中性蛋白酶發(fā)酵液脫色工藝優(yōu)化

中性蛋白酶發(fā)酵液脫色工藝優(yōu)化桂麗;孫謐瀏均忠;王偉【摘要】為了脫除中性蛋白酶發(fā)酵液中的色素，降低色素在產(chǎn)品應(yīng)用中的影響，研究并比較了樹脂、活性炭、H2O2對中性蛋白酶發(fā)酵液的脫色效果.實驗結(jié)果表明，陰離子交換樹脂D380(Cl)型能使其有效脫色并保留較高的蛋白酶活性;利用響應(yīng)面實驗建立數(shù)學(xué)模型,并確定D380(Cl)型樹脂脫色最適流速為2.35柱體積/h(bedvolume/h,BV/h),最佳上樣量為0.4BV,最適上樣酶活力為40000U/mL,最適pH值為6,此時,中性蛋白酶發(fā)酵液脫色率為86%,酶活回收率為95%.D380(Cl)型樹脂連續(xù)使用10次仍有較強脫色能力,脫色率在80%以上，酶活回收率在90%以上.【期刊名稱】《食品與發(fā)酵工業(yè)》【年(卷)，期】2016(042)008【總頁數(shù)】5頁(P92-96)【關(guān)鍵詞】中性蛋白酶;脫色;樹脂;響應(yīng)面【作者】桂麗;孫謐瀏均忠;王偉【作者單位】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島市海洋酶工程重點實驗室,山東青島,266071;上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海,201306;中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島市海洋酶工程重點實驗室,山東青島,266071;中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島市海洋酶工程重點實驗室,山東青島,266071;中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室,青島市海洋酶工程重點實驗室,山東青島,266071【正文語種】中文中性蛋白酶是最早被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶類，由于其作用條件溫和，催化速率較快，無工業(yè)污染，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌、皮革、銀洗、飼料、化工和廢棄物處理［1］；特別是因為中性蛋白酶能水解原料蛋白且減少苦味肽的產(chǎn)生，其在食品工業(yè)上的應(yīng)用更為廣闊［2］。中性蛋白酶發(fā)酵液中含有大量色素雜質(zhì)，應(yīng)用在食品加工領(lǐng)域時這些雜質(zhì)會直接影響產(chǎn)品的夕卜觀品質(zhì)，此外，脫除色素對精制酶以提高酶的附加值也有重要意義。因此，針對中性蛋白酶發(fā)酵液建立有效的脫色方法成為提高其應(yīng)用質(zhì)量的迫切需求。由于不同蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)存在差異，對不同種類的蛋白酶發(fā)酵液脫色需要篩選合適的脫色介質(zhì)：王芳等利用陰離子交換樹脂D352對低溫堿性蛋白酶MP發(fā)酵液進行脫色，脫色率和酶活回收率均能達(dá)到90%以上［3］;JOO等人利用陰離子交換樹脂HPA75對堿性蛋白酶BACP發(fā)酵液進行脫色，脫色率能達(dá)到80%以上，酶活幾乎無損失［4］;但是，國內(nèi)外專門針對中性蛋白酶發(fā)酵液進行脫色的研究不多。本文從適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求出發(fā)，以南海海域分離的1株產(chǎn)中性蛋白酶菌株的發(fā)酵液為原料［5］,比較了不同脫色介質(zhì)對中性蛋白酶發(fā)酵液的脫色效果，進而選取合適的脫色介質(zhì)并優(yōu)化脫色工藝條件，以期提高中性蛋白酶的應(yīng)用品質(zhì)。中性蛋白酶發(fā)酵液：本課題組利用10L發(fā)酵罐發(fā)酵制備，pH7~8，經(jīng)絮凝、過濾及硫酸銨沉淀除去培養(yǎng)基雜質(zhì)和菌體，酶泥復(fù)溶得不同濃度中性蛋白酶發(fā)酵液。顆?；钚蕴俊⒎勰┗钚蕴?、30%H2O2購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；大孔吸附樹脂NKA、D3520，弱堿性陰離子交換樹脂D380，弱酸性陽離子交換樹脂110均購自南開大學(xué)化工廠；弱堿性陰離子交換樹脂D316購自山東魯抗立科，其他試劑均為國藥分析純。①26mmx457mm玻璃離子交換柱，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；CR21GB高速離心機，日立公司；LKB2219恒溫水浴鍋，瑞典BROMMA公司。選取初始酶活為10000U/mL的中性蛋白酶發(fā)酵液適量，用0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值至5.0，添加10g/L的顆粒和粉末活性炭，50°C水浴振蕩保溫脫色1h，離心取上清為脫色樣品，調(diào)pH至7.0,取樣測定其吸光度與酶活。選取初始酶活為10000U/mL的中性蛋白酶發(fā)酵液適量，用氨水調(diào)pH至8.0,加入30%H2O2，使H2O2終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3%,50C水浴保溫脫色1h,調(diào)pH至7.0，取樣測定其吸光度與酶活。大孔吸附樹脂用體積分?jǐn)?shù)為4%的HCl浸泡4h，用去離子水洗至中性后，再用40g/L的NaOH浸泡4h，去離子水洗至中性，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡5h,去離子水洗凈，濕法裝柱使用；陰離子交換樹脂用4%HCl和40g/L的NaOH各浸泡4h，去離子水洗至中性，4%HCl浸泡3h轉(zhuǎn)型洗至中性或直接濕法裝柱使用；陽離子交換樹脂用40g/L的NaOH和4%HCl各浸泡4h，去離子水洗至中性，40g/L的NaOH浸泡3h轉(zhuǎn)型洗至中性或直接濕法裝柱使用。取中性蛋白酶發(fā)酵液1/3BV，樣品酶活力20000U/mL,以1BV/h的流速上樣，后用洗脫液以與上樣流速相同的流速進行洗脫，收集液定容后取樣測定其吸光度與酶活。取1.5.2中篩選出的最優(yōu)樹脂，利用單因素實驗分析高徑比、流速、pH值、上樣酶活力、上樣量對脫色效果的影響。根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行響應(yīng)面實驗，根據(jù)中心'組合實驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素五水平響應(yīng)面實驗，采用Design-Expert8.05軟件對數(shù)據(jù)進行分析，建立數(shù)學(xué)模型，根據(jù)模型預(yù)測最佳脫色條件并進行驗證［7］。取1.5.2中篩選的最優(yōu)樹脂，按最適條件進行脫色，脫色后用4%HCl和40g/L的NaOH各浸泡4h再生，去離子水洗至中性，4%HCl浸泡3h轉(zhuǎn)型洗至中性，濕法裝柱使用。樹脂共再生9次。將脫色前發(fā)酵液和脫色后發(fā)酵液稀釋至同等倍數(shù)，以420nm[8]下吸光度為表征色值，按公式(1)計算脫色率：式中：D，脫色率；A0，脫色前吸光度；A，脫色后吸光度。參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23527—2009進行，具體如下：1mL稀釋后酶液與1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪素溶液混合，40°C水浴10min,2mL的0.4mol/L三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，靜置過濾；空白對照加樣順序為酶液一TCA一酪素。取1mL上清液加5mL的0.4mol/LNa2CO3溶液、1mL福林試劑，置于40C水浴中顯色20min取出，冷水冷卻至室溫，680nm波長下比色。以每毫升原酶液在40C、pH7.0條件下水解酪蛋白，每分鐘釋放1pg酪氨酸的酶量定義為1個酶活單位。表1中列出了活性炭、H2O2和樹脂的脫色效果，由該表可看出樹脂脫色的方法明顯優(yōu)于活性炭和H2O2脫色：活性炭脫色和H2O2脫色會使酶活大幅度降低，這與脫色反應(yīng)所處的較高溫度、活性炭對蛋白的吸附作用以及H2O2的氧化作用有關(guān)，兩種脫色方法的脫色率也較低，這與色素自身特性有關(guān)。根據(jù)表1中列出的結(jié)果，選擇脫色率較高，酶活回收率相對較高的陰離子交換樹脂D380(Cl)型進行下一步實驗。處理條件對脫色效果的影響如圖1~圖5所示。由圖1可以看出，高徑比越高越好，這符合塔板理論。高徑比達(dá)到1:6時，脫色率和酶活回收率增勢趨于平緩。考慮實際實驗操作因素，選擇1:6為后續(xù)實驗所用高徑比。流速過高則色素與樹脂接觸不充分而使脫色率下降，流速過低則樹脂會吸附過多的蛋白酶導(dǎo)致酶活回收率下降。由圖2可以看出，流速在2BV/h以下時對酶活回收率和脫色率影響較小，在流速增至2BV/h時，脫色率降至84%，酶活回收率增至90%左右，繼續(xù)增加流速，發(fā)現(xiàn)其對酶活回收率影響不大，但脫色率仍在持續(xù)降低。綜合考慮兩因素，選擇2BV/h為最適流速。發(fā)酵液與洗脫液的pH值會影響溶液中的色素、蛋白與樹脂中離子的交換解離，同時，pH值對蛋白酶穩(wěn)定性也有很大影響，因此，選擇該蛋白酶較穩(wěn)定的pH5~9進行pH因素影響實驗。由圖3可以看出，隨著pH值增高，脫色率略微降低，酶活回收率先增后減，偏中酸性時酶活回收率和脫色率較高，這與該中性蛋白酶等電點和蛋白酶自身穩(wěn)定性以及色素自身特性有關(guān)。綜合考慮兩因素，選擇酶活回收率最高、脫色率較高的pH6為最適脫色pH值。由圖4可以看出，隨著樣品酶活力的增加，脫色率先增后減，酶活回收率變化不大。上樣酶活力較低時，洗脫液顏色太淺，實測數(shù)據(jù)接近于0，測得數(shù)據(jù)不在線性范圍內(nèi)，造成脫色率較低；樣品酶活力增加，實測數(shù)據(jù)逐漸在線性關(guān)系的數(shù)值范圍內(nèi)，此時隨著色素量增大，色素和樹脂的結(jié)合逐漸達(dá)到飽和，洗脫下來的色素相應(yīng)增多，使得脫色率逐漸降低；此外，溶液濃度增大，黏性也增大，分子運動阻力增加，不利于被吸附物質(zhì)向吸附劑表面擴散，這也導(dǎo)致了脫色率的降低。綜合考慮，選擇40000U/mL為最適上樣酶活力。由圖5可以看出，隨著上樣量的增加，脫色率遞減，酶活回收率先增后減。上樣量的增加會增加樹脂吸附的色素的量，當(dāng)色素與樹脂的結(jié)合逐漸達(dá)到飽和，樹脂對色素的吸附作用下降，脫色率逐漸降低。酶活回收率先增后減，是因為樹脂對蛋白的吸附先達(dá)到了飽和，蛋白與樹脂結(jié)合能力下降，此時隨著上樣量增加，酶活回收率相應(yīng)的增加；上樣量繼續(xù)增加，蛋白流經(jīng)樹脂所需時間更長，與樹脂的接觸更加充分，使得樹脂之間的空隙殘留的蛋白更多，從而造成酶活回收率的下降。綜合考慮，選擇0.5BV為最適上樣量。綜合以上實驗結(jié)果，流速、上樣量、上樣酶活力3因素對脫色效果影響大。因此，固定脫色pH值為6、高徑比為1:6,以流速2BV/h、上樣量0.5BV、上樣酶活力40000U/mL為中心條件進行以流速、上樣量、上樣酶活力為自變量，脫色率和酶活回收率為雙響應(yīng)值［9］的響應(yīng)面條件優(yōu)化，設(shè)計中心組合實驗。實驗設(shè)計、結(jié)果如表2、表3所示。根據(jù)CentralComposite設(shè)計了20組實驗，結(jié)果見表3。利用Design-Expert8.05軟件對表3兩響應(yīng)值進行多元回歸擬合，得到D380(Cl)型樹脂對中性蛋白酶發(fā)酵液脫色率Y1和酶活回收率Y2的回歸方程分別為：Y1=84.70-0.65X1-0.98X2-1.73X3-0.2X1X2-0.24X1X3+0.18X2X3-0.14X12+0.54X22-1.56X32Y2=95.66+1.25X1-0.19X2+1.32X3-0.44X1X2+6.25x10-3X1X3-0.52X2X3-0.8X12-1.23X22-1.88X32兩模型的方差分析顯示，實驗所建立的兩個二次項模型具有高度顯著性(P1=0.0004<0.05,P2=0.0001<0.05),失擬項均不顯著，兩模型的R2分別為0.9112和0.9920，表明模型擬合度較好，能較好地預(yù)測實驗結(jié)果。綜合兩響應(yīng)模型進行軟件分析，得出當(dāng)流速為2.35BV/h，上樣量為0.4BV，樣品酶活力為39741.04U/mL,其余條件不變時，脫色率和酶活回收率有最大響應(yīng)，理論最大脫色率為86.0%，酶活回收率為95.3%。為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在流速2.35BV/h、上樣量0.4BV、上樣酶活力為40000U/mL條件下進行驗證實驗，3組平行實驗脫色率分別為：86.1%、86.3%、85.9%，酶活回收率分別為：95.5%、95.1%、95.9%，與預(yù)測值接近，表明該模型預(yù)測效果良好。通過優(yōu)化，陰離子交換樹脂D380(Cl)型對中性蛋白酶發(fā)酵液的脫色率由最初的(83.2±1.2)%提高至(86.1±0.2)%，酶活回收率由最初的(84.9±0.6)%提高至(95.5±0.4)%，這表明該條件是中性蛋白酶發(fā)酵液脫色的理想條件。王芳等利用陰離子交換樹脂D352對低溫堿性蛋白酶MP發(fā)酵液進行脫色，樹脂重復(fù)使用6次后仍有較好的脫色效果，但脫色率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢［3］;JOO等人利用陰離子交換樹脂HPA75對堿性蛋白酶BACP發(fā)酵液進行脫色，樹脂重復(fù)使用4次時，脫色率由最初的78%降低至72%，酶活回收率由幾乎無損失降低至93%[4]。由圖6可以看出，在重復(fù)使用過程中脫色率和酶活回收率均未呈現(xiàn)明顯降低趨勢，使用第10次時脫色率和酶活回收率分別為84.0%、94.1%，說明樹脂再生對脫色效果影響小，再生后樹脂仍有較好的脫色性能。D380(Cl)型樹脂能重復(fù)使用多次，降低了生產(chǎn)成本，滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。通過比較不同脫色介質(zhì)對中性蛋白酶發(fā)酵液的脫色效果，發(fā)現(xiàn)樹脂脫色效果優(yōu)于活性炭和H2O2，在所篩選的樹脂中陰離子交換樹脂D380(Cl)型脫色效果最優(yōu)。通過單因素實驗及響應(yīng)面實驗