薩福克羔羊卵泡誘導的影響因素分析,畜牧獸醫(yī)論文

薩福克羔羊卵泡誘導的影響因素分析,畜牧獸醫(yī)論文體外胚胎生產技術的效率，與卵母細胞來源和質量密切相關[1-3],屠宰場采集的卵母細胞由于品種、健康狀況等因素都不明確，無法用于體外胚胎生產。而成年羊的活體采卵技術，因對供體羊傷害大，效率低，也無法用于生產實踐，但利用羔羊作為供體，能夠避免以上的缺乏。因幼齡動物體外胚胎生產及移植技術〔Juvenileinvitroembryotransfer,JIVET〕能提供高于成年羊數以10倍的卵母細胞，極大地縮短了時代間隔，因此可應用于轉基因、核移植等生物技術和動物新品種的培育[4].當前，已有誘導牛[5-6]、山羊[7-8]和綿羊[9-13]等品種幼齡階段卵泡發(fā)育的研究，而在綿羊的研究中，以Kelly等[10-12]的研究最為具體，其研究了EGF、IGF-1等生長因子對羔羊卵母細胞體外發(fā)育的影響，在對美利奴羔羊的研究中，1只4~8周齡的羔羊最多獲得了13.9只后代的效果。Gou等[13]研究了季節(jié)對細毛羊羔羊誘導效果的影響，發(fā)現秋季效果好于春季和冬季。固然細毛羊羔羊卵泡發(fā)育效果較好，但對薩?？烁嵫虻难芯枯^少，而薩?？藢儆谌庥镁d羊，其激素誘導方案能否與細毛羊一致，還沒有定論。本研究以此為切入點，研究可能影響薩?？烁嵫蚵雅菡T導的因素，以期獲得穩(wěn)定的薩?？烁嵫蜻x擇標準，以及季節(jié)對卵泡發(fā)育和卵母細胞發(fā)育的影響，旨在為薩?？烁嵫蝮w外胚胎規(guī)模化生產奠定基礎。1材料與方式方法1.1羔羊的選擇及試驗設計本試驗在阿克蘇地區(qū)天山肉用種羊有限責任公司養(yǎng)殖基地進行。試驗1:根據羔羊體況和精神狀態(tài)，隨機選擇45只薩?？烁嵫?，根據出生日齡，將試驗組設為5~6和8~9周齡組。試驗2:將試驗1中所用的5~6周齡共39只薩?？烁嵫颍鶕w重將其分為8~10、11~12和13~18kg3組；試驗3:隨機選擇采食、精神狀態(tài)等正常，無病狀表現的出生年齡、體重等較為接近的53只薩?？烁嵫蛴米鞴w，將華而不實部分羊曾因病注射過抗生素的設為亞健康組，其余羔羊無疾病史，設為健康組。試驗4:在春、秋季，隨機選擇5~9周齡、初生重相近、精神狀態(tài)良好的薩?？烁嵫?3只進行激素誘導，將2個季節(jié)的羔羊卵泡發(fā)育效果進行統(tǒng)計，以分析季節(jié)對激素誘導效果和卵母細胞質量能否存在差異。試驗5:分別將試驗4中春、秋季獲得的羔羊早期胚胎進行移植，以研究季節(jié)對羔羊胚胎移植效果能否有影響。1.2羔羊的處理本試驗使用的垂體促卵泡素〔FSH〕為加拿大BIONICHE公司生產的FOLLTROPIN-V,孕馬血清〔PMSG〕為寧波三生激素有限公司生產。根據試驗設計，隨機選擇羔羊，每只羔羊使用FSH劑量為160IU以等劑量的方式每日早晚間隔12h各注射1次，共注射4次，在第1次注射FSH的同時，注射500IUPMSG,禁食禁飲，羔羊手術采卵前稱量羔羊體重。1.3受體羊的選擇及處理選擇健康、無明顯繁衍疾病的經產本地母羊用作受體。受體羊進行同期發(fā)情處理：埋植海綿栓12d,在打第4針時撤栓，同時注射333IU/只的PMSG,撤栓后36~48h各試情1次，發(fā)情的羊用作受體。1.4卵母細胞的回收及評定將饑餓12h的羔羊保定在手術架上，腹部刮毛，用清水擦洗后，碘酒棉球轉圈消毒，用75%酒精脫碘，在腹中線左側或右側，避開血管，手術切開兩指長的小口，將單側卵巢暴露于體外，用經鹽水濕潤的滅菌紗布將卵巢包裹，用吸有抽卵液的帶8號針頭的10mL注射器，從卵巢底部開場逐步向上抽吸卵巢外表的卵泡，將回收的卵泡液入至60mm培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下?lián)斐鏊新涯讣毎?，集中在不含肝素鈉的抽卵液洗盤內，選擇可用卵母細胞用作體外培養(yǎng)。抽卵液為：TCM199-Hepes〔Sigma〕+2%FBS〔Sigma〕+0.027mg/mL肝素鈉〔Sigma〕。根據卵母細胞-卵丘細胞復合體中卵丘細胞的多少、包裹的嚴密程度及卵母細胞胞質均勻度來選擇卵母細胞。將包裹3層以上顆粒細胞、胞質均勻的卵母細胞定為可用卵母細胞。1.5卵母細胞體外成熟培養(yǎng)提早2h,在CO2含量體積分數為5%、溫度為38.6℃的二氧化碳培養(yǎng)箱內平衡成熟培養(yǎng)液。將可用卵母細胞用不含肝素鈉的抽卵液洗滌2遍，成熟培養(yǎng)液洗滌3遍后，按40~60枚/孔的密度放入平衡好的四孔板內培養(yǎng)。體外成熟培養(yǎng)液為：TCM199-HCO3+10%FBS〔GIBCO〕+0.05IU/mLFSH+0.05IU/mLLH+1g/mLestradiol+24.2g/mL丙酮酸鈉+60g/mL谷氨酰胺+0.1mmol/L半胱氨酸+10ng/mLEGF+0.1mg/mL雙抗〔北京鼎國〕。1.6卵母細胞體外受精將體外成熟培養(yǎng)22~24h的羔羊卵母細胞取出，在0.1%透明質酸酶內反復吹吸，脫去部分卵丘細胞，放入平衡好的裝有體外受精液的四孔板內。采集新鮮精液，取100~200L鮮精置于上游液圓底試管底部，精子上游30~40min,取上清，以1500r/min的轉速離心4min,棄去上清，再用受精液離心洗滌一次，將底部少許精子濃縮液輕輕混勻，按1106~2106的密度參加放有卵母細胞的四孔板內，精卵共孵育。受精液為SOF+20%SS〔自制發(fā)情羊血清〕+0.027mg/mL肝素鈉，華而不實SOF為6.29mg/mLNaCL+0.534mg/mLKCL+0.162mg/mlKH2PO4+0.6L/mL乳酸鈉+0.089mg/mLMgSO4+2.1mg/mLNaHCO3+0.0357mg/mL丙酮酸鈉+0.299mg/mLCaCL22H2O+0.1mg/mL雙抗。1.7體外培養(yǎng)將受精18~22h的胚胎取出，在體外培養(yǎng)液滴內反復吹吸，以去除粘附于透明帶上的卵丘細胞和精子等，洗滌3遍，將胚胎放入裝有平衡好的培養(yǎng)液的四孔板內，置于5%O2、5%CO2和90%N2的密封氣袋內培養(yǎng)〔氣袋置于5%的CO2、38.6℃的二氧化碳培養(yǎng)箱內〕，受精48h時統(tǒng)計卵裂率，剔除單細胞胚胎，剩余胚胎繼續(xù)放入氣袋內培養(yǎng)，至7d時，統(tǒng)計囊胚率。培養(yǎng)液為1/mLBSA+0.1mg/mL雙抗。1.8受體羊同期發(fā)情處理選擇體況正常、無繁衍疾病的經產本地地方品種綿羊用作受體。陰道埋植海綿栓12d后撤栓，同時肌肉注射PMSG300IU/只和PG0.1mg/只。撤栓后24h開場試情，每隔12h試情1次，發(fā)情羊用作移植受體。1.9統(tǒng)計分析所有數據采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。試驗1、3、4和5使用t檢驗，試驗2采用One-wayANOVA中Duncan方差分析方式方法，結果以平均值標準誤表示。2結果與分析2.1薩?？烁嵫蛑荦g對激素處理的反響激素處理后，羔羊卵泡發(fā)育及卵母細胞質量見表1.5~6周齡薩?？烁嵫蛱幚砗蟮姆错懧蕿?9.74%,而8~9周齡的薩福克羔羊反響率只要33.33%;5~6周齡組羔羊的卵泡數、卵母細胞數和可用卵母細胞數皆極顯著高于8~9周齡〔P0.01〕。反響率指卵巢上有明顯發(fā)育卵泡的羔羊數/羔羊總數。【1】2.2春季外源激素對不同體重薩?？烁嵫虻淖饔脤?~6周齡薩?？烁嵫蝮w重分為3組，各組經激素處理后卵泡及卵母細胞數見表2.5~6周齡薩?？烁嵫?，體重在8~18kg時對外源激素的反響沒有統(tǒng)計學差異〔P0.05〕，每只羔羊平均獲得可用卵母細胞數在66.50~77.21.因而，對于5~6周齡薩?？烁嵫蚨裕瑹o論體重大小，都不會影響卵泡發(fā)育和卵母細胞的質量。2.3羔羊健康狀況對誘導效果的影響選擇時健康，但曾有疾病史的羔羊經外源激素處理后，其卵泡數、可用卵母細胞數、體外受精后的可用胚胎數等指標極顯著低于健康羔羊組〔P0.01〕.2.4季節(jié)對羔羊激素誘導效果的影響分別將春、秋季出生羔羊進行激素處理，處理后的卵泡發(fā)育效果見表3.無論春季或秋季出生羔羊，激素處理后平均每只供體的卵泡個數和獲得的可用卵母細胞數沒有差異〔P0.05〕。將獲得的部分早期胚胎移植后，剩余的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，受精后第7天統(tǒng)計囊胚發(fā)育率，胚胎發(fā)育結果如表4所示，春、秋季羔羊卵母細胞體外受精后的卵裂率差異極顯著〔P0.01〕，囊胚發(fā)育率顯著〔P0.05〕?！?】2.5季節(jié)對胚胎移植受胎率的影響將獲得的早期胚胎，隨機選擇，按每只受體4~5枚的胚胎進行移植，剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，至7d時，統(tǒng)計囊胚率，將囊胚移植至受體內。移植后35dB超檢測早期懷孕率〔陽性/受體數〕。產羔后，統(tǒng)計最終懷孕率〔產羔母羊數/受體數〕和產羔率〔出生羔羊/受體數〕。試驗結果表示清楚〔表5、表6〕，春季或秋季，移植早期胚胎和囊胚期胚胎的懷孕率和產羔率相差都不大，但秋季移植早期胚胎和囊胚期胚胎的受胎率高于春季?！?】3討論1979年，Worthington等[14]即開場對羔羊卵泡發(fā)育進行研究，發(fā)現經hCG處理的羔羊卵巢有明顯的卵泡。我們國家對幼齡動物卵泡發(fā)育的研究最早是由張鎖鏈等[15]在山羊上進行，但當時由于體外培養(yǎng)等技術不夠成熟，沒有能得到理想的效果。JIVET技術體系最早是由澳大利亞南澳生殖與發(fā)育研究所提出并應用于生產[16],但我們國家大部分地區(qū)對該技術仍處于研究階段，到達可推廣階段的不多，可能與JIVET技術包括的環(huán)節(jié)較多，諸多因素都可能影響試驗結果，進而導致生產效率不穩(wěn)定有關。1〕供體羊的選擇是JIVET技術成功與否的首要因素。經Kelly等[10]對美利奴細毛羊的研究得出，其激素處理的最佳階段為4~8周齡。而鄭旭等[17]發(fā)現，遼寧絨山羊的最適年齡為5~6周齡，郭洪等[18]對湖羊、哈薩克羔羊的研究發(fā)現，哈薩克羔羊的最佳處理年齡是4~8周，但不是湖羊羔羊的最佳時期。本試驗通過對薩?？烁嵫虻难芯堪l(fā)現，其最佳處理年齡為5~618周齡以上的羔羊不合適JIVET技術體系，與美利奴細毛羊和哈薩克羔羊的4~8周齡相比，范圍較窄。分析原因，可能與各品種羔羊卵巢出現卵泡閉鎖的時間不同有關。早期Kennedy等[19]在研究美利奴細毛羊胎兒期至出生后33周齡卵巢和卵泡發(fā)育情況時發(fā)現，在羔羊出生早期，卵巢重量和卵泡數量隨著日齡的增長而逐步增加，4~8周齡時到達高峰，隨后部分卵泡開場閉鎖，數量逐步降低，33周齡后保持穩(wěn)定。因而，根據本研究結果，能夠推論，薩?？烁嵫蚵殉埠吐雅莅l(fā)育的高峰期為5~6周齡，8周齡時卵泡開場出現閉鎖現象，但該推論尚需進一步研究。2〕體重是衡量個體生長發(fā)育的重要指標。多胎、初生重過低、健康狀況不良、生長速度較慢等因素都可能導致體重過低[20],因而在選擇羔羊時體重應成為考量因素之一。本研究中選擇的羔羊初生重相近，生長至5~6周齡時，體重在8~18kg,范圍較大，經外源激素處理后，固然10~12kg組的效果稍高于8~10和12~18kg組，但各組間差異不顯著。由此能夠得出，體重較低或較重的羔羊，并不影響其卵泡發(fā)育和卵母細胞的回收。該研究結果也進一步證明，在體況正常情況下，影響卵巢及卵泡發(fā)育最大的可能因素為日齡而非體重。3〕在選擇供體羊時，通常根據羔羊的采食、精神狀態(tài)等表觀現象進行選擇，有明顯疾病的羔羊不會被選作供體，但不會查看生長經過中可能出現的意外情況。但曾經生病、試驗時已痊愈的羔羊對試驗效果能否有影響，當前未見報道。本研究隨機選擇的羔羊，分屬同一養(yǎng)殖場的2個養(yǎng)殖戶，體況相近，飲食、精神狀態(tài)良好，但試驗結果卻表示清楚兩養(yǎng)殖戶之間差異較大，分析后發(fā)現，華而不實一養(yǎng)殖戶對羔羊極為關注，羔羊稍有不適，即便用大量的青霉素、頭孢等抗生素，試驗數據表示清楚，有疾病史的羔羊，激素誘導效果較差，平均每只獲得可用卵母細胞數僅為38.47枚，顯著低于正常羔羊的82.08枚，體外受精后獲得的早期胚胎僅為27.47枚，為正常羊的1/2.因而，選擇供體羔羊時，其曾經健康狀況不容忽視。4〕薩?？搜蚴羌竟?jié)性發(fā)情動物，對于成年母羊，秋冬是發(fā)情季節(jié)，春夏為乏情季節(jié)，常規(guī)的配種或胚胎移植一般選擇秋季進行。幼齡期羔羊，由于體內各種激素調控功能尚不健全，內分泌激素水平受環(huán)境影響不明顯，不應有季節(jié)性差異。經研究發(fā)現，季節(jié)對羔羊卵泡發(fā)育沒有影響，但對獲得卵母細胞質量有顯著影響，秋季出生羔羊卵母細胞體外受精后的卵裂率、囊胚率顯著高于春季出生的效果。據Gou等[13]分析，卵母細胞體外發(fā)育效率出現季節(jié)性差異，可能與使用的精子質量有關，秋季公羊精子活力好于春夏季，而精子質量對卵母細胞的后期發(fā)育影響很大；但若使用秋季做的凍精，受精效率仍然較低的話，則講明春季的羔羊卵母細胞質量較差。5〕秋季移植2~8細胞期或囊胚期胚胎，懷孕率和產羔率