11-PCR實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可要求

CNAS-CL036ISO15189認(rèn)可準(zhǔn)則（2012年版）在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用要求介紹2014111日起實(shí)行湖南省臨床檢驗(yàn)中心呂岳峰1范圍 CNAS對分子診斷領(lǐng)域的認(rèn)可要求，包雜交試驗(yàn)（包括原位雜交試驗(yàn)）、核酸電泳分析等。2規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用最新版本（包括修改單）適用于本文件。GB/T20468-2006臨床實(shí)驗(yàn)室定量測定室內(nèi)質(zhì)量控制指南CNAS-RL02能力驗(yàn)證規(guī)則CNSA-CL31內(nèi)部校準(zhǔn)要求臨床技術(shù)操作規(guī)范·2004醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則病理科建設(shè)與管理指南（試行），衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2009〕31號3術(shù)語和定義4管理要求4.1組織和管理責(zé)任4.1.1.2實(shí)驗(yàn)室為獨(dú)立法人單位的，應(yīng)有醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可；實(shí)驗(yàn)有醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2年。4.1.2.5應(yīng)至少有1名具有副高及以上專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，從事分子診斷工作至少5年。4.2質(zhì)量管理體系?4.3文件控制?4.4服務(wù)協(xié)議4.5受委托實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)4.6外部服務(wù)和供應(yīng)4.7咨詢服務(wù)4.8投訴的解決4.9不符合的識別和控制?4.10糾正措施?4.11預(yù)防措施?4.12持續(xù)改進(jìn)?4.13記錄控制4.14評估和審核4.15管理評審5.1人員

5技術(shù)要求5.1.2分子診斷實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱實(shí)驗(yàn)室）專業(yè)技術(shù)職稱、從事分子診斷工作至少3年。 分子診斷得上崗證后方可上崗。 任職資格，并有從事分子病理工作的經(jīng)歷。 認(rèn)可的授權(quán)簽字人事申請認(rèn)可授權(quán)簽字領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)工作至少3年。5.1.3實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少具有2名檢驗(yàn)/檢查人員。5.1.6應(yīng)每年評估員工的工作能力。對新進(jìn)員工在最初62次能力評審，保存評估記錄。 當(dāng)職責(zé)變更時(shí)，或6個(gè)月以上再上崗時(shí)，或政策、程序、崗，并記錄。5.2設(shè)施和環(huán)境條件5.2.1針對性的防護(hù)措施及合適的警告。5.2.2涉及基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室原則上分四個(gè)獨(dú)立的工作區(qū)域：用自動(dòng)分析儀（擴(kuò)增產(chǎn)物閉管檢測），作量而定。上述每個(gè)區(qū)域應(yīng)有充足空間以保證：樣品處置符合分析前、后樣品分區(qū)放置；儀器放置符合維修和操作要求；樣品制備區(qū)放置生物安全柜、離心機(jī)和冰箱等儀器設(shè)備；打印檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)交叉污染的控制。工作區(qū)域應(yīng)符合如下要求：c）實(shí)驗(yàn)室各分區(qū)應(yīng)配置固定和移動(dòng)紫外線燈，波長為254nm臺的60～90cm；e）樣品制備區(qū)應(yīng)配置二級生物安全柜和洗眼器，實(shí)驗(yàn)室附近應(yīng)有噴淋裝置。 用于組織切片、脫蠟、水化、染色等。脫蠟、水化及染色應(yīng)在通風(fēng)設(shè)施中進(jìn)行。?5.2.3用以保存臨床樣品和試劑的設(shè)施應(yīng)設(shè)置目標(biāo)溫度和允許范圍，并記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有溫度失控時(shí)的處理措施并記錄。5.2.6不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具應(yīng)立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔，必要時(shí)進(jìn)行消毒及去污染。 應(yīng)依據(jù)所用分析設(shè)備和實(shí)驗(yàn)過程的要求，制定環(huán)境溫濕度控制要求并記錄應(yīng)有溫濕度失控時(shí)的處理措施并記錄。擴(kuò)增儀應(yīng)配備不間斷電源（UPS）；應(yīng)依據(jù)用途（如：RNA檢測用水），制定適宜的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（如：應(yīng)除RNase），并定期檢測。 分子檢驗(yàn)各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記。進(jìn)入基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室各工作區(qū)應(yīng)照單一方向進(jìn)行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→樣品制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不應(yīng)將工作服帶出。5.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、試劑和耗材5.3.1.1RNA檢測，宜配備－70℃的冷凍設(shè)備。需要時(shí)，配備高速冷凍離心機(jī)。芯。PCR試驗(yàn)用容器應(yīng)可密閉，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不能混用。 電熱恒溫箱、脫蠟缸、水化缸及HE染色缸等。5.3.1.4應(yīng)按國家法規(guī)要求對強(qiáng)檢設(shè)備進(jìn)行檢定。應(yīng)進(jìn)行外部校準(zhǔn)至少對分析設(shè)備的加樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和溫控系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)（時(shí)）。分析設(shè)備和輔助設(shè)備的內(nèi)部校準(zhǔn)應(yīng)符合CNAS-CL《內(nèi)部校準(zhǔn)要求》。 生物安全柜等進(jìn)行校準(zhǔn)。5.3.1.5設(shè)備故障后，應(yīng)首先分析故障原因，如果設(shè)備故障可能影響了測、驗(yàn)證：可校準(zhǔn)的項(xiàng)目實(shí)施校準(zhǔn)驗(yàn)證，必要時(shí)，實(shí)施校準(zhǔn)；質(zhì)控物檢驗(yàn)；與其他儀器或方法比對，偏差符合附錄A.3的要求；以前檢驗(yàn)過的樣品再檢驗(yàn)，偏差符合附錄A.5的要求。5.3.2.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立試劑和關(guān)鍵耗材（如離心管、帶濾芯的吸頭）的驗(yàn)收程序，（宜參考附錄A）。5.3.2.3實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對關(guān)鍵耗材進(jìn)行驗(yàn)收，驗(yàn)收試驗(yàn)至少應(yīng)包括：外觀檢查：肉眼可看出的，如包裝完整性、有效期等； 性能驗(yàn)證率和核酸擴(kuò)增效率、試劑的批間差異、關(guān)鍵耗材的抑制物等。試劑性能驗(yàn)證記錄應(yīng)能反映該批試劑的核酸提取效率和核酸擴(kuò)增效率。驗(yàn)證試劑批間差異和耗材的抑制物A.6要求即可視為滿足要求。特殊情況下，如實(shí)驗(yàn)室懷疑提取試劑有質(zhì)量問題，可采用凝膠電泳試驗(yàn)比較核酸提取物與核酸標(biāo)準(zhǔn)物確認(rèn)核酸片段提取的完整性、260nm紫外波長測定確認(rèn)核酸提取的產(chǎn)率、260nm/280nm比值確認(rèn)核酸提取的純度。用于定性檢驗(yàn)的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進(jìn)行試劑批號驗(yàn)證。求參照附錄A.6要求。方法和要求參照附錄A.6要求。檢驗(yàn)前過程5.4.4.3應(yīng)規(guī)定分子診斷樣品留取的具體要求，如：DNase和/RNase的一次性密閉容器；EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（不受肝素干擾時(shí)除外）；RNA（HCVRNA）擴(kuò)增檢測的血樣品宜進(jìn)行抗凝處理，并盡快分離血漿，以避免RNA離血清。分泌物、拭子、腫瘤組織等樣品留取的注意事項(xiàng)等。5.4.6e基于組織/細(xì)胞學(xué)形態(tài)基礎(chǔ)的分子檢測項(xiàng)目應(yīng)由具有病理診斷資質(zhì)的醫(yī)師確認(rèn)樣品是否滿足檢測要求。5.4.7超長期儲存后的標(biāo)本，使用前應(yīng)再次評估標(biāo)本的完整性。 檢測樣品若為組織，應(yīng)采用10%定液的量和固定時(shí)間應(yīng)符合檢測要求。檢驗(yàn)過程5.5.1.2定量檢測方法和程序的分析性能驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括精密度、正確度、線性、測量和/或可報(bào)告范圍、抗干擾能力等。定性檢測項(xiàng)目驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括測定下限、特異性、準(zhǔn)確度（金標(biāo)準(zhǔn)比較）、抗干擾能力等。驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)經(jīng)過授權(quán)人審核。應(yīng)使用驗(yàn)證過的核酸抽提和純化方法，必要時(shí)進(jìn)行核酸定量。 對產(chǎn)前檢驗(yàn)，在完成分子診斷前應(yīng)保留備份培養(yǎng)物并跟蹤監(jiān)測實(shí)宜由同一實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)；如有足夠的標(biāo)本，應(yīng)從兩份不同標(biāo)本中提取DNA應(yīng)有程序評估并減少這種影響。 應(yīng)有明確和統(tǒng)一的原位雜交（ISH）陽性信號的標(biāo)準(zhǔn)，并建立本實(shí)驗(yàn)室的陽性閾值。組織病理ISH并采用國際通用的評分標(biāo)準(zhǔn)。5.6.2.1總則

檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的保證應(yīng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制程序，定量測定可參照GB/T20468-2006對核酸檢測防污染的具體措施。 DNA質(zhì)量評價(jià)記錄。需要時(shí)，應(yīng)對RNA的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，并選擇合適的“管家”mRNARNARNA質(zhì)量評價(jià)記錄及假陰性率監(jiān)測記錄。 對用于基因突變檢測的石蠟包埋樣品，應(yīng)有病理醫(yī)師從組織形態(tài)細(xì)胞進(jìn)行富集。 因，適當(dāng)時(shí)采取糾正措施。5.6.2.2質(zhì)控物 定性檢測項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和/性質(zhì)控物。如為基因突變、基因多態(tài)性或基因型檢測，則應(yīng)包括最能反映檢測情況的突變或基因型樣品，每批檢測的質(zhì)控至少應(yīng)有一種基因突變或基因型。 質(zhì)控物。5.6.2.3質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)質(zhì)控規(guī)則應(yīng)確保試驗(yàn)的穩(wěn)定性和檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 定量檢測項(xiàng)目質(zhì)控圖應(yīng)包括質(zhì)控結(jié)果、質(zhì)控物名稱、濃度、批控時(shí)的分析處理程序和糾正措施等。定性檢測項(xiàng)目：陰陽性符合預(yù)期。5.6.3.1CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》的要求參加相應(yīng)的能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評。應(yīng)保留參加能力驗(yàn)證/的結(jié)果和證書。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或指定人員應(yīng)監(jiān)控室間質(zhì)評活動(dòng)的結(jié)果，并在結(jié)果報(bào)告上簽字。5.6.3.2通過與其他實(shí)驗(yàn)室（如已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室、使用相同檢測方法的實(shí)驗(yàn)室、使用配套系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室）規(guī)定比對實(shí)驗(yàn)室的選擇原則； 5基因突變或基因型；2次；判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)有≥80%的結(jié)果符合要求。5.6.4實(shí)驗(yàn)室使用兩套及以上檢測系統(tǒng)檢測同一項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)次，20，濃度水平應(yīng)覆蓋測量區(qū)間；應(yīng)定期（15份臨床樣品）進(jìn)行檢驗(yàn)人員的結(jié)果比對、考核并記錄。比對結(jié)果應(yīng)符合附錄A的要求。使用不同生物參考區(qū)間的檢測系統(tǒng)間不宜進(jìn)行比對。 2年。5.7檢驗(yàn)后過程5.7.2原始樣品、核酸提取物和/或核酸擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)規(guī)定保存期，便于復(fù)查。為便于追溯，凝膠圖像和斑點(diǎn)雜交條帶和/或通過掃描、業(yè)要求。5.8結(jié)果報(bào)告5.8.3除了通用要求外，適用時(shí)，分子診斷報(bào)告內(nèi)容還應(yīng)包括方法5.9結(jié)果發(fā)布5.10實(shí)驗(yàn)室信息管理附錄A（規(guī)范性附錄）分子診斷項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)A.1應(yīng)不低于國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方法規(guī)要求。A.2自建檢測系統(tǒng)不精密度要求：以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評評價(jià)界限（0.4對數(shù)值）作為允許總誤差（TEa），重復(fù)性精密度<3/5TEa；中間精密度<4/5TEa。A.354份樣品測量結(jié)果偏倚<7.5%。A.4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析系統(tǒng)定期比對：樣品數(shù)n≥20間，計(jì)算回歸方程，系統(tǒng)誤差應(yīng)<7.5%。A.5留樣再測判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照項(xiàng)目穩(wěn)定性要求選取最長期限樣品，54偏倚<7.5%。A.6試劑批間差異、耗材的抑制物的驗(yàn)收判斷標(biāo)準(zhǔn)：選取5個(gè)舊批號檢測過的樣品，覆蓋測量區(qū)間（值、低值、中值和高值），至少4個(gè)樣品測量結(jié)果偏倚<7.5%，其中陰性和臨界值樣品必須符合預(yù)期。A.7標(biāo)準(zhǔn)可依據(jù)制造商聲明的性能標(biāo)準(zhǔn)而制定。附錄B（規(guī)范性附錄）分子診斷領(lǐng)域申請認(rèn)可項(xiàng)目要求B.1以下分子檢驗(yàn)項(xiàng)目，每一組項(xiàng)目為完整能力項(xiàng)目，如果實(shí)驗(yàn)室目（33項(xiàng)）儀器/方法報(bào)告結(jié)果時(shí)，全部儀器/方法均應(yīng)申請認(rèn)可。肝炎系列：HBV、HCV（實(shí)驗(yàn)室僅