20100528 豬常見(jiàn)病原實(shí)驗(yàn)室檢查及分離培養(yǎng)方法

豬常見(jiàn)病原實(shí)驗(yàn)室檢查及分離培養(yǎng)方法疾病名稱傳染性萎縮性鼻炎細(xì)菌名稱I相支氣管敗血波氏桿菌（Bb）和多殺性巴氏桿菌（Pm）樣品種類鼻腔拭子采樣方法將豬保定，用酒精棉球?qū)⒈强字車尽Ｓ帽容^柔軟的棉頭拭子，輕輕捻動(dòng)插入鼻腔采取鼻汁，拭子深入鼻腔的深度相當(dāng)于鼻孔至眼角的長(zhǎng)度（約30cm）,把棉拭取出，放入無(wú)菌的PBS液中，盡快進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基改良麥康凱瓊脂（加1%葡萄糖，pH為7.2）、5%馬血瓊脂或蛋白胨瓊脂。分離支氣管敗血波氏桿菌，使用含血紅素咲喃唑酮的改良麥康凱瓊脂平板，于37°C培養(yǎng)48—72h；分離多殺性巴氏桿菌，使用含新霉素、潔霉素的馬丁瓊脂平板。接種時(shí)盡量將拭子上的分泌物濃厚涂抹于培養(yǎng)基上。菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)蛋白胨瓊脂上，呈灰白、透明、光滑、邊緣整齊、微隆。麥康凱瓊脂上，呈微紅色圍繞小紅圈，直徑1.0-1.5mm。Bb為球桿菌，兩極染色，G—，無(wú)芽抱，有莢膜，周身鞭毛。支氣管敗血波氏桿菌菌落不變紅，直徑約1—2cm，光滑、圓整、隆起、透明，略呈茶色；較大的菌落其中心較厚且凹陷，有的菌落在凹陷處有皺褶成茶褐色，對(duì)光觀察呈淺藍(lán)色。分離多殺性巴氏桿菌的馬丁瓊脂平板，于37C培養(yǎng)18—24h。多殺性巴氏桿菌菌落直徑約1—2cm,圓整、光滑、隆起、透明，菌落單個(gè)或呈粘液狀融合成菌苔。豬巴氏桿菌病細(xì)菌名稱多殺性巴氏桿菌（Pm）樣品種類生前采取耳靜脈血；死后取心血、頸部水腫液、胸水、肝、脾、淋巴結(jié)等。采樣方法培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂斜面、含0.1%裂解健康動(dòng)物紅細(xì)胞的全血、4壬健康動(dòng)物血清的改良馬丁瓊脂平皿。置36—37C培養(yǎng)18—24ho菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)取病料制成涂片，自然干燥后，用甲醇固定2—3min，以堿性美藍(lán)液染色1—2min，或瑞氏染液染色5min，經(jīng)水洗，干燥后鏡檢?？砂l(fā)現(xiàn)兩極濃染的桿菌。改良馬丁瓊脂斜面上生長(zhǎng)純粹的培養(yǎng)物，顯微藍(lán)色菌苔或菌落。在含0.1%裂解健康動(dòng)物紅細(xì)胞的全血、4%健康動(dòng)物血清的改良馬丁瓊脂平皿上的單個(gè)菌落，肉眼觀察光滑圓整，直徑2—3mm，半透明，呈微藍(lán)色。備注對(duì)慢性病例很難分離得到大量典型的巴氏桿菌，可采用動(dòng)物接種的方法再?gòu)钠涓顾透闻K中分離細(xì)菌，這樣可增加此菌的分離機(jī)會(huì)。豬大腸桿菌病細(xì)菌名稱大腸桿菌樣品種類發(fā)病仔豬或新鮮尸體小腸前部?jī)?nèi)容物。為避免雜菌污染，最好無(wú)菌采取腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)器官做病原分離。采樣方法培養(yǎng)基麥康凱瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37C培養(yǎng)24h。菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成直徑允2mm的圓形、光滑、隆起、濕潤(rùn)、半透明淡灰色的菌落。在麥康凱瓊脂上菌落為紅色。

可疑菌落革蘭氏染色，鏡檢。大腸桿菌為G—、兩端鈍圓、無(wú)芽抱和莢膜、中等大小的桿菌。豬痢疾細(xì)菌名稱豬痢疾密螺旋體樣品種類采樣方法采取病豬急性期帶血的新鮮糞便、結(jié)腸粘膜的刮取物或腸內(nèi)容物。培養(yǎng)基胰酶消化酪蛋白豆胨血液瓊脂或胰酶消化酪蛋白豆胨湯培養(yǎng)菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)將病料直接涂片或用生理鹽水5倍稀釋，靜置30min,取上層液體涂片，自然干燥，火焰固定。用草酸銨結(jié)晶紫染色、鏡檢，高倍鏡下豬痢疾密螺旋體呈波浪卷曲、兩端尖銳，而且數(shù)量較多，每個(gè)視野3—5條以上。革蘭氏染色陰性，多呈4?6個(gè)疏螺彎曲，兩端尖銳，形如雙雁翼狀。菌落在血液培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯的B型溶血。備注注意與健康豬大腸中存在的小螺旋體或類螺旋體相區(qū)別，后者較小，只有一個(gè)螺旋，兩端鈍圓。直接鏡檢法對(duì)急性后期、慢性或用藥后的病例，檢出率低。鏈球菌病細(xì)菌名稱鏈球菌樣品種類敗血性鏈球菌病的病豬，無(wú)菌采取心、脾、肝、腎和肺等。淋巴結(jié)膿腫型病豬可用無(wú)菌注射器吸取未破潰淋巴結(jié)膿腫內(nèi)的膿汁。腦膜炎型病豬以無(wú)菌操作采取腦脊髓液及少量腦組織。采樣方法培養(yǎng)基菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)將采到的病料或膿汁制成涂片，用堿性美藍(lán)染色或革蘭氏染色法染色后鏡檢。如見(jiàn)到多數(shù)散在的或成雙排列的短鏈圓形或橢圓形球菌，無(wú)芽抱，有時(shí)可見(jiàn)到帶莢膜的革蘭氏陽(yáng)性球菌。成對(duì)排列的往往占多數(shù)。取病豬肝、腎、脾、腦或關(guān)節(jié)囊液（關(guān)節(jié)炎型），接種于腦心湯液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h。涂片，革蘭氏染色鏡檢。豬胸膜肺炎細(xì)菌名稱胸膜肺炎放線桿菌樣品種類采樣方法用棉拭子伸入病豬鼻腔采集分泌物，病死豬采集具有典型病變的肺氣管、肺門淋巴結(jié)、鼻腔分泌物。最急性感染死亡的小豬，還可取脾、肝病料。取組織0.5—lg剪碎，加入1mlPBS，勻漿。鼻拭子在1mlPBS中反復(fù)擠壓，將擠下的液體和組織勻漿1000rpm離心5min，棄沉淀；上清液10000rpm離心5min，棄上清液，沉淀用PBS懸起。培養(yǎng)基將上述病料直接接種到血瓊脂平板，再用雞表皮葡萄球菌做交叉劃線，于37C含5%—10%C02中培養(yǎng)。繼代用巧克力瓊脂和PPLO瓊脂。菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)血瓊脂平板培養(yǎng)24—48h，胸膜肺炎放線桿菌為露珠樣的小菌落，直徑1—2mm。多數(shù)菌株產(chǎn)生0溶血帶，靠近雞表皮葡萄球菌菌苔的菌落較大。革蘭氏染色為G—小桿菌，兩極著色。繼代培養(yǎng)中呈明顯形態(tài)。幼齡培養(yǎng)物中偶成絲狀。豬副傷寒細(xì)菌名稱豬沙門氏菌樣品種類采樣方法最好將死后12h內(nèi)的豬整體送檢?；驘o(wú)菌采取心血、肝、脾、淋巴結(jié)等，放置于30%甘油鹽水中送檢。培養(yǎng)基取病死豬的內(nèi)臟，接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)24h。

菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)取病豬的糞、尿、心血、肝、脾、腎組織、腸粘膜淋巴結(jié)、流產(chǎn)胎兒的胃內(nèi)容物，流產(chǎn)病畜的子宮分泌物等觸片或涂片，自然干燥，革蘭氏染色，鏡檢，呈兩端鈍圓或卵圓形，不運(yùn)動(dòng)、不形成芽抱和莢膜的革蘭氏陰性小桿菌。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)出邊緣整齊、濕潤(rùn)、圓形、無(wú)色半透明的小菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出無(wú)色半透明、圓形、邊緣整齊、濕潤(rùn)隆起的菌落。附紅細(xì)胞體病細(xì)菌名稱附紅細(xì)胞體樣品種類采樣方法無(wú)菌米取發(fā)燒病豬耳尖新鮮血一滴，加等量生理鹽水混勻，加蓋玻片，油鏡暗視野下觀察。培養(yǎng)基菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)紅細(xì)胞表面和血漿中有形態(tài)多樣的閃光附紅體，呈球形、橢圓狀或桿狀；少數(shù)附紅細(xì)胞體還會(huì)不斷變形和運(yùn)動(dòng)。無(wú)菌采取耳靜脈血液涂片，自然干燥。瑞氏染色鏡檢?？梢?jiàn)多種形態(tài)的紫藍(lán)色附紅細(xì)胞體，多數(shù)紅細(xì)胞變形，呈不規(guī)則星芒狀、鋸齒狀；變形紅細(xì)胞比例超過(guò)60%。弓形體病細(xì)菌名稱龔地弓形體樣品種類采樣方法培養(yǎng)基菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)無(wú)菌米取病死豬肝臟涂片，革蘭氏染色鏡檢。可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)存留數(shù)個(gè)卵圓形蟲(chóng)體，胞漿呈紫紅色，接近鈍圓端有一空泡。無(wú)菌采取病死豬的肺臟和腹腔滲出液作涂片，姬姆薩氏染色鏡檢?？梢?jiàn)新月形或橘瓣形蟲(chóng)體，一端稍尖，另一端鈍圓；胞頭呈淺藍(lán)色，核呈深藍(lán)紫色，偏于鈍圓一端。豬丹毒細(xì)菌名稱丹毒桿菌樣品種類采樣方法采取病豬的耳靜脈血或疹塊邊緣皮膚血，病豬死后取心血、腎、脾、肝、淋巴結(jié)、心瓣膜病灶制成觸片或抹片，革蘭氏染色。培養(yǎng)基血液瓊脂平板、血清葡萄糖肉湯。菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)鏡檢發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽(yáng)性，纖細(xì)的桿菌散布于組織間隙，在平板上或肉湯內(nèi)是針尖大的小菌洛。陳舊的培養(yǎng)物可出現(xiàn)革蘭氏陰性。在血涂片上，可見(jiàn)到散在紅細(xì)胞之間的菌體，有的出現(xiàn)叢集，還能看到被白細(xì)胞吞噬的現(xiàn)象。在臟器的抹片中，菌體常單獨(dú)、成對(duì)或叢狀排列。在瓣膜增生的纖維組織和關(guān)節(jié)液涂片中，見(jiàn)到的紅斑丹毒絲菌呈長(zhǎng)絲狀，構(gòu)成絲狀菌團(tuán)。本菌所表現(xiàn)的絲狀形態(tài)與霉菌不同，不分支。豬氣喘病細(xì)菌名稱豬肺炎支原體樣品種類采樣方法無(wú)菌米取病死豬的肺臟進(jìn)行抹片或涂片，革蘭氏染色。含5%?10%二氧化碳的條件下培養(yǎng)6~7天

培養(yǎng)基菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)鏡檢為多形性，球狀、環(huán)狀、桿狀、點(diǎn)狀、兩極狀，革蘭氏染色陰性，不易染色時(shí)可用姬姆薩染色。菌落產(chǎn)生稍為凹陷的中心，呈油煎蛋狀。仔豬紅痢細(xì)菌名稱C型產(chǎn)氣莢膜梭菌樣品種類采樣方法取病變空腸涂片革蘭氏染色培養(yǎng)基采集的腸內(nèi)容物放在冰瓶中，盡快送檢?？稍谂囵B(yǎng)基中加入新霉素或卡那霉素o.l—0.2mg/ml以抑制雜菌，或?qū)⒛c內(nèi)容物先加熱80°C，維持15—20min以殺死一些無(wú)芽抱菌，或用液體培養(yǎng)基每4h傳代一次后再分離。分離本菌可用肉肝湯液體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂和含葡萄糖的鮮血瓊脂培養(yǎng)基。菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)腸粘膜觸片，用革蘭氏染色，鏡檢見(jiàn)有數(shù)量眾多的G+大桿菌。多呈單在，少數(shù)兩兩相連，菌端整齊。在觸片或純培養(yǎng)物涂片，不易見(jiàn)到或僅見(jiàn)為數(shù)不多的芽抱。芽抱橢圓，位于菌體中心或偏端。接種含抗生素的鮮血瓊脂培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)1824h,可形成凸起半透明、灰白、表面光滑、邊緣整齊、1—3mm大小的圓形菌洛，菌洛周圍有溶血環(huán)。再長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，菌洛直徑增大，中心凸起，可看到自中心輻射出幾條放射狀條紋。在含葡萄糖的鮮血瓊脂表面厭氧培養(yǎng)的菌落，在25C以上與空氣接觸時(shí)，菌落附近紅細(xì)胞變成綠色。革蘭氏陽(yáng)性、有莢膜、不運(yùn)動(dòng)，芽抱呈卵圓形、位于菌體中央或近端。副豬嗜血桿菌病細(xì)菌名稱副豬嗜血桿菌樣品種類采樣方法各種滲出物、腹膜、心包膜、胸膜、關(guān)節(jié)積液。革蘭氏染色培養(yǎng)基菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)革蘭氏陰性短小桿菌，多形性，不溶血。在表皮葡萄球菌周圍呈衛(wèi)星樣生長(zhǎng)。壞死桿菌病細(xì)菌名稱厭氧G—壞死梭桿菌樣品種類采樣方法用充滿CO2并套有針頭的滅菌注射器刺入病變組織邊緣，抽取炎性滲出物，再用針頭插入滅菌橡膠塊內(nèi)（插入時(shí)避免空氣進(jìn)入）；或用棉拭子蘸取病變深入的材料，迅速插入含硫乙醇酸鈉半固體瓊脂管出。培養(yǎng)基菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)取病、健交界處組織制成涂片，用酒精與乙醚等量混合液固定，再用堿性復(fù)紅美藍(lán)染色（抹片經(jīng)火焰固定后，滴加石炭酸復(fù)紅液末抹片上，加熱至產(chǎn)生蒸汽，經(jīng)2—3min，水洗；以5%醋酸脫色，至淡紅色為止，水洗；以堿性美藍(lán)復(fù)染0.5min，水洗；吸干或烘干，鏡檢，菌體呈藍(lán)色，芽抱呈紅色），本菌呈長(zhǎng)線狀、短桿狀或球桿狀。豬傳染性胃腸炎病原名稱傳染性胃腸炎病毒樣品種類采樣方法采病仔豬空腸一段置滅菌的平皿中，刮取腸內(nèi)容物及空腸粘膜，用含有

1000U/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素的PBS液做5倍稀釋制成懸液，一70°C凍融一次，4°C條件下3000rpm離心30min,取上清液，經(jīng)0.22um微孔濾膜過(guò)濾，分裝，一70C保存。用于細(xì)胞培養(yǎng)接種。仔豬腹瀉糞便標(biāo)本用PBS（pH7.4）稀釋成20%懸液，5000rpm離心lOmin，取上清置一20C凍存，用于RT-PCR檢測(cè)。如果是組織樣品，稱取lg，用PBS（pH7.4）反復(fù)洗滌3次，剪碎，加入1mlPBS（pH7.4）研磨并收集混合液，將混合液反復(fù)凍融3次，lOOOOrpm離心lOmin，重復(fù)2次，取上清液置一20C凍存，用于RT-PCR檢測(cè)。流行性腹瀉病原名稱流行性腹瀉病毒樣品種類采樣方法采病仔豬空腸一段置滅菌的平皿中，刮取腸內(nèi)容物及空腸粘膜，用含有1000U/ml青霉素和100Oug/ml鏈霉素的PBS液做5倍稀釋制成懸液，4C條件下3000rpm離心30min，取上清液，經(jīng)0.22um微孔濾膜過(guò)濾，用于細(xì)胞培養(yǎng)接種。圓環(huán)病毒病病原名稱圓環(huán)病毒樣品種類采樣方法取病料（肺或和淋巴結(jié)），研磨粉碎（與PBS1：5），-20C反復(fù)凍融3次，lOOOOrpm離心15min，上清液用氯仿抽提3次，然后用滅菌的孔徑為0.22um微孔濾膜過(guò)濾，分裝，一7OC保存。用于接種細(xì)胞。蘭耳病病原名稱PRRS病毒樣品種類采樣方法采集病豬、疑病豬、新鮮死胎或活產(chǎn)胎兒組織的病料，哺乳仔豬的肺、脾、腦、扁桃體、支氣管淋巴結(jié)、血液和胸腔液。木乃伊胎兒和組織自溶胎兒不宜進(jìn)行病毒分離。用含抗生素的維持液（含2%胎牛血清的ME