DNA重組技術(shù)的基本工具-

設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設(shè)想三經(jīng)過(guò)多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。1973年，美國(guó)科學(xué)家科恩將兩種不同來(lái)源的DNA分子進(jìn)行體外重組，并首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)，創(chuàng)立了定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。專(zhuān)題1

基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具科技探索之路基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程從科技探索之路中可以看出：說(shuō)明沒(méi)有

的研究成果，沒(méi)有

的創(chuàng)新發(fā)明，基因工程不可能誕生，也不可能迅速崛起。閱讀選修3《現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題》的目錄，找出現(xiàn)代生物科技包括哪些工程？基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、胚胎工程、生態(tài)工程基礎(chǔ)理論技術(shù)什么叫基因工程？基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。一、基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程實(shí)質(zhì)結(jié)果DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平新生物類(lèi)型型和生物產(chǎn)產(chǎn)品剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組（定向）①它是一種種按照人們們?cè)竿?，定定向改造生生物遺傳特特性的技術(shù)術(shù)。②②在DNA分子水平上上進(jìn)行操作作。③③是在在體外進(jìn)行行的人為的的基因重組組。④④一一旦成功，，便可遺傳傳。⑤⑤主要技術(shù)術(shù)是體外DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)術(shù)?；蚬こ痰牡奶攸c(diǎn)：轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)棉普通棉基因工程培培育抗蟲(chóng)棉棉的簡(jiǎn)要過(guò)過(guò)程：上述培育抗抗蟲(chóng)棉的關(guān)關(guān)鍵步驟是是什么？導(dǎo)入普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)重組DNA形成關(guān)鍵步驟一一：關(guān)鍵步驟二二：關(guān)鍵步驟三三：抗蟲(chóng)基因從從蘇云金芽芽孢桿菌細(xì)細(xì)胞內(nèi)提取取出來(lái)形成重組DNA重組DNA導(dǎo)入受體(棉花)細(xì)胞解決培育抗抗蟲(chóng)棉的關(guān)關(guān)鍵步驟需需要哪些工工具？關(guān)鍵步驟一一的工具：：關(guān)鍵步驟二二的工具：：關(guān)鍵步驟三三的工具：：“分子手術(shù)術(shù)刀”——限制性核酸酸內(nèi)切酶“分子縫合合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸輸車(chē)”——運(yùn)載體（一）“分分子手術(shù)刀刀”——限制性核酸酸內(nèi)切酶二、基因操操作的工具具切割DNA的工具是限制性核酸酸內(nèi)切酶，又稱(chēng)限制酶。這類(lèi)酶主要要從原核生生物中分離離純化出來(lái)來(lái)的，迄今今為止已從從近300種不同的微微生物中分分離出了約約4000種限制酶。。（簡(jiǎn)稱(chēng)限制制酶）限制性核酸酸內(nèi)切酶能能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定定核苷酸序序列,并且使每一一條鏈中特特定部位的的兩個(gè)核苷酸酸之間的磷酸二酯鍵鍵斷開(kāi)。

T磷酸二酯鍵鍵1234512345AAATTGCCTTAAG識(shí)別別雙雙鏈鏈DNA分子子的的某某種種特定定的的核核苷苷酸酸序序列列，并并且且使使每每一一條條鏈鏈中中特特定定部部位位的的兩兩個(gè)個(gè)核核苷苷酸酸之之間間的的磷酸酸二二酯酯鍵鍵斷開(kāi)開(kāi)。。主要要是是從從原核核生生物物中分分離離純純化化出出來(lái)來(lái)的的。。4000種。。1、來(lái)來(lái)源源：：2、種種類(lèi)類(lèi)：：3、作作用用：：4、結(jié)結(jié)果果：：形成成兩兩種種末末端端（一一））限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶———“分分子子手手術(shù)術(shù)刀刀””黏性性末末端端平末末端端能將將外外來(lái)來(lái)的的DNA切斷斷，由由于于這這種種切切割割作作用用是是在在DNA分子子內(nèi)內(nèi)部部進(jìn)進(jìn)行行的的，，故故名名限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶。。大腸腸桿桿菌菌的的一一種種限限制制酶酶（（EcoRⅠⅠ）能能識(shí)識(shí)別別GAATTC序列列，，并并在在G和A之間間切切開(kāi)開(kāi)。。限制制酶酶限制制酶酶什么么叫叫黏黏性性末末端端？？當(dāng)限限制制酶酶在在它它識(shí)識(shí)別別的的中中心心軸軸線(xiàn)線(xiàn)兩兩側(cè)側(cè)將將DNA兩條條鏈鏈切切開(kāi)開(kāi)時(shí)時(shí)，，切切開(kāi)開(kāi)的的DNA兩條條單單鏈鏈的的切切口口，帶有有幾幾個(gè)個(gè)伸伸出出的的核核苷苷酸酸，它們們之之間間正正好好互互補(bǔ)補(bǔ)配配對(duì)對(duì)，這這樣樣的的切切口口叫叫黏性性末末端端。什么么叫叫平平末末端端？？當(dāng)限限制制酶酶在它它識(shí)識(shí)別別序序列列的的中中心心軸軸線(xiàn)線(xiàn)處處切切開(kāi)開(kāi)時(shí)時(shí)，，切開(kāi)開(kāi)的的DNA兩條條單單鏈鏈的的切切口口，，是是平整整的，，這這樣樣的的切切口口叫叫平末末端端。DNA分子子經(jīng)經(jīng)限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶切切割割產(chǎn)產(chǎn)生生的的DNA片段段末末端端通通常常有有哪哪兩兩種種形形式式？？有黏性性末末端端和平末末端端兩種種。。那么么，，在在中中心心軸軸線(xiàn)線(xiàn)兩兩側(cè)側(cè)的的雙雙鏈鏈DNA上的的堿堿基基有有什什么么特特點(diǎn)點(diǎn)呢呢？？不管管是是產(chǎn)產(chǎn)生生黏黏性性末末端端還還是是平平末末端端，，在在中中心心軸軸線(xiàn)線(xiàn)兩兩側(cè)側(cè)的的雙雙鏈鏈DNA上的的堿基基是是旋旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)對(duì)對(duì)稱(chēng)稱(chēng)的的。。要想想獲獲得得某某個(gè)個(gè)目目的的基基因因必必須須要要用用限限制制酶酶切切幾幾個(gè)個(gè)切切口口？？可可產(chǎn)產(chǎn)生生幾幾個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端？？一一個(gè)個(gè)目目的的基基因因有有幾幾個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端？？要切切兩兩個(gè)個(gè)切切口口，，產(chǎn)產(chǎn)生生四四個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端，，兩兩個(gè)個(gè)。。如果果把把兩兩種種來(lái)來(lái)源源不不同同的的DNA用同同一一種種限限制制酶酶來(lái)來(lái)切切割割，，會(huì)會(huì)怎怎樣樣呢呢？？會(huì)產(chǎn)產(chǎn)生生相相同同的的黏黏性性末末端端。。是不不是是把把兩兩者者的的黏黏性性末末端端黏黏合合起起來(lái)來(lái)，，這這樣樣就就形形成成了了重重組組的的DNA分子子了了?實(shí)際際還還不不夠夠,還需需要要DNA連接接酶酶進(jìn)進(jìn)行行連連接接。。一種種限限制制酶酶只只能能識(shí)識(shí)別別和和切切斷斷特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列，，這這是是由由限限制制酶酶的的性性質(zhì)質(zhì)（（專(zhuān)一性或或特異性性）決定的的。中軸線(xiàn)思考：①①限制酶酶所識(shí)別別的序列列有什么么特點(diǎn)？？限制酶所所識(shí)別的的序列，，都可以以找到一一條中心心軸線(xiàn)，，中心軸軸線(xiàn)兩側(cè)側(cè)的雙鏈鏈DNA上的堿基是旋旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)稱(chēng)的。②限制酶酶在DNA的任何部部位都能能將DNA切開(kāi)嗎？？問(wèn)題探討討：①限制酶酶從哪里里尋找？？提示：聯(lián)聯(lián)想以前前學(xué)過(guò)的的內(nèi)容───噬菌菌體侵染染細(xì)菌的的實(shí)驗(yàn)，，進(jìn)而認(rèn)認(rèn)識(shí)細(xì)菌菌等單細(xì)細(xì)胞生物物容易受受到自然然界外源源DNA的入侵。。那么這這類(lèi)原核核生物之之所以長(zhǎng)長(zhǎng)期進(jìn)化化而不絕絕滅，有有何保護(hù)護(hù)機(jī)制？？原核生物物在長(zhǎng)期期的進(jìn)化化過(guò)程中中形成了了一套完完善的防防御機(jī)制制，以防防止外來(lái)來(lái)病原物物的侵害害。限制制酶就是是細(xì)菌的的一種防防御性工工具，當(dāng)當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，，會(huì)利用用限制酶酶將外源源DNA切割掉，，以保證證自身的的安全。。所以，，限制酶酶在原核核生物中中主要起起到切割割外源DNA、使之失失效，從從而達(dá)到到保護(hù)自自身的目目的。②迄今為為止，基基因工程程中使用用的限制制酶絕大大部分都都是從細(xì)細(xì)菌或霉霉菌中提提取出來(lái)來(lái)的，聯(lián)聯(lián)系你已已有的知知識(shí)，想想一想，，為什么么細(xì)菌中中限制酶酶不剪切切細(xì)菌本本身的DNA？是因?yàn)槲⑽⑸镌谠陂L(zhǎng)期進(jìn)進(jìn)化過(guò)程程中，含含有某種種限制酶酶的細(xì)胞胞，其DNA分子中或或者不具具備這種種限制酶酶的識(shí)別別切割序序列，或者通過(guò)過(guò)甲基化化酶將甲甲基轉(zhuǎn)移移到所識(shí)識(shí)別序列列的堿基基上，使限制制酶不能能將其切切開(kāi)。這這樣，盡盡管細(xì)菌菌中含有有某種限限制酶也也不會(huì)使使自身的的DNA被切斷，，并且可可以防止止外源DNA的入侵．．將切下來(lái)來(lái)的DNA片段拼接接成新的的DNA分子,是靠DNA連接酶來(lái)來(lái)完成的的。1967年，世界界上幾個(gè)個(gè)實(shí)驗(yàn)室室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)了一種種能夠?qū)蓷lDNA鏈連接起起來(lái)的酶酶，稱(chēng)之之DNA連接酶。。根據(jù)酶的的來(lái)源不不同，可可以將這這些酶分分為兩類(lèi)類(lèi)：一種種是從大大腸桿菌菌中分離離得到的的，稱(chēng)為為E.coliDNA連接酶;另一類(lèi)是是從T4噬菌體中中分離出出來(lái)的,稱(chēng)為T(mén)4DNA連接酶。這兩類(lèi)酶酶都是將將雙鏈DNA片段“縫合”起起來(lái)，恢復(fù)被限制酶酶切開(kāi)的的兩個(gè)核核苷酸之之間的磷酸二酯酯鍵，但這兩兩種酶的的作用有有所差別別：E.coliDNA連接酶只只能將雙雙鏈DNA片段互補(bǔ)補(bǔ)的黏性性末端之之間連接接起來(lái)，，不能將雙雙鏈DNA片段平末末端之間間進(jìn)行連連接。而而T4DNA連接酶既既可以““縫合””雙鏈DNA片段互補(bǔ)補(bǔ)的黏性性末端，，又可以以“縫合合”雙鏈鏈DNA片段的平平末端，，但連接平平末端之之間的效效率比較較低。（二）““分子子縫合針針”——DNA連接酶1、種類(lèi)：：兩類(lèi)E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

磷酸二酯酯鍵DNA連接酶可可把黏性性末端之之間的縫縫隙“縫合”起來(lái)，，即把梯梯子兩邊邊扶手的的斷口連連接起來(lái)來(lái)，這樣樣一個(gè)重重組的DNA分子就形形成了。。2、作用部部位：基因工程程中所用用的連接接酶有兩兩種：一一種是E·coliDNA連接酶。。另一種種是T4DNA連接酶。。這兩種種連接酶酶都是連連接雙鏈鏈DNA的缺口，，不能連連接單鏈鏈DNA。DNA連接酶和和DNA聚合酶都都是形成成磷酸二二酯鍵，，那么，，二者的差差別主要要表現(xiàn)在在什么地地方呢？DNA連接酶與與DNA聚合酶是是一回事事嗎？為為什么？？不是。⑴DNA聚合酶只只能將單單個(gè)核苷苷酸加到到已有的的核酸片片段的末末端上，，形成磷磷酸二酯酯鍵；而DNA連接酶是是在兩個(gè)個(gè)DNA片段之間間形成磷磷酸二酯酯鍵，不不是在單單個(gè)核苷苷酸與DNA片段之間間形成磷磷酸二酯酯鍵。⑵DNA聚合酶是是以DNA一條鏈為為模板，，將單個(gè)個(gè)核苷酸酸通過(guò)磷磷酸二酯酯鍵形成成一條與與模板鏈鏈互補(bǔ)的的子鏈；；而DNA連接酶是是將DNA雙鏈上的的兩個(gè)缺缺口同時(shí)時(shí)連接起起來(lái)。因因此DNA連接酶不不需要模模板。二者雖然然化學(xué)本本質(zhì)都是是蛋白質(zhì)質(zhì)，但組組成和性性質(zhì)各不不相同。。外源基因因(如抗蟲(chóng)基基因)怎樣才能能導(dǎo)入受受體細(xì)胞胞(如棉花細(xì)細(xì)胞)？導(dǎo)入過(guò)程程需要運(yùn)運(yùn)輸工具具——載體。載體的作作用有哪哪些？作用一：：作為運(yùn)運(yùn)載工具具，將外外源基因因(抗蟲(chóng)基因因)轉(zhuǎn)移到受受體細(xì)胞胞(棉花細(xì)胞胞)中去。作用二：：利用載載體在受受體細(xì)胞胞(棉花細(xì)胞胞)內(nèi)，對(duì)外外源基因因(抗蟲(chóng)基因因)進(jìn)行大量量復(fù)制。。三、基基因進(jìn)入入受體細(xì)細(xì)胞的載載體——“分子運(yùn)運(yùn)輸車(chē)””用什么方方法才能能將外源基因因（目的基因因）送入受受體細(xì)胞胞中呢？？質(zhì)粒是基基因工程程最常用用的載體體。最常用的的質(zhì)粒是是大腸桿桿菌質(zhì)粒粒。質(zhì)粒是一一種裸露露的、結(jié)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單單、獨(dú)立于細(xì)細(xì)菌擬核核DNA之外，并具有有自我復(fù)制制能力的很小雙鏈環(huán)狀狀DNA分子。質(zhì)粒DNA上有一個(gè)個(gè)至多個(gè)個(gè)限制酶切切割位點(diǎn)點(diǎn)，供外源源DNA片段（基基因）插插入其中中。攜帶外源源DNA片段的質(zhì)質(zhì)粒進(jìn)入入受體細(xì)細(xì)胞后，，在細(xì)胞胞中進(jìn)行行自我復(fù)復(fù)制，或或整合到到染色體體DNA上，隨染染色體DNA進(jìn)行同步步復(fù)制。。質(zhì)粒DNA上有特殊殊的標(biāo)記基因因，如四環(huán)環(huán)素抗性性基因、、氨卞青青霉素抗抗性基因因等標(biāo)記記基因，，供重組組DNA的鑒定和和選擇。。在基因工工程使用用的載體體除質(zhì)粒外，還有有λ噬菌體的的衍生物物、動(dòng)植物病病毒等。它們來(lái)源源不同，，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制以及插入片段段大小上也有很很大差別別。這些基因因工程載載體的作作用，就就相當(dāng)于于一種運(yùn)運(yùn)輸工具具，因此此將它們們比喻為為“分子子運(yùn)輸車(chē)車(chē)”。將外源基基因送入入受體細(xì)細(xì)胞。1、作用：：2、條件：：⑴能夠在宿宿主細(xì)胞胞中復(fù)制并穩(wěn)定地地保存。⑵載體DNA必須有一一個(gè)或多多個(gè)限制酶切切點(diǎn)，以便目目的基因因插入到到載體上上去。⑶具有某些些標(biāo)記基因因，便于進(jìn)進(jìn)行篩選。⑷載體DNA必須是安全的,不會(huì)對(duì)受體體細(xì)胞有害害。⑸載體DNA分子大小應(yīng)適合合,以便提取和和在體外進(jìn)進(jìn)行操作。。3、常用種類(lèi)類(lèi)：質(zhì)粒、λ噬菌體衍生生物和一些些動(dòng)植物病病毒。（三）基因因進(jìn)入受體體細(xì)胞的載載體——“分子運(yùn)輸輸車(chē)”1.重組DNA不能復(fù)制，，就可能丟丟失。2.沒(méi)有一個(gè)至至多個(gè)限制酶的切切割位點(diǎn)，就不能進(jìn)進(jìn)行DNA的重組。3.載體上沒(méi)有有沒(méi)有標(biāo)記記基因，我我們用肉眼眼又看不到到載體是否否真正進(jìn)入入，鑒定困困難。4.載體必須對(duì)對(duì)細(xì)胞無(wú)害害。不能有有害于受體體細(xì)胞，影影響其生命命活動(dòng)的正正常進(jìn)行。。原因：大腸桿菌的的質(zhì)粒：最常用的質(zhì)質(zhì)粒是大腸腸桿菌的質(zhì)質(zhì)粒，其中中含有標(biāo)記記基因，如如四環(huán)素抗抗性基因、、氨卞青霉霉素的抗性性基因。質(zhì)質(zhì)粒的存在在與否對(duì)宿宿主細(xì)胞生生存沒(méi)有影影響，能在在宿主細(xì)胞胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)復(fù)制。質(zhì)粒