DNA抽提和質(zhì)粒DNA制備

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA抽提和質(zhì)粒DNA制備核酸分子抽提的技術(shù)設(shè)計(jì)核酸的釋放：

破裂細(xì)胞釋放核酸機(jī)械法與非機(jī)械法（非機(jī)械法中溶胞法是應(yīng)用最廣泛的方法）核酸的分離與純化：

將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液第1頁/共94頁第2頁/共94頁第3頁/共94頁核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌第4頁/共94頁鑒定與保存（一）核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定第5頁/共94頁濃度鑒定1紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。如計(jì)算DNA濃度A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。第6頁/共94頁2熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。第7頁/共94頁純度鑒定1紫外分光光度法：在260nm和280nm處測(cè)定DAN溶液的光吸收，A260與A280之比應(yīng)在1.80。低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有RNA的殘留量。A260/A280比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)。第8頁/共94頁2熒光光度法核酸電泳結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。第9頁/共94頁完整性鑒定凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。第10頁/共94頁第11頁/共94頁

第12頁/共94頁核酸的貯存——DNA保存

1

短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。2長(zhǎng)期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。第13頁/共94頁核酸的貯存——RNA保存RNA可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸水，在-70℃保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。第14頁/共94頁基因組DNA的分離與純化第15頁/共94頁第16頁/共94頁DNA樣品準(zhǔn)備

常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮第17頁/共94頁DNA提取1酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。獲DNA大小為100－150kb。第18頁/共94頁主要試劑的作用：

EDTA：1二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；2降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性第19頁/共94頁SDS的作用：1溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂；2溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；3對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用；4與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。第20頁/共94頁蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。第21頁/共94頁酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。第22頁/共94頁2甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA200kb左右。第23頁/共94頁3玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。第24頁/共94頁4異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）。5表面活性劑快速制備法：用TritonX-100或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。第25頁/共94頁DNA樣品的純化：透析、層析、電泳及選擇性沉淀。電泳法簡(jiǎn)單、快速，是DNA樣品純化最重要的方法。瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺電泳。PAGE分辨率高，適用于5-500bp大小的片段。第26頁/共94頁

瓊脂糖含量％（W/V）

線性DNA分離范圍（Kb）0.3

5-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1–2第27頁/共94頁DNA的濃縮

1、

固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量。2、

丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會(huì)。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積。第28頁/共94頁

DNA的檢測(cè)

溴乙錠染色：在254nm紫外光下檢測(cè)，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易使嘌呤斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ngDNA。銀染法：Ag+與DNA形成復(fù)合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。第29頁/共94頁DNA分析

通常與已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段一起電泳，經(jīng)比較可獲知DNA標(biāo)本大小，如條帶拖尾，系加入DNA量太多或凝膠未制好，如分子量小或一片糊狀，表示DNA有降解。第30頁/共94頁DNA回收

主要是從電泳中分離回收DNA片段?；厥赵瓌t：盡量提高回收率去除回收DNA樣品中的污染物第31頁/共94頁電泳到DEAE-纖維素膜：

DEAE是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有負(fù)電荷的DNA分子。

在所需條帶前插入DEAT-纖維素膜，繼續(xù)電泳至條帶DNA都到膜上，取出洗下。500bp-5kb的DNA片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過10kb和單鏈DNA。

第32頁/共94頁透析袋電洗脫：

切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳，DNA出膠后進(jìn)行抽提DNA回收。第33頁/共94頁低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠：切下膠，加熱到65℃熔化膠，然后抽提回收DNA。

方法：有機(jī)溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。第34頁/共94頁玻璃珠洗脫法：將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結(jié)合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將DNA洗脫下。第35頁/共94頁瓊脂水解酶：將含DNA的凝膠進(jìn)行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA第36頁/共94頁問題從細(xì)胞或組織中分離DNA時(shí)，常用蔗糖，目的是（）

A抑制核酸酶

B保護(hù)DNA，防止斷裂

C加速蛋白質(zhì)變性

D有利于細(xì)胞破碎第37頁/共94頁用SDS-酚抽提DNA時(shí)，SDS濃度十分重要，當(dāng)SDS濃度為0.1%時(shí)，（）A只能將DNA抽提到水相B只能將RNA抽提到水相C可將DNA、RNA一起抽提到水相DDNA和RNA都不能進(jìn)入水相第38頁/共94頁異戊醇的作用是（）A使蛋白質(zhì)脫水B使DNA進(jìn)入水相C幫助DNA進(jìn)入水相D減少氣泡，促進(jìn)分相第39頁/共94頁變色的酚中含有氧化物，這種酚不能用于DNA分離，原因主要是（）A氧化物可使DNA磷酸二酯鍵斷裂B氧化物會(huì)改變PH值C氧化物同DNA形成復(fù)合物D氧化物在DNA分離后不易除去第40頁/共94頁酚抽提蛋白質(zhì)時(shí)，離心后，為什么蛋白質(zhì)總是會(huì)停留在水相和酚相之間？

酚使蛋白質(zhì)分子間脫水而變性，變性的蛋白的密度比水大，但比酚小，故停留在兩者之間。第41頁/共94頁為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。另外使用飽和酚減少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的損失率。第42頁/共94頁第43頁/共94頁質(zhì)粒DNA制備

第44頁/共94頁質(zhì)粒簡(jiǎn)介

質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子

其大小范圍從lkb至200kb以上不等。

已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒.這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。

第45頁/共94頁第46頁/共94頁第47頁/共94頁

由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對(duì)抗生素的抗性、降解復(fù)雜有機(jī)化合物，以及產(chǎn)生大腸桿菌素、腸毒素及限制酶與修飾酶等等。

第48頁/共94頁質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)．第49頁/共94頁質(zhì)粒依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒含有編碼某些酶的基因，在一定的環(huán)境下對(duì)細(xì)菌宿主有利。第50頁/共94頁質(zhì)粒特性

1.分子相對(duì)小2.含有高效的自主復(fù)制成分3.不相容性4.轉(zhuǎn)移性5.選擇的標(biāo)記6.限制性內(nèi)切酶單一切口第51頁/共94頁常用質(zhì)粒載體

pBR322

pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長(zhǎng)為4363bp，由3種野生型質(zhì)粒成分組成，ampr基因來自pRSF2124，tetr來自pSCl01，復(fù)制起始點(diǎn)來自pM9。核苷酸的序次號(hào)，以EcoRI序列GAATTC的第一個(gè)T為第一個(gè)核苷酸。第52頁/共94頁第53頁/共94頁

pUC系統(tǒng)

l

如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和復(fù)制子，以及大腸桿菌部分1acZ基因和一個(gè)多種限制性內(nèi)切酶單一位點(diǎn)的接頭構(gòu)成，全長(zhǎng)2666bp，pUCl8和pUCl9所含多位點(diǎn)接頭的方向正好相反。

第54頁/共94頁第55頁/共94頁表達(dá)載體

載體含有tac啟動(dòng)子、Lac操縱基因、SD序列、LacI阻遏蛋白基因等

第56頁/共94頁四、質(zhì)粒DNA的提取和純化

1．細(xì)菌的培養(yǎng)l

先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。第57頁/共94頁對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上不受到宿主細(xì)胞的控制，故在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體DNA的復(fù)制。質(zhì)粒DNA的復(fù)制不受影響而大量擴(kuò)增。第58頁/共94頁l

所以使用氯霉素的主要目的，是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細(xì)菌的培養(yǎng)體積和細(xì)菌的數(shù)量．

有時(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌中的擴(kuò)增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過大所致。第59頁/共94頁2．細(xì)菌的收集與裂解

細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈。

第60頁/共94頁細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。

第61頁/共94頁3質(zhì)粒DNA的抽提第62頁/共94頁

質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備500ml堿裂解法

方法煮沸法

SDS裂解法

Triton-溶菌酶法第63頁/共94頁（三）質(zhì)粒DNA提取方法的選擇

l

常用的煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿意效果．至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，用煮沸法或SDS法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大量分離，只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問題.第64頁/共94頁l

選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素：1．菌株類型2．質(zhì)粒的大小3．細(xì)菌染色體DNA變性條件強(qiáng)弱的控制4．細(xì)菌的培養(yǎng)與收集第65頁/共94頁（四）堿裂解法原理：

在pHl2.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)(CC)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。

第66頁/共94頁

將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而CC質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。

第67頁/共94頁通過離心，可去除大部分細(xì)胞碎片染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。第68頁/共94頁（二）煮沸裂解法利用溶菌酶和TritonX-100破壞細(xì)胞壁，在將裂解液煮沸。原理：加熱可使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性，但環(huán)狀質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)緊密而不會(huì)解鏈，溫度下降后，質(zhì)粒DNA又重新恢復(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，回收上清液中質(zhì)粒DNA第69頁/共94頁煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取小質(zhì)粒。對(duì)于會(huì)釋放出大量糖類的菌株不適宜。如HB101及衍生菌。第70頁/共94頁（三）SDS裂解法比較溫和的抽提方法。將細(xì)菌懸浮在等滲的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解酚-氯仿抽提。適合于大于15kb的質(zhì)粒DNA的抽提，但產(chǎn)率不高。第71頁/共94頁第72頁/共94頁第73頁/共94頁第74頁/共94頁4．質(zhì)粒DNA純化

l

質(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來以后，為滿足有些實(shí)驗(yàn)的要求還應(yīng)進(jìn)一步純化。CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法。

但是由于此法費(fèi)用昂貴及流程長(zhǎng)，近年來，發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。如離子交換層析法或排阻層析法，分級(jí)聚乙二醇沉淀法等，也可獲得較好質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。第75頁/共94頁l

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及DNA外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)閉合環(huán)狀雙鏈DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。

對(duì)于DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直接用小量或中量提取的DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。第76頁/共94頁1CsCl-EB法超速離心將介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開。第77頁/共94頁2聚乙二醇沉淀法分級(jí)沉淀，首先利用LiCl沉淀大分子RNA，用Rnase酶消化小分子RNA；在利用乙二醇選擇性沉淀大質(zhì)粒DNA，再利用酚-氯仿抽提。

方法簡(jiǎn)單實(shí)用，但是不能區(qū)分環(huán)狀