基本過程（一）培養(yǎng)基的選擇與配制（二）材料采集與消毒（三）制備外植體（四）接種（五）培養(yǎng)材料采集

組織培養(yǎng)所用的材料非常廣泛，可采取根、莖、葉、花、芽和種子的子葉，有時(shí)也利用花粉粒和花藥，其中根尖不易滅菌，一般很少采用。材料的消毒（1）先將材料用流水沖洗干凈，最后一遍用蒸餾水沖洗，再用無菌紗布或吸水紙將材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小塊。（2）在無菌壞境中將材料放入70％灑精中浸泡30－60秒。（3）再將材料移入漂白粉的飽和液或0.1％升汞水中消毒約10分鐘。（4）取出后用無菌水沖洗4-5次。常用的滅菌藥物、種類、濃度及效果外植體用消毒劑消毒后，為什么要用無菌水漂洗？有時(shí)候會(huì)在消毒溶液中加入1～2滴的表面活性物質(zhì)，例如吐溫80或吐溫20，為什么？

消毒劑主要是用來對外植體消毒的，使用后外植體表面會(huì)有殘留，若不用無菌水沖洗，會(huì)嚴(yán)重組織和細(xì)胞，影響外植體體外培養(yǎng)，另外，外植體已是消毒過的，若不用無菌水沖洗而用蒸餾水的話，會(huì)使得外植體再次染菌。

表面活性物質(zhì)可以是外植體表面濕潤，也可以使外植體與消毒液充分接觸，另外，表面活性劑可以除去外植體表面的脂溶性物質(zhì)，使得消毒劑更好發(fā)揮消毒作用。制備外植體

將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷等，在無菌的環(huán)境下，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，這就是外植體。在操作中嚴(yán)禁用手觸動(dòng)材料。

接種將經(jīng)過消毒，滅菌過的活的外植體，按照不同的要求移植到培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過程。接種過程要嚴(yán)格按照無菌操作，預(yù)防污染外植體的培養(yǎng)1、固體培養(yǎng)最常用的方式，一般使用凝固劑瓊脂（濃度0.7%~1%）2、液體培養(yǎng)分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)3、飼養(yǎng)培養(yǎng)指用處理過的無活性的或分裂很慢的、不具備分裂代謝能力的細(xì)胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細(xì)胞，使其分裂和生長。4、看護(hù)培養(yǎng)指一塊活躍的愈傷組織來看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，使其分裂和增值的一種培養(yǎng)方法。5、微室培養(yǎng)為單細(xì)胞活體連續(xù)觀察而建立的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可對單細(xì)胞的生長和分化，細(xì)胞分裂的全過程及胞質(zhì)環(huán)流的規(guī)律等進(jìn)行活體連續(xù)觀察。1、內(nèi)在因素外植體的遺傳性狀裸子植物、蕨類植