DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯復(fù)習(xí)

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯復(fù)習(xí)內(nèi)容提要

《分子診斷學(xué)》是供高等醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)本科學(xué)生使用的教材，也可供其他醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)學(xué)生及醫(yī)生參考。本書主要內(nèi)容分為以下幾個(gè)方面：（1）基礎(chǔ)篇：著重描述了原核生物基因組、病毒基因組、真核基因組和蛋白質(zhì)組等基礎(chǔ)理論；（2）技術(shù)篇：介紹了生物大分子的分離純化技術(shù)、分子克隆技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)、PCR技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)、蛋白質(zhì)組研究技術(shù)和生物芯片技術(shù)等；（3）應(yīng)用篇：在探討分子診斷的基本策略與方法的基礎(chǔ)上，詳細(xì)介紹了感染性疾病的分子診斷、單基因疾病的分子診斷、多基因疾病的分子診斷、移植配型、法醫(yī)學(xué)鑒定、單核苷酸多肽型分析以及生物信息學(xué)在分子診斷中的應(yīng)用。第1頁/共47頁實(shí)驗(yàn)1

分子生物學(xué)基本操作與訓(xùn)練

；實(shí)驗(yàn)2感受態(tài)細(xì)胞的制備，重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌及重組子篩選

；實(shí)驗(yàn)3重組質(zhì)粒DNA的小量制備；實(shí)驗(yàn)4重組質(zhì)粒DNA限制性內(nèi)切酶的酶切與鑒定

；實(shí)驗(yàn)5聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及瓊脂糖凝膠電泳；實(shí)驗(yàn)6基因組DNA的提取與鑒定；相關(guān)實(shí)驗(yàn)課程第2頁/共47頁復(fù)習(xí)DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯

基因表達(dá)調(diào)控第3頁/共47頁DNA復(fù)制

概念:半保留復(fù)制,半不連續(xù)復(fù)制(前導(dǎo)鏈,后隨鏈),岡崎片段

DNA復(fù)制的酶學(xué)

DNA聚合酶(DDDP,多功能酶)

起始階段---獲得單鏈模板解螺旋酶,拓?fù)洚悩?gòu)酶,單鏈結(jié)合蛋白等第4頁/共47頁反轉(zhuǎn)錄

(reversetranscription)

以RNA為模板，合成與其互補(bǔ)的DNA的過程,也稱逆轉(zhuǎn)錄

。RNADNA反轉(zhuǎn)錄酶第5頁/共47頁①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖核酸酶H活性（RNaseH）。③DNA聚合酶活性（DDDP）。反轉(zhuǎn)錄酶的作用－合成cDNA：反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為反轉(zhuǎn)錄過程。反轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。第6頁/共47頁5335

RNA(用表示)RNA-DNA雜化分子35

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4種dNTP

RDDP（反轉(zhuǎn)錄酶）引物、4種dNTP病毒雙鏈DNA用表示）（cDNA第二鏈(complementaryDNA，cDNA)與病毒RNA互補(bǔ)的DNA(用表示)5335

535

3反轉(zhuǎn)錄酶的作用第7頁/共47頁轉(zhuǎn)錄(

transcription

)生物體以DNA為模板合成RNA的過程轉(zhuǎn)錄RNADNA

第8頁/共47頁轉(zhuǎn)

錄

的條件：原料

:

4種NTP(ATP,

UTP,

GTP,CTP)模板

:單鏈DNA

酶

:RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的異同?？第9頁/共47頁轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域;DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板需解決兩個(gè)問題：第10頁/共47頁

模板和RNA聚合酶的辨認(rèn)、結(jié)合5335結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol——啟動(dòng)子（promoter)RNA聚合酶識(shí)別,結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段高度保守性DNA序列，稱為第11頁/共47頁

保守序列（一致性序列）開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35

區(qū)(Pribnowbox)結(jié)合部位，影響啟動(dòng)子復(fù)合物形成；TATAATPuATATTAPy-10

區(qū)1-30-5010-10-40-205335識(shí)別部位，還決定啟動(dòng)子強(qiáng)度；原核生物啟動(dòng)子（Sextama框）間隔區(qū)第12頁/共47頁

原核生物的轉(zhuǎn)錄起始2DNA雙鏈解開,形成轉(zhuǎn)錄空泡1RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合

3

在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)–

5’-pppGpN

–OH+ppiRNApol-DNA-pppGpN-OH

pppGNTPpppGpN-OHppi起始復(fù)合物:5’-pppG-OH+

NTP第13頁/共47頁53DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶第14頁/共47頁

轉(zhuǎn)錄終止------RNA聚合酶在DNA模板上停止前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來

原核生物的轉(zhuǎn)錄終止子（terminator）1、依賴ρ因子（Rho)

的轉(zhuǎn)錄終止2、不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。第15頁/共47頁TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT

DNA或UUUU˙˙˙˙˙˙CAAUCAA莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA第16頁/共47頁5’pppG5335莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止：1，使RNA聚合酶變構(gòu)2，使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放RNA-pol第17頁/共47頁

真核生物的轉(zhuǎn)錄起始

也需要RNA聚合酶辨認(rèn)、結(jié)合轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，生成起始復(fù)合物。第18頁/共47頁-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始

TATA盒（-30～-25）

CAAT盒(-75)

GC盒(-90)基因

增強(qiáng)子(enhancer)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率RNA聚合酶II啟動(dòng)子第19頁/共47頁DTATAABDNATATAFE

RNA聚合酶與模板DNA的結(jié)合需一系列轉(zhuǎn)錄因子(TF)的參與。RNA聚合酶第20頁/共47頁真核生物的轉(zhuǎn)錄終止——和轉(zhuǎn)錄后加工密切相關(guān)5’------AAUAAA-5’------AAUAAA--Poly(A)mRNA核酸酶-GUGUGUGAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)5’5’3’3’RNA-pol第21頁/共47頁真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工內(nèi)含子（intron）和外顯子（exon）第22頁/共47頁

蛋白質(zhì)的生物合成

——

翻譯第23頁/共47頁翻譯（translation）是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸的三聯(lián)體遺傳密碼翻譯成氨基酸序列，合成多肽鏈的過程，是基因表達(dá)的最終目的。第24頁/共47頁蛋白質(zhì)生物合成體系模板：mRNA

原料：20種編碼氨基酸氨基酸運(yùn)載體：tRNA

場(chǎng)所：核蛋白體酶：氨基酰-tRNA合成酶、轉(zhuǎn)肽酶蛋白質(zhì)因子：起始因子（initiationfactors,IF;eIF）延長(zhǎng)因子（elongationfactors,EF）釋放因子（releasefactors,RF）核蛋白體釋放因子（ribosomalreleasefactors,RRF）第25頁/共47頁一、mRNA是翻譯的直接模板

開放閱讀框架（openreadingframe,ORF）

mRNA從5’→3’方向，從起始密碼到終止密碼的序列，稱為一個(gè)開放閱讀框架。

遺傳密碼（geneticcodon）開放閱讀框架內(nèi)每3個(gè)堿基組成的三聯(lián)體，決定一個(gè)氨基酸，稱為遺傳密碼。第26頁/共47頁遺傳密碼的特點(diǎn)（一）遺傳密碼的連續(xù)性（commaless）（二）簡(jiǎn)并性（degeneracy）（三）擺動(dòng)性（wobble）（四）通用性（universal）（五）偏愛性第27頁/共47頁AUGUGAUAAUAG第28頁/共47頁二、核蛋白體是肽鏈合成的場(chǎng)所

核蛋白體由大、小亞基組成，每個(gè)亞基含有不同的蛋白質(zhì)和rRNA，原核生物和真核生物又各有不同。第29頁/共47頁SD序列（Shine-Dalgarno)

原核生物特有的、位于mRNA上起始密碼子上游的一段富含嘌呤（AGGA)堿基的短序列，是mRNA與核糖體小亞基結(jié)合位點(diǎn)，直接影響翻譯效率，又稱為核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)（ribosomalbindingsite，RBS）。。

第30頁/共47頁

基因表達(dá)調(diào)控（controlofgeneexpression）基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉以及基因活性的增加或減弱等，受著調(diào)節(jié)和控制。

基因表達(dá)(geneexpression)--通過轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)錄后直接產(chǎn)生RNA產(chǎn)物的過程?；虮磉_(dá)調(diào)控第31頁/共47頁順式作用元件（cis-actingelement）

－特異DNA序列

可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA片段。－－非編碼序列；包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、沉默子等。反式作用因子（trans-actingfactor）－蛋白質(zhì)與順式作用元件直接或間接相互作用，能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。

包括轉(zhuǎn)錄因子，RNA聚合酶等。第32頁/共47頁反式作用因子（trans-actingfactor）

激活蛋白(activatorprotein）促進(jìn)轉(zhuǎn)錄；阻遏蛋白(repressorprotein)

抑制轉(zhuǎn)錄；

RNA聚合酶

直接識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子，解開DNA雙螺旋，催化合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；

第33頁/共47頁第二節(jié)原核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)原核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特點(diǎn)操縱子模型的普遍性操縱子—一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)第34頁/共47頁操縱子（operon）：

原核生物的一段DNA序列，由幾個(gè)串聯(lián)排列的功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，加上調(diào)控序列組成的一個(gè)完整的連續(xù)的功能單位。乳糖操縱子

P：?jiǎn)?dòng)子O：操縱基因Z：β-半乳糖苷酶基因Y：通透酶基因A：乙?；D(zhuǎn)移酶基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列第35頁/共47頁細(xì)菌對(duì)乳糖的利用及其相關(guān)的酶:

乳糖(在通透酶作用下進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)）

β半乳糖苷酶（細(xì)菌中少量存在）

異乳糖

β半乳糖苷酶（細(xì)菌中少量存在）

葡萄糖+半乳糖

β半乳糖苷酶（細(xì)菌中少量存在）轉(zhuǎn)乙?；?-乙酰半乳糖第36頁/共47頁乳糖操縱子－細(xì)菌以葡萄糖為能量來源葡萄糖充分時(shí)（優(yōu)先利用）：

與葡萄糖代謝有關(guān)的酶基因---表達(dá)

與其他糖代謝有關(guān)的酶基因---關(guān)閉葡萄糖耗盡時(shí)，乳糖存在：

與乳糖代謝有關(guān)的酶基因

---表達(dá)

與葡萄糖代謝有關(guān)的酶基因---關(guān)閉第37頁/共47頁阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控(negativecontrolofrepressor)

無乳糖(nolactose):lac操縱子處于阻遏狀態(tài)(repression)第38頁/共47頁乳糖代謝基因表達(dá)調(diào)控圖解：(沒有乳糖時(shí))

I

Ｐ

Ｏ

lacZ

lacY

lacA

調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄受阻．阻遏蛋白第39頁/共47頁有乳糖(presenceoflactose)lac操縱子被誘導(dǎo)(derepression,induction)誘導(dǎo)劑(inducer):異乳糖、半乳糖、