分子生物學(xué)技術(shù)之DNA重組技術(shù)

第五章分子生物學(xué)技術(shù)DNA重組技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，得益于上個(gè)世紀(jì)中葉以來(lái)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、雜交、電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來(lái)自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件三大成就：一、在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；二、50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；三、50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開DNA分子。第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。圖5-1幾種主要DNA內(nèi)切酶所識(shí)別的序列及其酶切末端。（二）基因克隆的載體

我們知道僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足基因工程的要求，因?yàn)榇蠖鄶?shù)DNA片段不具備自我復(fù)制的能力，只有將他們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。載體（vector)是指具備自主復(fù)制的DNA分子，象病毒、噬菌體和質(zhì)粒等相對(duì)分子量較小的復(fù)制子均可以作為基因?qū)氲妮d體。載體三要素：自我復(fù)制能力；攜帶外源基因片段大?。ň哂休^小的分子量和較高的拷貝數(shù)）；插入位點(diǎn)多少（具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)）；易于鑒定識(shí)別（具有抗菌素抗性基因）大腸桿桿菌質(zhì)質(zhì)粒載載體:1、pSC101質(zhì)質(zhì)粒載載體低拷貝貝數(shù)嚴(yán)嚴(yán)緊型型復(fù)制制控制制的大大腸桿桿菌質(zhì)質(zhì)粒載載體，，平均均每個(gè)個(gè)寄主主細(xì)胞胞僅有有1~2個(gè)個(gè)拷貝貝。長(zhǎng)9.09kb，帶帶有四四環(huán)素素抗性性基因因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、、XhoI、PvuII以及及SmaI等7種限限制性性核酸酸內(nèi)切切酶的的單酶酶切位位點(diǎn)，，在HindIII、BamHI和SalI等等3個(gè)個(gè)位點(diǎn)點(diǎn)插入入外源源基因因，會(huì)會(huì)導(dǎo)致致tetr失活。。大腸桿桿菌pSC101質(zhì)質(zhì)粒載載體示示意圖圖。是第一一個(gè)真真核基基因克克隆載載體。。缺點(diǎn)點(diǎn)：它它是一一種嚴(yán)嚴(yán)緊型型復(fù)制制控制制的低低拷貝貝質(zhì)粒粒，從從帶有有該質(zhì)質(zhì)粒的的寄主主細(xì)胞胞中提提取pSC101DNA，，產(chǎn)量量很低低。2、ColE1質(zhì)粒粒載體體松弛型型復(fù)制制控制制的多多拷貝貝質(zhì)粒粒。一般情情況下下，當(dāng)當(dāng)培養(yǎng)養(yǎng)基中中氨基基酸被被耗盡盡，或或是在在細(xì)胞胞培養(yǎng)養(yǎng)物中中加入入氯霉霉素以以抑制制蛋白白質(zhì)的的合成成，寄寄主染染色體體DNA的的復(fù)制制便被被抑制制，細(xì)細(xì)胞的的生長(zhǎng)長(zhǎng)也隨隨之停停止。。而松弛弛型質(zhì)質(zhì)粒DNA卻繼繼續(xù)復(fù)復(fù)制數(shù)數(shù)小時(shí)時(shí)，使使每個(gè)個(gè)寄主主細(xì)胞胞中ColE1質(zhì)粒粒的拷拷貝數(shù)數(shù)達(dá)到到1000~3000個(gè)個(gè)，占占細(xì)胞胞總DNA的50%左右右。3、pBR322質(zhì)質(zhì)粒載載體由三個(gè)個(gè)不同同來(lái)源源的部部分組組成的的：第一部部分來(lái)來(lái)源于于pSF2124質(zhì)質(zhì)粒易易位子子Tn3的的氨芐芐青霉霉素抗抗性基基因（（AmpR）；第二部部分來(lái)來(lái)源于于pSC101質(zhì)粒粒的四四環(huán)素素抗性性基因因（tetr）；第三部部分則則來(lái)源源于ColE1的派派生質(zhì)質(zhì)粒pMB1的的DNA復(fù)復(fù)制起起點(diǎn)（（ori））。AmpR優(yōu)點(diǎn)是是具有有較小小的分分子量量，其其長(zhǎng)度度為4363bp。不不僅易易于純純化，，而且且即使使攜帶帶上一一段6-8kb的外外源DNA片段段，操操作起起來(lái)仍仍較為為便利利。具有兩兩種抗抗生素素抗性性基因因以用用作轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子子的選選擇記記號(hào)。。有較高高的拷拷貝數(shù)數(shù)，若若經(jīng)過過氯4、pUC質(zhì)粒載體體（包括四四個(gè)部分））：(i)來(lái)自自pBR322質(zhì)粒粒的復(fù)制起起點(diǎn)（ori）；(ii)氨芐青青霉素抗抗性基因因（ampr）；(iii)大腸腸桿菌ββ-半乳乳糖酶基基因（lacZ）的啟啟動(dòng)子及及其編碼碼α-肽肽鏈的DNA序序列，此此結(jié)構(gòu)特特稱為lacZ’基因因；(iv)位于lacZ’基基因中的的靠近5’-端端的一段段多克隆隆位點(diǎn)（（MCS）區(qū)段段，外源源基因插插入后破破壞了lacZ’基基因的功功能。優(yōu)點(diǎn)：更小的分子量量和更高的拷拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建建pUC質(zhì)粒粒載體時(shí)，僅僅保留下其中中的氨芐青霉霉素抗性基因因及復(fù)制起點(diǎn)點(diǎn)，其分子小小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由由于缺失rop基因，pUC質(zhì)粒不不經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)擴(kuò)增時(shí)，平均均每個(gè)細(xì)胞即即可達(dá)500~700個(gè)個(gè)拷貝。可用組織化學(xué)學(xué)方法檢測(cè)重重組體。pUC8質(zhì)粒結(jié)結(jié)構(gòu)中具有來(lái)來(lái)自大腸桿菌菌lac操縱縱子的lacZ‘基因，，所編碼的αα-肽鏈可參參與α-互補(bǔ)補(bǔ)作用。因此此，可用X-gal顯色色法實(shí)現(xiàn)對(duì)重重組體轉(zhuǎn)化子子的鑒定。具有多克隆位位點(diǎn)MCS區(qū)區(qū)段，可以把把具兩種不同同粘性末端（（如EcoRI和BamHI）的外外源DNA片片段直接克隆隆到pUC8質(zhì)粒載體上上。5、pGEM-3Z質(zhì)粒長(zhǎng)度為2743bp，編編碼有一個(gè)氨氨芐青霉素抗抗性基因和一一個(gè)lacZ'基因。含有兩個(gè)噬菌菌體啟動(dòng)子（（T7和SP6），為RNA聚合酶酶的附著作用用提供了特異異性的識(shí)別位位點(diǎn)。加入T7或SP6RNA聚聚合酶，所克克隆的外源基基因便會(huì)轉(zhuǎn)錄錄出相應(yīng)的mRNA。6、穿梭質(zhì)粒粒載體（shuttleplasmidvector）指由人工構(gòu)建建的具有兩種種不同復(fù)制起起點(diǎn)和選擇記記號(hào)，可在兩兩種不同的寄寄主細(xì)胞中存存活和復(fù)制的的質(zhì)粒載體。。由于這類質(zhì)質(zhì)粒載體可以以保證外源DNA序列在在不同物種的的細(xì)胞之間得得到擴(kuò)增，能能在原核和真真核細(xì)胞之間間往返穿梭，，具有廣泛的的用途。7、pBluescript噬菌粒粒載體pBluescript是指指由Stratagene公公司發(fā)展的的一類從pUC載體體派生而來(lái)來(lái)的噬菌粒粒載體，簡(jiǎn)簡(jiǎn)稱為pBS（+/-），如如今則更多多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多多克隆位點(diǎn)點(diǎn)區(qū)的取向向，即lacZ基因因是按照SacI→→KpnI的方向轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄；（+/-）表示單單鏈?zhǔn)删w體f1復(fù)制制起點(diǎn)的兩兩種相反的的取向。f1（（+））起起點(diǎn)點(diǎn)表表示示當(dāng)當(dāng)pBluescript噬噬菌菌粒粒載載體體和和輔輔助助噬噬菌菌體體共共感感染染寄寄主主細(xì)細(xì)胞胞時(shí)時(shí)，，能能夠夠回回收收到到lacZ基基因因的的有有意意義義鏈鏈DNA；；而而f1（（-））起起點(diǎn)點(diǎn)則則表表示示當(dāng)當(dāng)pBluesript噬噬菌菌粒粒載載體體與與輔輔助助噬噬菌菌體體共共感感染染寄寄主主細(xì)細(xì)胞胞時(shí)時(shí)，，可可回回收收到到lacZ基基因因的的無(wú)無(wú)意意義義鏈鏈DNA。。(i)在在多多克克隆隆位位點(diǎn)點(diǎn)區(qū)區(qū)（（MCS））的的兩兩側(cè)側(cè)，，存存在在一一對(duì)對(duì)T3和和T7噬噬菌菌體體的的啟啟動(dòng)動(dòng)子子，，用用以以定定向向指指導(dǎo)導(dǎo)插插入入在在多多克克隆隆位位點(diǎn)點(diǎn)上上的的外外源源基基因因的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄活活動(dòng)動(dòng)；；(ii)具有單單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)復(fù)制起點(diǎn)點(diǎn)和一個(gè)個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒粒的復(fù)制制起點(diǎn)，，保證pBluescript噬菌菌粒載體體在有或或無(wú)輔助助噬菌體體共感染染的不同同情況下下，按照照不同的的復(fù)制形形式分別別合成出出單鏈或或雙鏈DNA；；(iii）編碼碼有一個(gè)個(gè)氨芐青青霉素抗抗性基因因，作為為轉(zhuǎn)化子子克隆的的選擇標(biāo)標(biāo)記；(iv)含有一一個(gè)lacZ基基因，可可以按照照X-gal-IPTG組織織化學(xué)顯顯色法篩篩選噬菌菌粒載體體的重組組子。LacZ編碼β-半乳糖苷苷酶氨基基端146個(gè)氨氨基酸的的α-肽，IPTG（異丙丙基-β-D-硫代半半乳糖苷苷）誘導(dǎo)導(dǎo)該基因表表達(dá)，合合成的β-半乳乳糖苷酶酶α-肽肽能與宿宿主細(xì)胞胞所編碼碼的缺陷陷型β-半乳糖糖苷酶相相互補(bǔ)，，產(chǎn)生有有活性的的β-半半乳糖苷苷酶，能能水解外外源加入入培養(yǎng)基基中的X-gal（5-溴-4-氯氯-3-吲哚-β-D-半乳乳糖苷）），生成成藍(lán)色的的溴氯吲吲哚，使使生長(zhǎng)于于含X-gal培養(yǎng)基基中的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化菌落落呈藍(lán)色色。重組DNA操作作過程示示意圖圖5-2DNA連接接酶能把把不同的的DNA片段連連接成一一個(gè)整體體僅僅能在在體外利利用限制制性核酸酸內(nèi)切酶酶和DNA連接接酶進(jìn)行行DNA的切割割和重組組，還不不能滿足足基因工工程的要要求，只只有將它它們連接接到具備備自主復(fù)復(fù)制能力力的DNA分子子上，才才能在寄寄主細(xì)胞胞中進(jìn)行行繁殖。。具備自主主復(fù)制能能力的DNA分分子就是是分子克克隆的載載體（vec