基因表達(dá)載體構(gòu)建及棉花菌轉(zhuǎn)化和沉默抑制功能初步研究

分類(lèi)號(hào) 密級(jí)UDCOTU表達(dá)載體的構(gòu)建及棉花黃萎菌轉(zhuǎn)化和沉默抑制功能初步研究答辯日期 答辯 論文評(píng)閱 廖乾答辯成員陳集雙廖乾國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng) )資法，進(jìn)而建立真菌ATMT法的侵染性克隆體系，對(duì)研究棉花、棉花黃萎菌以及棉花黃萎菌三者之間的互作關(guān)系，以及對(duì)真菌及其功能研究具有重要意義。本文本研究首先以植物表達(dá)載體PH7WG2D為基本骨架，通過(guò)PCR技術(shù)將VdCV1的OTU序列VcR4進(jìn)行改造，獲得含35S+VcR4+Ribozyme+Nos序列的attBPCRGatewayBP反應(yīng)構(gòu)建入門(mén)載體，入門(mén)載體與雙元表達(dá)載體pH7WG2D通過(guò)LR反應(yīng)構(gòu)建雙元表達(dá)載體PHVcR4，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和分析PK7WG2D為基本骨架，通過(guò)同樣的方法改T采用ATMT法轉(zhuǎn)化棉花黃萎菌。結(jié)果顯示，PHVcR4質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌獲得了具有未能整合到棉花黃萎菌組中，綠色熒光屬于GFP瞬時(shí)表達(dá)，或者可能是表達(dá)質(zhì)粒中的目的片段整合進(jìn)了棉花黃萎菌組，但啟動(dòng)子未啟動(dòng)潮霉素轉(zhuǎn)錄。PKHyg質(zhì)?？赡芘c載體PK7WG2D不適合作為真菌轉(zhuǎn)化載體有關(guān)。pBHt1質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌未能篩選到具有抗性的轉(zhuǎn)化子，可能與農(nóng)桿菌菌株為C58C1有關(guān)。黃萎菌的轉(zhuǎn)化有待進(jìn)一采用瞬時(shí)表達(dá)法，利用構(gòu)建的OTU重組載體PHVcR4以及對(duì)照載體pHCm，初步探討了OTU對(duì)轉(zhuǎn)GFP本氏煙16C的沉默系統(tǒng)的抑制作用研究發(fā)現(xiàn)OTU不是植物的沉默抑制子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)帶有GFP的Gateway雙元表達(dá)載體可用于基（TMTCottonVerticillumwiltdiseaseisoneofthemostdevastatingplantdiseasetocotton.EstablishmentofhighefficientV.dahliaegenetictransformationsystem,especiallyanAgrobacteriummediatedgenetictransformationsystem,isguidingsignificantfortheinteractionof-V.dahliae-Cottonandfunctionalysisofesoffungi.SincetheexactfunctionofVdCV1genehasnotbeenreportedyet,wehavedonepreliminaryBasedonthebackboneplantexpressionvectorPH7WG2D,theCaMV35SpromoterandtheRibozyme+Nos-terminatorwereligatedtotheflankofVcR4sequenceofOTUgene.respectively.ThentheattBPCRproductwasclonedintotheentryvectorbyBPreaction.ThebinaryexpressionvectorPHVcR4wasreconstructedbyanotherbinaryexpressionvectorpH7WG2DandtheentryvectorthroughLRreaction.The binantplasmidwassuccessfullyconstructedandconfirmedbyrestrictionendonucleasedigestionandsequencing.TheexpressionvectorPKHygwasconstructedinthesameway.Thehygromycin geneunderthecontroloftheAspergillusnidulanstrpCpromoterandNosterminatorwasinsertedintotheplantexpressionvectorPK7WG2D.ByexposingtheV.dahliae0-21toalowconcentrationofcycloheximideduringhyphaltipisolation,weisolatedthreestrainswhichhadnormalmycelialgrowth.TheRT-PCRresultindicatedthatthedsRNAwascompleyeliminated.InordertoevaluatewhetherAgrobacteriumtumefaciensmediatedtransformationmethodcanbeappliedforVerticilliumdahliaetransformation,theA.tumefaciensstrainGV3101andC58C1wereusedforthetransformationstrains.PHVcR4,PKHygandpBHt1wereusedastransformationvectors.Theresultsshowedthatoutgrowingsporesandhyphaehavinggreenfluorescencewereobservedinthetransformations,butwefinallyfailedtoobtaintransformantsresistanttoHygromycin.ThepresumablereasonmaybethatthefragmentinexpressionplasmidwasfailedtointegrateintothecottonVerticilliumdahliaegenome,andthegreenfluorescencewastheresultofatransientexpression.Ontheotherhand,thefragmentwassuccessfullyintegratedintothecottonVerticilliumdahliaegenome,butthepromotormaynotturnonhygromycingenetranscription.TransformationwithPKHygwasunsuccessful.Neithergreenfluorescencewasobservedintransformants,northetransformantscouldgrowontheculturalmediumwithHygromycin.ThepossiblereasonwasthatPK7WG2DwasnotsuitableforVerticilliumdahliaetransformation.TransformationwithpBHt1wasunsuccessfulbecauseofnotadoptionofAGL-1astransformationstrain.Insummary,transformationofVerticilliumdahliaebyATMTneedfurtherresearchandimprovement.Inthisstudy,wecarryoutapreliminarystudyontheinfluenceofOTUgeneonlocalgenesilencingbytheconstructed binantvectorPHVcR4andthecontrolvectorpHCminfiltratingonGFPtransgenticN.benthamianaplant(line16c).ThesestudiesindicatethatOTUgeneisnotaplantsilencingsuppressor,andtheGatewaybinaryexpressionvectorscontainingGFPgeneareavailableforthestudyofgeneticsilencingsuppression. 第一章文獻(xiàn)綜 棉花黃萎病菌及棉花黃萎菌研究概 棉花黃萎病菌簡(jiǎn) 真菌及棉花黃萎菌..........................................................................................OTU研究的概 真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究進(jìn) 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研 PEG-CaCl2介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化真菌的研 槍法轉(zhuǎn)化真菌的研 限制性?xún)?nèi)切酶介導(dǎo)真菌轉(zhuǎn)化的研 真菌遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的研究進(jìn) 抗藥性標(biāo) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo) 沉默和沉默抑制子研究概 5.1.沉 5.2.沉默抑制 研究目的意義和研究?jī)?nèi) 研究目 研究?jī)?nèi) 第二章OTUGateway雙元表達(dá)質(zhì)粒構(gòu) 材料與方 酶與試 雙元表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建元 雙元表達(dá)載體構(gòu)建方 attBPCR產(chǎn)物內(nèi)各元件的構(gòu) PCR產(chǎn)物純 attBPCR產(chǎn)物構(gòu) 入門(mén)載體構(gòu) 堿法提取質(zhì) 重組質(zhì)粒酶切鑒 序列測(cè) LR反應(yīng)構(gòu)建雙元表達(dá)載 雙元表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒 質(zhì)粒PCR鑒 序列測(cè) 結(jié)果與分 attBPCR產(chǎn)物構(gòu)建結(jié) 入門(mén)載體構(gòu)建結(jié) 結(jié) LR構(gòu)建雙元表達(dá)載體結(jié) 小結(jié)與討 第三章含trpC啟動(dòng)子和潮霉素的Gateway雙元表達(dá)載體的構(gòu) 材料與方 酶與試 雙元表達(dá)載體構(gòu)建元 雙元表達(dá)載體構(gòu)建方 attBPCR產(chǎn)物內(nèi)各元件的構(gòu) PCR產(chǎn)物純 attBPCR產(chǎn)物構(gòu) 入門(mén)載體構(gòu) 堿法提取質(zhì) 重組質(zhì)粒酶切鑒 序列測(cè) LR反應(yīng)構(gòu)建雙元表達(dá)載 質(zhì)粒PCR鑒 序列測(cè) 結(jié)果與分 attBPCR構(gòu)建結(jié) 入門(mén)載體構(gòu)建結(jié) 結(jié) LR構(gòu)建雙元表達(dá)載體結(jié) 小結(jié)與討 第四章不同表達(dá)質(zhì)粒ATMT法轉(zhuǎn)化棉花黃萎菌的比較分 材料與方 試劑與質(zhì) 菌種脫毒培 脫毒菌株的鑒 黃萎菌總RNA提 RT-PCR檢 農(nóng)桿菌感受態(tài)的....................................................................................................雙元表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿 質(zhì)粒酶切鑒 抗生素濃度篩 ATMT法轉(zhuǎn)化棉花黃萎 結(jié)果與分 菌株0-21脫毒結(jié) 潮霉素濃度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果分 農(nóng)桿菌質(zhì)粒酶切鑒 ATMT法轉(zhuǎn)化棉花黃萎菌結(jié)果分 小結(jié)與討 第五章OTU蛋白沉默抑制功能研 材料與方 酶與試 PHCm的構(gòu) 農(nóng)桿菌感受態(tài)的....................................................................................................雙元表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿 質(zhì)粒PCR鑒 農(nóng)桿菌浸 結(jié)果與分 瞬時(shí)表達(dá)載體對(duì)GFP轉(zhuǎn)本生煙16c的GFP表達(dá)的影 小結(jié)與討 第六章總結(jié)與討 參考文 略語(yǔ)Double-strandedComplementarySodiumPolymerasechainNatriumDoubledistilledDimethylDEPCDistilledwatertreatedwithEthidiumNationalCenterforBiotechnologyBase第一獻(xiàn)綜棉花黃萎病菌及棉花黃萎菌研究概棉花黃萎病菌簡(jiǎn)棉花黃萎病主要由大麗輪枝菌（VerticilliumdahliaeKleb.）引起[5]。該病菌生長(zhǎng)溫度真菌及棉花黃萎近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)許多植物致病真菌攜有真菌，其中一些可以導(dǎo)致病原真菌低毒防治的Cryphonectriahypo 的抑制作用[9]。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)同樣對(duì)寄主力的還有侵染Ophiostomanovo-ulmi[10]和Sclerotiniahomoeocarpa[11]Sclerotiniasclerotiorum的Mito victoriae的 （Hv-145S）[13]，侵染Spergillusochraceus[14]和Rhizoctonia的Partiti ,侵染Diaportheambigua[16],Fusariumgraminearum[17],Botrytiscinerea[18]的未分類(lèi)等。此外，在稻瘟病菌[19]、水稻紋枯病菌[20]、馬鈴薯立枯絲核菌[21]中都發(fā)現(xiàn)有dsRNA2011年本等發(fā)現(xiàn)棉花黃萎菌0-21株系中存在dsRNAdahliaechryso1（VdCV1）[22]，該屬于Chryso，全組包括4個(gè)條帶，根OTU研究的概OvarianTumorprotease（OTU蛋白酶）的研究主要來(lái)源于對(duì)動(dòng)物和人及其相關(guān)的研究方面。第一、二個(gè)OTUB1和OTUB2是從Hala癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，是裂真菌中發(fā)現(xiàn)OTU的有Cryphonectrianitschkei 1[26]、棉花黃萎菌[22]，其功能也未研究。OTUBains是一個(gè)裂解蛋白酶科[27]，具有抑制泛素聯(lián)結(jié)（Ubiquitin-來(lái)自于2個(gè)不相關(guān)的動(dòng)物Nairo 和Arteri 的OTU蛋白酶具有抑制寄主抗活性、抑制寄主免疫反應(yīng)通路的作用，增強(qiáng)的侵染性[28]。轉(zhuǎn)OTU蛋白的小鼠增強(qiáng)了對(duì)Sindbis 侵染的敏感性[28]。由于OTU保守序列的存在及在免疫和侵染方面的作用，OTUBains科最近吸引了許多學(xué)者的注意[24]。真菌OTU，對(duì)CrimeanCongohemorrhagicfever （CCHFV）的研究[29]表明，OTU基糖體蛋白對(duì)煙草花葉運(yùn)動(dòng)蛋白具有降解作用，采用26S核糖體的抑制劑能夠增加隨著越來(lái)越多的真菌組完成，真菌生物學(xué)進(jìn)入了功能組時(shí)代[31]。自1973為研究功能的一種重要。目前，研究較多并成功轉(zhuǎn)化的真菌主要包括絲狀真菌、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研根癌農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏細(xì)菌，其在大多數(shù)雙子葉植物傷口的同時(shí)，可以將其質(zhì)粒上的一段DNA插入到植物組中。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌轉(zhuǎn)化法（Agrobacteriumtumefaciensmediatedtransformation,ATMT）具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）受體范圍廣。ATMT轉(zhuǎn)化真菌的受體材料可以是原生、孢子、菌絲體、子實(shí)體等組織及形態(tài)了Aspergillusawamori、Aspergillsniger、Colletotrochumgloeosporioides等一系列絲狀真菌。Mullins等[35]以質(zhì)粒pCAMBIA1300為骨架構(gòu)建了四個(gè)雙元質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入Fusariumoxysporum孢子。Javier等[36分別用菌絲體和分生孢子作為受體成功構(gòu)建了內(nèi)生真菌Acremoniumimplicatum的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。2）轉(zhuǎn)化效率高。Groot等[34]研究表明，使用ATMT法轉(zhuǎn)定遺傳。RaedO.Abuodeh在轉(zhuǎn)化Coccidioidesimmitis時(shí)發(fā)現(xiàn)在無(wú)潮霉素篩選的GYE培養(yǎng)基的影響。目前常用于真菌轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株有AGL-1、EHA105、LBA1100、LBA4404等。率相近，而LBA4404轉(zhuǎn)化失敗。Campoy等[39]在轉(zhuǎn)化Monascuspurpureus時(shí)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)株[40]。2）乙酰丁香酮（AS）對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。AS的作用是可以激活Vir，誘導(dǎo)Vir并不意味著S的濃度越高越好，茁等]在對(duì)淡紫擬青霉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)S濃度達(dá)到100gm1時(shí),轉(zhuǎn)化效率降低。并且oioka等得研究表明在預(yù)培養(yǎng)期加入S可以增加TA的拷貝數(shù)[4。3）根癌農(nóng)桿菌與受體菌濃度的比例對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。根癌農(nóng)6在轉(zhuǎn)化瓜類(lèi)炭疽菌時(shí)采用的共培養(yǎng)時(shí)間是24h，原因是共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成真菌萌發(fā)的菌絲越長(zhǎng)，難于洗脫從而影響轉(zhuǎn)化效率。等研究表明對(duì)于深綠木霉菌23的最佳共培養(yǎng)時(shí)間是48h。而mppinn等8]在轉(zhuǎn)化tomcohizlmbiontariaiolorS238時(shí)采用的共培養(yǎng)時(shí)間是108h225℃是最適的轉(zhuǎn)化溫度[40]5）載體及其啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。載體的空間結(jié)構(gòu)會(huì)直接影響轉(zhuǎn)化效率。等[4]在轉(zhuǎn)化紅曲霉時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用載體pR5750和pgHg成功，但前者的轉(zhuǎn)化效率是后者的pgHg只有啟動(dòng)子不同的載體p7-1值及載體膜類(lèi)型等均可對(duì)轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響，在進(jìn)行具體試驗(yàn)時(shí)應(yīng)該對(duì)各種條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的轉(zhuǎn)化條件，以達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)化效果[。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)適應(yīng)了真菌功能組時(shí)代所的大規(guī)模定向和隨機(jī)100種真菌利用M法轉(zhuǎn)化成功[3,7法的應(yīng)用范圍必將更加廣泛。PEG-CaCl2PEG-CaCl2介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化是以原生為感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PEG的介導(dǎo)作用將含外源的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。此法的關(guān)鍵步驟是原生的。目前采用的原生質(zhì)用菌絲、分生孢子和擔(dān)孢子[50]。影響PEG-CaCl2轉(zhuǎn)化效率的因素包括PEG的濃度和分子量、CaCl2的濃度和PH等。雖然該法操作簡(jiǎn)便，但是原生的過(guò)程相當(dāng)繁瑣，并且轉(zhuǎn)化效率也不高。等[51]利用PEG-CaCl2法對(duì)靈芝進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率僅有5-6個(gè)DNA分子穿過(guò)質(zhì)膜與受真菌原生的轉(zhuǎn)化效率不高，所以對(duì)真菌轉(zhuǎn)化采用此法的研究比較少[53]。等[54]利用電擊法成功轉(zhuǎn)化紫孢側(cè)耳原生，但轉(zhuǎn)化比僅有3.6%。轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞再生、轉(zhuǎn)化頻率原因使的該法的應(yīng)用受到了很大限制[55]Masahide[56]利用槍法成功轉(zhuǎn)化了Pleurotusostreatus，轉(zhuǎn)化效率為1個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA限制性?xún)?nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（RestrictionEnzyme-MediatedIntegration—REMI）是通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切真菌組DNA，然后與線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA相連接，同時(shí)與受體原生質(zhì)割的組DNA沒(méi)有完全修補(bǔ)所致。REMI作為分離植物病原真菌致病相關(guān)的有效工具目前已應(yīng)用于多種真菌的轉(zhuǎn)化。張永光等[57]REMI電轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母，并對(duì)香菇進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的轉(zhuǎn)化效率是后者的10倍。抗藥性標(biāo)4185100/ml200μ/ml9。高興喜等[0將CryAb)成功轉(zhuǎn)入哈茨木霉菌中，潮為150/ml.方麗等]合PUS體pGHP2轉(zhuǎn)200/mlJvr等6roniumipliat100/ml。沈衛(wèi)鋒等1為100/ml。等]在轉(zhuǎn)化深綠木霉菌23250/ml.陳強(qiáng)等250μ/ml.100/ml20/ml球孢白僵菌轉(zhuǎn)化時(shí)使用包括除草劑和潮霉素B等10種抗生素，僅除草劑有明顯的抑制作用。Ward等[65]得研究表明oliC3可以作為Aspergillusniger的篩選標(biāo)記。生型生長(zhǎng)。尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型是目前最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，d`Enfert等[66]的研究道的可以作為野生型標(biāo)記的有ade、met、pro、inl、arg、trp、ribo和leu等[67,68]。Cutler等[69]的研究表明nial可以用于依賴(lài)硝酸鹽同化作用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的標(biāo)記。Sandhu等[70]以niaD為篩選標(biāo)記對(duì)Beauveriabassiana和Metarhiziumanisopliae進(jìn)行轉(zhuǎn)化。[68]沉默和沉默抑制子研究概沉沉默（genesilencing）是指生物體中特定由于種種原因不表達(dá)，它是由Jorgenson等人于1990年在在轉(zhuǎn)苯基苯乙烯酮合成酶的紫色矮牽?；ㄖ惺状伟l(fā)現(xiàn)[71]，后來(lái)的其他的生物中也有相應(yīng)的發(fā)現(xiàn)。沉默分為轉(zhuǎn)錄水平的沉默（transcriptionalgenesilencing，TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平的沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）兩種因在細(xì)胞核中能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)中卻無(wú)對(duì)應(yīng)的mRNA存在。當(dāng)植物載體侵被稱(chēng)為誘導(dǎo)的沉默（ -inducedgenesilencing,VIGS）[72]。誘導(dǎo)的沉因沉默是植物抗病的可能機(jī)制[73]。因此，它不僅僅是研究沉默機(jī)制的熱點(diǎn)，而且還是研究植物功能和抗病防御的一種非常有效的。沉默抑制子(RNASilencingSuppressor)即植物RNA沉默的抑制子，是植物與在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成的一種抑制植物RNA沉默的反防御因子，從而可通過(guò)抑制RNA沉默實(shí)現(xiàn)自身對(duì)寄主植物的成功侵染目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20多種抑制子蛋白[74]，如由黃瓜花葉（cucumbermosaic 馬鈴薯A（potatoA,PVA）編碼的HC-pro蛋白，番茄叢矮(tomatobushy ,TBSV)編碼的P19抑制子等。其中由CMV編碼的2b蛋白是最先被證實(shí)的PTGS也發(fā)生于細(xì)胞核內(nèi)。另外，嫁接實(shí)驗(yàn)[75]表明2b蛋白可信號(hào)分子的長(zhǎng)距離運(yùn)輸。Brigneti等[76]人也發(fā)現(xiàn)CMV2b只能在新生葉片中抑制沉默，而不能逆轉(zhuǎn)葉中已建立起來(lái)的沉默，這進(jìn)一步說(shuō)明CMV2b可抑制系統(tǒng)沉默信號(hào)的傳導(dǎo)，從而促使向研究目本文通過(guò)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建含VdCV1中OTU雙元表達(dá)載體，并利用沉默抑制功能，為進(jìn)一步研究VdCV1中OTU的功能以及VdCV1與黃萎研究?jī)?nèi)OTUGateway雙元表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)含trpC啟動(dòng)子和潮霉素的重組Gateway雙元表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)以trpC為啟動(dòng)子，以表達(dá)載體pK7WG2D為骨架，構(gòu)建含潮霉素抗性的重Gateway雙元表達(dá)質(zhì)粒PKHyg含OTU的重組Gateway雙元表達(dá)載體—PHVcR4轉(zhuǎn)化黃萎菌；含trpC啟動(dòng)子和潮霉素的重組Gateway雙元表達(dá)載體—PKHyg轉(zhuǎn)化黃萎菌；含trpC啟動(dòng)子和潮霉素的雙元表達(dá)載體pBHt1轉(zhuǎn)化黃萎菌OTU對(duì)轉(zhuǎn)GFP煙草16C的沉默抑制功能初步研第二章OTUGateway雙元表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)tay（inviten開(kāi)發(fā)的一種基于位點(diǎn)特異性重組原理的通用克隆技術(shù)。由于該項(xiàng)技術(shù)突破了傳統(tǒng)的通過(guò)酶切與連接的方法構(gòu)建載體[7，可以將高dB基因，否則無(wú)法繁殖，這就大大降低了載體構(gòu)建中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率8。目前該技術(shù)已被迅速應(yīng)用于反向遺傳學(xué)方法研究動(dòng)物及植物單、多的功能研究。已有研究表明，雙35S啟動(dòng)子可以啟動(dòng)目的在真菌中表達(dá)[9d1中克的U過(guò)tay由M35S啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體p7W2D雙35S下OU構(gòu)代dB序列的對(duì)照載體。材料與方酶與試DNAAxygeneInvitrogen公司合成?？敲顾?Kan)和壯觀(guān)霉素（Spec）購(gòu)自生物工程公司。為了增強(qiáng)VcR4中OTU的表達(dá)，我們構(gòu)建載體時(shí)分別在VcR4前端引入強(qiáng)啟動(dòng)子35S序列，并在其末端加入特定核酶序列和NOS終止子。延伸PCR技術(shù)（overlap疊PCR技術(shù)可以有效的實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，為了方便導(dǎo)入Gateway入門(mén)載體系統(tǒng)，我們預(yù)先在35SattB1NOSattB2Gateway元件如圖2.1所示。2.1attBPCR產(chǎn)物構(gòu)建示意Fig.2.1ConstructionoftheattBPCRattBPCR產(chǎn)物內(nèi)各元件的35SNos-TpK7WG2DVcR4的模板來(lái)自VdCV1克隆質(zhì)粒55號(hào)（本提供，擴(kuò)增Cm的模板來(lái)自質(zhì)粒pDONR221，所需引 template（約0.5 1dNTPmixture（2.5 1.610pyrobest 2F（10 1R（10 1PyrobestDNA 0.2 13.2 20PCR℃3℃30℃3030℃1min（35SCmNos-T）3.5min（4 PCR產(chǎn)物純PCR會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶，因此有必要對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行純化，以便下一步離心管的重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積（100mg100μl；0.5BufferDE-A體積的BufferDE-B重復(fù)步驟7）一次（可選2-3min；12000rpm離心1min，洗脫目的條帶，1.0%attBPCR產(chǎn)物構(gòu)將以上所得PCR純化產(chǎn)物利用PCR技術(shù)融合在一起，引物使用attB1 template1（0.52.5template2（0.52template3（0.51attB1（101attB2（10110pyrobest2dNTPmixture（2.51.6PyrobestDNA0.28.720PCR℃3℃30℃3030℃4 入門(mén)載體0.5mlattBPCRproduct（約20ng/μl） pDONR 0.5 425℃，81μlProteinaseK，37℃，1042℃，60sec后立即置于冰上，237℃，225rpm，14℃，4500rpm1min，超凈工作臺(tái)內(nèi)棄600μl上清，剩余部分混勻后取100100mg/L堿法提取，37蕩培養(yǎng)8-16h；8000rpm，1min，棄凈上清菌體懸浮于150μlSolution5μl1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢重組質(zhì)粒酶切鑒 5.510×H 1重組質(zhì)粒 3MluⅠ(10 0.5 10反應(yīng)混合物輕微渦旋混勻后低速離心，373序列測(cè)經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送桑尼公司進(jìn)行DNA(ABI3730XLDNAyzer,USA)。引物為M13正反向引物。結(jié)果通過(guò)與VectorNTI軟件構(gòu)建的入門(mén)載體LR反應(yīng)構(gòu)建雙元表達(dá)載0.5mlEntryclone（約30 6 2 825℃，81μlProteinaseK，37℃，1042℃，60sec后立即置于冰上，237℃，225rpm，14℃，4500rpm1min，超凈工作臺(tái)內(nèi)棄600μl上清，剩余部分混勻后取100100mg/LPCR0.1F1R1dNTPmixture（2.510PCR1.620.214.12094394305830723721541.3.11序列測(cè)經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送桑尼公司進(jìn)行DNA(ABI3730XLDNAyzer,USA)。結(jié)果通過(guò)與VectorNTI軟件構(gòu)建的重組表達(dá)載體序列比對(duì)以驗(yàn)結(jié)果與分attBPCR產(chǎn)物構(gòu)建結(jié)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢attBPCR產(chǎn)物及其組成元件，結(jié)果如2.2所示

35SVcR4Nos-T

2.2attBPCR產(chǎn)物及其內(nèi)部各元件電泳檢測(cè)結(jié)(A)35S、VcR4、Nos-TCm。M，DNAMarker(Takara，D517A)；(B)attB產(chǎn)物檢測(cè)。M，DNAMarker(Takara，D517A)Fig.2.2ElectrophoresisresultofattBPCRproductandits(A)Theresultofprocessed35S,VcR4,Nos-TandCm.M,DNAMarker(Takara，D517A);(B)TheresultofpurifiedattBPCRproduct.M,DNAMarker(Takara,D517A).經(jīng)純化處理的attBPCR產(chǎn)物及其組成元件的電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，利用PCR技術(shù)已成功將35S、VcR4Nos-T連接起來(lái)，片段大小與預(yù)期片段大小3637bp相吻合，可用于下一步Gateway克隆構(gòu)建。另外一個(gè)片段Cm后預(yù)期大小1306bp，與電泳結(jié)果相一致。純化后的35S和VcR4、濃度與Nos-T比起來(lái)明顯較低，所以在做PCR時(shí)入門(mén)載體構(gòu)建結(jié)Gateway入門(mén)載體構(gòu)建結(jié)果結(jié)果2.3所示。酶切結(jié)果如2.4所示A

B

2.3入門(mén)載體質(zhì)粒提取電泳SM0311）1-7，Cm入門(mén)載體質(zhì)粒Fig.2.3ElectrophoresisresultofEntrySM0311）1-7，entryvectorsofCmA

B

2.4質(zhì)粒酶切鑒定電(AMluⅠ酶切重組質(zhì)粒。MDNAMarker(Fermentas,SM0311),1-3為酶切后的VcR4(B)MluⅠ酶切重組質(zhì)粒。MDNAMarker(Fermentas,SM0311),1-3為酶切后的Cm binatedplasmidsdigestedwithrestriction(A)Result binatedplasmidsdigestedwithMluⅠ.M,DNAMarker(Fermentas,SM0311);1-binatedplasmidsofVcR4digestedwith(B)M,DNAMarker(Fermentas,SM0311);1- binatedplasmidsofCmdigestedwith1%VectorNTI構(gòu)建7Gateway克隆方法的高效性。酶切預(yù)測(cè)結(jié)果分5191bp932bp2275bp+932bp與實(shí)際結(jié)果相一致，進(jìn)一步確證所選克隆為陽(yáng)性克隆，待結(jié)果最終驗(yàn)證序列的正確性。結(jié)ClaI

T7

T7EntryClonepDONR221/PCRProductof35s+VcR4+R+Nos-AvaIAvaIClaIAvaI

6123

rrnBT1transcriptionterminatorM13(-20)forwardprimerAvaI(2426)2.5VectorNTI模擬構(gòu)建入門(mén)載體Fig.2.5TheconstructionofentryvectorbyVectorLR構(gòu)建雙元表達(dá)載體結(jié)PCR2.62.7Vector（10206bp+1983bp）相一致。質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果與目的條帶大小一致。經(jīng)驗(yàn)證替A M1232.6目標(biāo)質(zhì)粒酶切鑒定EcoRⅠ酶切目標(biāo)質(zhì)粒。MTrans5KDNAMarker；1、3、5、7為重組質(zhì)粒；2、4、6、8為酶切EcoRⅠ酶切目標(biāo)質(zhì)粒。MMarker（akara，D517A；1-3Resultof binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠ.M,Trans5KDNAMarker;1、3、5、7,binatedplasmids；2、4、6、8， binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠResultof binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠ.M,Marker(Takara，D517A);1-3, plasmidsdigestedwithEcoRⅠ

2.7PCR鑒定電泳結(jié)MTrans5KDNAMarker；1-4M,Trans5KDNAMarker;1-4,destinationplasmidsPCRASacI(14437AXhoIHindIIIPstISmaIKpnIXhoI(12997StuIEcoRIPstI(11257

PstIStuISacI(1087HindIIIPstIPstIApaIPstIMluIBamHISmaIKpnI(1517SacIExpressionClone/pH7WG2D,1/OE+eGFP/PJC31/pDONR221/PCRProductof35s+VcR4ApaI EcoRI15105BamHIoja272SmaIKpnIoja273PstISmaIBamHIBEcoRIPstI(11257

PstI(

HindIII(PstI(PstI(

PstIHindIIIBamHISmaI(

PstI(BamHISmaI(EcoRIExpressionClone/pHWG2D,1/OE+eGFP/PJC31/pDONR221/PCRProduct

12189

oja273PstI(SmaI(BamHIPstI(HindIII(2.8VectorNTI模擬構(gòu)建目標(biāo)載體圖Fig.2.8TheconstructionofdestinationvectorbyVector(A)PHVcR；(B)小結(jié)與討本研究以表達(dá)載體PH7WG2D為骨架，通 Gateway技術(shù)插S片段和S片段，成功構(gòu)建了以P為報(bào)告，以g為篩選，含雙S啟動(dòng)子和U的重組雙元表達(dá)質(zhì)粒4和對(duì)。本研究首先對(duì)棉花黃萎菌VdcV1組中含OTU的片段VcR4進(jìn)行改造，改造PH7WG2D載體上帶有eGFP序列。眾所周知，GFP與目的融合不影響本米]、小麥[]、甘蔗[]等作物均有。P在真菌轉(zhuǎn)研究中同樣可以作為篩選標(biāo)tfnie等1的研究表明改進(jìn)的FP質(zhì)粒不僅提高了穩(wěn)定性，而且更易在真菌中表達(dá)。此外，盡Odell等[92]研究35S啟動(dòng)子表達(dá)無(wú)組織特異性，但后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子在不同宿主體內(nèi)表達(dá)效率不同，并且存在組織和特異性[82]。因此，本文第第三章含trpC啟動(dòng)子和潮霉素的Gateway雙元表達(dá)載體的構(gòu)已有研究表明，trpC啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)潮霉素在棉花黃萎菌中表達(dá)[62]。為了避免35S啟動(dòng)子在棉花黃萎菌中不啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，我們同時(shí)構(gòu)建了含trpC啟動(dòng)子和潮霉素基GatewayPK7WG2D。篩選標(biāo)記仍然是eGFP和潮霉素。材料與方酶與試和壯觀(guān)霉素（Spec）購(gòu)自生物工程公司。測(cè)來(lái)確認(rèn)潮霉素（Hyg）是否表達(dá)。構(gòu)建示意圖如圖3.1所示。3.1attBPCR產(chǎn)物構(gòu)建示意Fig3.1ConstructionoftheattBPCRattBPCR產(chǎn)物內(nèi)各元件的物表達(dá)載體pH7WG2D。所需引物如下： 1dNTPmixture（2.5 1.610pyrobest 2F（10 1R（10 1PyrobestDNA 0.2 13.2 20 10min PCR產(chǎn)物純attBPCR產(chǎn)物構(gòu) 15 入門(mén)載體堿法提取重組質(zhì)粒酶切鑒序列測(cè)經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送桑尼公司進(jìn)行DNA(ABI3730XLDNAyzer,USA)。引物為M13正反向引物。結(jié)果通過(guò)VectorNTI軟件分析驗(yàn)證序列的正LR反應(yīng)構(gòu)建雙元表達(dá)載0.5mlEntryclone（約30 6 2 825℃，842℃，60sec后立即置于冰上，237℃，225100mg/LPCR 0.1 1 1dNTPmixture（2.5 1.610PCR 2 0.2 14.1 20 3 30 30 3 15 序列測(cè)經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送桑尼公司進(jìn)行DNA(ABI3730XLDNAyzer,USA)。結(jié)果通過(guò)與VectorNTI軟件構(gòu)建的重組表達(dá)載體序列比對(duì)以驗(yàn)結(jié)果與分attBPCR構(gòu)建結(jié)A

Nos-

3.2attBPCR產(chǎn)物及其內(nèi)部各元件電泳檢測(cè)結(jié)(A)純化的trpC。M，DNAmarker（Fermentas,SM0311；(B)經(jīng)純化的attBPCR產(chǎn)物檢測(cè)。DNAMarker(Takara，D517A)Fig.3.2ElectrophoresisresultofattBPCRproductanditsTheresultofunprocessedtrpC.M,DNAMarker（Fermentas,TheresultofpurifiedattBPCRproduct.M,DNAMarker(Takara,大小2406bp相吻合?？梢杂糜贕ateway克隆入門(mén)載體的構(gòu)建。 圖3.3入門(mén)載體質(zhì)粒提取電泳圖M，DNAMarker(Takara，D517A)；1-8，入門(mén)載體Fig.3.3ElectrophoresisresultofEntryVectorsM，DNAmarker（Takara，D517A);1-8，entryvectors 3.4質(zhì)粒酶切鑒定電MluⅠ酶切重組質(zhì)粒。M為DNAMarker(Fermentas,SM0311)；1-3為酶切后的陽(yáng)性質(zhì)粒Fig.3.4Electrophoresisresultof binatedplasmidsdigestedwithrestrictionenzymeResultof binatedplasmidsdigestedwithMluⅠ.M,DNAMarker(Fermentas,SM0311);1-3,binatedplasmidsdigestedwith1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，構(gòu)建的入門(mén)載體大小與英駿公司VectorNTI構(gòu)建的入門(mén)載體圖譜大4953bp相吻合，初步表明入門(mén)載體構(gòu)建成功。MluⅠ酶切結(jié)果與預(yù)測(cè)大?。?021bp+932bp）一致進(jìn)一步確證所選克隆為陽(yáng)性克隆，待結(jié)果最終驗(yàn)證序結(jié)本次實(shí)驗(yàn)送出pDONRG1HYG-2和pDONRG1HYG-3兩個(gè)質(zhì)粒進(jìn)序，通過(guò)與軟軟件VectorNTI構(gòu)建入門(mén)載體示意圖。T7T7EntryClone/pDONR221/PCRProductoftrpC+Hyg+Nos-4953

rrnBT1transcriptionterminator3.5VectorNTI模擬構(gòu)建目標(biāo)載體圖Fig.3.5TheconstructionofentryvectorbyVectorLRLR反應(yīng)轉(zhuǎn)化后經(jīng)過(guò)酶切鑒定，根據(jù)構(gòu)建圖譜（圖3.8酶切鑒定使用HindⅢ。酶 bp，瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶與預(yù)期一致。PCR鑒定結(jié)果果見(jiàn)3.6，PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3.7。M1233.6目標(biāo)質(zhì)粒酶切鑒定HindⅢ酶切目標(biāo)質(zhì)粒。M，DNAMarker(Takara，D517A)；1-3為酶切后的陽(yáng)性質(zhì)粒Fig.3.6ElectrophoresisresultofdestinationplasmidsdigestedwithrestrictionenzymeResultof binatedplasmidsdigestedwithHindⅢ.M,DNAMarker(Takara，D517A); binatedplasmidsdigestedwithHindⅢ 3.7PCR鑒定電泳M,DNAMarker(Fermentas,SM0311)；1-2M,DNAMarker(Fermentas,SM0311);1-2,destinationplasmidsPCR

ExpressionClone/p7WG2D,1/pDONR221/PCRProductoftrpC+Hyg+N

3.8VectorNTI模擬構(gòu)建目標(biāo)載體圖Fig.3.8TheconstructionofdestinationvectorbyVector小結(jié)與討本章實(shí)驗(yàn)同樣利用PCR和Gateway重組克隆技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)載體PKHyg，在入門(mén)克隆已正確的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)酶切鑒定和PCR鑒定表明載體構(gòu)建成功。與第二章構(gòu)一個(gè)真菌啟動(dòng)子，可能比35S更適合在真菌轉(zhuǎn)中起始轉(zhuǎn)錄。Hamer等[93]曾系統(tǒng)研究構(gòu)巢曲霉菌trpCPromoter，得出-82的上游序列是trpC轉(zhuǎn)錄必須的結(jié)構(gòu)元件。本研究trpCpBARGPEG1pBARGPEG1Martin等[94]1993使用trpC作為真菌轉(zhuǎn)載體的啟動(dòng)子已有很多例子。Rho等[95]使用ATMT法轉(zhuǎn)化Magnaporthegrisea時(shí)，使用的篩選標(biāo)記潮霉素就是置于trpC啟動(dòng)子之后。Ulrich等達(dá)。但trpC啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度在已公開(kāi)的不同載體中有差異，本用trpC啟動(dòng)本章構(gòu)建的載體的過(guò)程再一次說(shuō)明Gateway重組技術(shù)的高效性。但是此法也有一定的缺陷性，即所要導(dǎo)入的目的載體必須包含attL位點(diǎn)。這使得一些載體的構(gòu)建還需要通過(guò)傳統(tǒng)的酶切連接方式進(jìn)行，限制了Gateway技術(shù)的使用范圍。另外，通過(guò)PCR連第四章不同表達(dá)質(zhì)粒ATMT法轉(zhuǎn)ATMT法是目前真菌遺傳轉(zhuǎn)化常用的法，借助此方法可以有效的研究真菌的代謝及生理現(xiàn)象的機(jī)理，定向改造真菌的遺傳物質(zhì)[33]ATMT法已成功轉(zhuǎn)化黃萎病菌并獲得轉(zhuǎn)GFP的單孢[62]ATMT法轉(zhuǎn)化棉花黃萎菌，將前兩章構(gòu)建的雙元表達(dá)載體導(dǎo)入，為研究OTU的功能奠定基礎(chǔ)。材料與方試劑與質(zhì)InvitrogenBRoche公司；ASAldrichsigma公司；其他無(wú)機(jī)試劑購(gòu)自杭州精細(xì)化工。菌種脫毒2d2mm×2mmPDA固體重復(fù)步驟2）一次切除菌絲尖端接種于不含放線(xiàn)菌酮的PDA黃萎菌RNA稱(chēng)取干燥菌體0.15g加入1mlTrizol后繼續(xù)研磨至溶液澄清透亮，室溫靜置5min，使其充解12000rpm，5min加入等體積的氯仿，振蕩混勻后靜置吸取上清，重復(fù)步驟4）3-5次加入等體積的異丙醇，混勻后4RT-PCR1）0.5mlPCR 3 0.5 0.5DEPC- 2.75 6.7570℃,10min；4℃，5min后繼續(xù)加入（dsRNA99℃,3min5min2min，繼續(xù)加入5×M-MLV 2dNTP 0.5RNA 0.25M- 0.5 1042℃,60min；70℃,10min；4℃,52dNTP1.610×PCR2110.212.22094594305630 3072472104LB平板（含30μg/mlRif、50μg/mlGen）挑取單菌落，37℃,225rpm，過(guò)夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，4℃，5000g，8min20ml預(yù)冷的0.1MMgCl24℃，5000g，8min后棄上清分裝成每管100μl后立即置于冰上，-80取農(nóng)桿菌感受態(tài)置于冰上，5-10質(zhì)粒酶切根據(jù)已有的研究，黃萎菌接種于含不同濃霉素B（50、100、150、200）PDA3個(gè)重復(fù)，25℃培養(yǎng)，連續(xù)觀(guān)察菌落生長(zhǎng)狀況1個(gè)月。ATMT法轉(zhuǎn)化棉花黃萎培養(yǎng)7-10d。劃線(xiàn)活化菌種，28℃,LB平板（含100μg/mlSpec、30μg/mlRif、50μg/mlGen）上挑取單菌落接種與5mlLB液體培養(yǎng)基（含上述抗生素）225rpm，28℃過(guò)夜培養(yǎng)；培養(yǎng)4-6h至OD600=0.6；數(shù)，用IM液體培養(yǎng)基稀釋至孢子濃度為106個(gè)/ml。100μl已活化的農(nóng)桿菌GV3101100μl黃萎病孢子稀釋液充分混勻后涂布于MM平板（含200μmol/LAS，25℃，培養(yǎng)2d；Cef，25結(jié)果與分0-21脫毒結(jié)

4.1脫毒菌株RT-PCR檢測(cè)電泳SM0311；1,0-菌株totalRNAFig.4.1ElectrophoresisresultofEntrytothreedifferentconcentrationcycloheximide(0.5%,0.75%,1%,respectively).毒的存在，而陽(yáng)性對(duì)照菌株0-21中提到的總RNA中可見(jiàn)目的條帶擴(kuò)出。理論上放線(xiàn)菌酮可以抑制蛋白的起始和合成，因此本實(shí)驗(yàn)最后采用1.0%濃度的放線(xiàn)菌酮處理的菌株0-21，以期其脫毒效果優(yōu)于其他脫毒菌株便于后期研究VdCV1中OTU的功能及潮霉素濃度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果分潮霉素的平板上菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)，而含100150μg/ml潮霉素的平板上無(wú)菌絲生長(zhǎng)。可見(jiàn)潮霉素濃度為100μg/ml可以完全抑制棉花黃萎菌菌絲的生長(zhǎng)?？紤]到隨后的真菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)采用的材料是黃萎菌分生孢子，結(jié)合已有文獻(xiàn)，最后采用的初篩濃度是50μg/ml，待進(jìn)一步篩選采100μg/ml。A

4.2質(zhì)粒酶切鑒定電EcoRⅠ酶切重組質(zhì)粒。M為T(mén)rans5KDNAMarker,1、3為重組質(zhì)粒；2、4HindⅢ酶切重組質(zhì)粒。M,Marker(Takara，D517A)；1-2Fig.4.2ElectrophoresisresultofplasmidsdigestedwithrestrictionResultof binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠ.M,Trans5KDNAMarker;1,3, binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠResultof binatedplasmidsdigestedwithHindⅢ.M,Marker(Takara，D517A);1-2, plasmidsdigestedwithHindⅢ對(duì)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，其中PHVcR4EcoRⅠ進(jìn)行酶切成功?？捎糜谙乱徊嚼肁TMT法轉(zhuǎn)化黃萎菌。 PHVcR4質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌結(jié)果4.3是帶有PHVcR4的農(nóng)桿GV3101與新鮮的黃萎菌脫毒菌株0-2148h后在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上觀(guān)察到的綠色熒光（4.3A，7天后發(fā)現(xiàn)有菌絲也有綠色熒光（4.3B。初步表明黃萎菌轉(zhuǎn)化成功。與PKHyg質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌結(jié)果相似。 4.3綠色熒光蛋白在黃萎菌轉(zhuǎn)化子不同時(shí)期綠色熒光蛋白在分生孢子中表達(dá)（2d；(B) 綠色熒光蛋白在菌絲中表達(dá)（7Fig.4.3ExpressionofGFPatdifferentdevelopmentalstagesofV.GFPexpressioninconidia(2d);(B)GFPexpressioninmycelium(7小結(jié)與討本研究采用ATMT法將不同質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花黃萎菌。PHVcR4質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能是：1）表達(dá)質(zhì)粒中的目的片段未能整合到棉花黃萎菌組中，綠色熒光屬于GFP瞬時(shí)表達(dá)；2）表達(dá)質(zhì)粒中的目的片段整合進(jìn)了棉花黃萎菌組，但啟動(dòng)子未啟動(dòng)潮霉素轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致具有綠色熒光的孢子和菌絲不具有潮霉素抗性。PKHyg質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌時(shí)在熒光倒置顯微鏡下未見(jiàn)到綠色熒光，表明轉(zhuǎn)化不成功，可能是PK7WG2D載體不適合用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌。pBHt1質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌不成功可能與農(nóng)桿菌菌株為T(mén)rpC啟動(dòng)子和終止子，篩選標(biāo)記為潮霉素，是文獻(xiàn)[35]能夠經(jīng)AGL-1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌的載體。pBHt1質(zhì)粒是從中國(guó)菌種保藏中心購(gòu)得，采用幾種方法都很難從農(nóng)桿菌C58C1致不能將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到已購(gòu)得的菌株AGL-1或GV3101，因此本研究還有待后續(xù)驗(yàn)證和 第五章OTU蛋白沉默抑制功能研RNA沉默就是組的免疫系統(tǒng)[99]。真菌CHV1的P29蛋白是從真菌發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)沉默抑制子且能夠抑制GFP序列引起的轉(zhuǎn)GFP本氏煙16C的綠色熒侵染性的特性[28]。由此聯(lián)想OTU蛋白是否具有抑制沉默的功能。因此本章進(jìn)行材料與方酶與試潮霉素B購(gòu)自Roche公司；AS購(gòu)自Aldrich公司；其他無(wú)機(jī)試劑購(gòu)自杭州精細(xì)LB平板（30μg/mlRif、50μg/mlGen）劃線(xiàn)活化菌種，28℃,48挑取單菌落，37℃225rpm，過(guò)夜培養(yǎng)1:100100mlLB培養(yǎng)基，30℃4轉(zhuǎn)移50ml離心管中，4℃，5000g，8min后棄上清4℃，5000g，8min2ml預(yù)冷0.1MCaCl2和甘油溶液（3ml0.1MCaCl20.5ml甘油預(yù)先混勻取農(nóng)桿菌感受態(tài)置于冰上，5-101min，42℃1800μlLB，225rpm，28℃2100μg/mlSpec、30μg/mlRif、50μg/mlPCR 0.1 1 1dNTPmixture（2.5 1.610PCR 2 0.2 14.1℃3℃30℃30℃3℃154

20農(nóng)桿菌Voinnet的方法[100,101]PHVcR4，PHCm1％W/V)的比例分別接種于含三抗（100μg/mlSpec，30μg/mlRif50μg/mlGen）LB液體培養(yǎng)基中12h（28℃，200rpm1％W/V10mM2-（N-嗎啉）-乙基磺酸（MES）20μM乙酰丁香酮（Acetosyringone）的三抗（100μg/mlSpec，30μg/ml10min，4℃離心收集菌體，并將沉淀菌體重新懸浮于浸潤(rùn)緩沖液中，調(diào)整濃度使其OD為1.0左右，室溫放置3h。pBI121-35S-GFP，pBI121-Fny-2b1％W/V)的比例分別接種200rpm1％W/V10mM2-（N-嗎啉）-乙基磺酸（MES）20μM乙酰丁香酮（Acetosyringone）的三抗（30μg/mlKan，30μg/mlRif50μg/mlGen）mlLB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（28℃，200rpm）至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6000rpm，15min離心收OD1.0左右。分別將35S-GFPpBI121-Fny-2b1：1進(jìn)行混合，283h。取1ml注射器，去掉針頭吸取農(nóng)桿菌菌液待用。選取5-6周齡4-6片真葉的處理兩片葉片，一片葉片上左右對(duì)稱(chēng)注射兩個(gè)區(qū)域，每個(gè)處理用163天后，用長(zhǎng)波紫外燈(BlackRaymodelB-100A;UV)GFP熒光的分布情況，并用帶有紫外和黃色濾光片的數(shù)碼相機(jī)(NikonD70S)拍照記錄結(jié)果與分瞬時(shí)表達(dá)載體對(duì)GFP轉(zhuǎn)本生煙16c的GFP表達(dá)的影圖5.1OTU瞬時(shí)表達(dá)對(duì)本生煙16C沉默系統(tǒng)的影1,Cm3days;2,Cm6days;3,Cm9days;4,OUT,3days;5,OUT,6days;6,F2b+GFP,Fig5.1.EffectofOTUproteinsonlocal1,Cm3days;2,Cm6days;3,Cm9days;4,OUT,3days;5,OUT,6days;6,F2b+GFP,9pHCm3eGFP攝看圖暗紅色不明顯，故增加第9天采用普通相機(jī)拍攝能顯示浸潤(rùn)區(qū)暗紅色，表明陽(yáng)性對(duì)照35S-GFP與35S-F2b農(nóng)桿菌浸潤(rùn)區(qū)為亮綠色，表明浸潤(rùn)區(qū)GFP的沉默得到浸潤(rùn)了pHVcR4質(zhì)粒農(nóng)桿菌植株浸潤(rùn)區(qū)第3天后比未浸潤(rùn)區(qū)綠色稍亮，表明質(zhì)粒所帶GFP在浸潤(rùn)區(qū)有表達(dá)但第6天后也變?yōu)榘导t色表明pHVcR4質(zhì)粒與對(duì)照pHCm質(zhì)粒一樣質(zhì)粒GFP序列在浸潤(rùn)區(qū)已成功誘導(dǎo)的植物的沉默作用，從而使轉(zhuǎn)GFP的植物綠色熒光蛋白系統(tǒng)沉默，不能表達(dá)GFP蛋白。小結(jié)與討本研究發(fā)現(xiàn)帶有GFP的Gateway雙元表達(dá)載體可以用于沉默抑制研究。由此充分發(fā)揮了Gateway雙元表達(dá)載體的快速成構(gòu)建載體的功能。另一方面，將待研究基因與GFP整合在一個(gè)載體中，減少了構(gòu)建多個(gè)載體的煩鎖，大大節(jié)約研究時(shí)間。當(dāng)然，對(duì)于Gateway雙元表達(dá)載體而言，將GFP全長(zhǎng)序列改造為GFP部分序列，本研究發(fā)現(xiàn)OTU沒(méi)有抑制煙草植物沉默的功能。雖然OTU具有抑制是同一途徑；也可能與煙草植物不是這一真菌的OTU的寄主有關(guān)。本研究結(jié)果第六章總結(jié)與株，進(jìn)行比較分析，并對(duì)OTU蛋白是否具有抑制沉默的功能進(jìn)行了探索。得到了如的Gateway雙元表達(dá)載體可以用于沉默抑制研究ATMT方法轉(zhuǎn)化真菌是真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究的一條新途徑[33]。在具體的轉(zhuǎn)化過(guò)程是GV3101和C58C1，未使用目前最多轉(zhuǎn)化成功率最高的菌株AGL-1，顯然以后的[33]PH7WG2D轉(zhuǎn)化時(shí)可以觀(guān)PK7WG2D轉(zhuǎn)化時(shí)未見(jiàn)綠色熒光表達(dá)。實(shí)驗(yàn)后期采用的真菌ATMT載體pBHt1由于包含在農(nóng)桿菌菌株中，常規(guī)方法未能獲得其質(zhì)粒。隨后的研究應(yīng)該AGL-1進(jìn)行轉(zhuǎn)化著手。啟動(dòng)子影響因素方面，本實(shí)驗(yàn)已先后嘗試兩種啟動(dòng)子—35StrpC對(duì)棉花黃萎菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但效果都不明顯，隨及[1].我國(guó)棉花黃萎病研究進(jìn)展[J].棉花學(xué)報(bào),1995,7(4):243-[2].棉花黃萎病的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備,2011,206(2):15-[3]鄭敬業(yè).我國(guó)棉花黃萎病研究文獻(xiàn)計(jì)量分析[J].農(nóng)業(yè)學(xué),2008,20(6):47-[4].棉花黃萎病的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2009(5):91-[5]張緒振,張樹(shù)琴,棣,等.我國(guó)棉花黃萎病菌種的鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào),1981,11(3):13-20[6],高智謀,曹君,等.棉花黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響因素研究[J].農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(17):4330-4331[7]毛嵐,宋培玲,楊家榮.ISSR分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2009,37(5):149-154[8].真菌的研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,36(3):280-ChoiG.HandNussDLNuss.HypovirulenceofchestnutblightfungusconferredbyaninfectiousviralcDNA[J].Science,1992,257(5071):800-803HongY,etal.Multiple esinanisolateoftheDutchElmdiseaseOphiostomanovo-ulmi[J].Virology,1999,258(1):118-DengFandG.Boland.AsaliteRNAofOphiostomanovo-ulmimito3ainhypovirulentisolatesofSclerotiniahomoeocarpa[J].Phytopathology,2004,94(9): XieJ,etal.Characterizationofdebilitation-associatedmycoinfectingtheplant-pathogenicfungusSclerotiniasclerotiorum[J].JGenVirol,2006,87(1):241-249 ZhaoT,HavensWMandGhabrialSA.Diseasephenotypeof-infectedHelminthosporiumvictoriaeisindependentofoverexpressionofthecellularalcoholoxidase/RNA-bindingproteinHv-p68.Phytopathology,2006,96(3):326-332LiuW,DunsGandChenJ.GenomiccharacterizationofanovelpartitiAspergillusochraceus[J]Genes,2008,37(3):322-StraussEE,LakshmanDKandTavantzisSM.MolecularcharacterizationofthegenomeofapartitifromthebasidiomyceteRhizoctoniasolani[J].JGenVirol,2000,81(2):PreisigO,etal.AnovelRNAmycoinahypovirulentisolateoftheplantDiaportheambigua[J].JGenVirol,2000,81(12):3107- KwonSJ,etal.MolecularcharacterizationofadsRNAmyco,Fusariumgraminearum-DK21,whichisphylogeneticallyrelatedtohypoesbuthasagenomeorganizationandgeneexpressionstrategyresemblingthoseofplantpotex-likees[J].MoleculesandCells,2009,28(1):73-74CastroM,etal.Adouble-strandedRNAmycoconfershypovirulence-associatedtraitstoBotrytiscinerea[J].FEMSMicrobiolLett,2003,228(1):87-91MaejimaK,etal.Completenucleotidesequenceofanewdouble-strandedRNAfromthericeblastfungus,Magnaportheoryzae[J].ArchVirol,2008,153(2):389-391 陳隆鐘,等.顆粒的存在與其對(duì)水稻紋枯病菌的影響[J].JOURNALOFXINJIANGUNIVERSITY,2004,21(Supp):2-9LiuC,LakshmanDKandTavantzisSM.Quinicacidinduceshypovirulenceexpressionofahypovirulence-associateddouble-strandedRNAinRhizoctoniaCurrGenet,2003,43(2):103- CaoYF,etal.GenomiccharacterizationofanoveldsRNAdetectedinthephytopathogenicfungusVerticilliumdahliaeKle