實(shí)驗(yàn)一動物細(xì)胞培養(yǎng)液消化液和冷凍液的配制

實(shí)驗(yàn)一動物細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制培養(yǎng)液：維持動物細(xì)胞生存和生長所需要的基本溶液

平衡鹽溶液（BalancedSaltSolution,BSS）用作洗滌組織、細(xì)胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液天然培養(yǎng)基（NaturalMedium）主要來自動物體液（如血清）或組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。在細(xì)胞培養(yǎng)中使用最早，也最有效。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。

合成培養(yǎng)基（SyntheticMedium）根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，人工模擬合成，配方恒定。

優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。需補(bǔ)充部分天然培養(yǎng)基，多用血清，效果更好。消化液：分離組織、分散細(xì)胞的細(xì)胞分離液胰蛋白酶液：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞分散常用濃度為0.25%

血清可終止其對細(xì)胞的消化作用

EDTA液：鰲合Ca2+、Mg2+，使細(xì)胞分離，對細(xì)胞毒性小常用濃度為0.02%冷凍液：用于細(xì)胞的冷凍保存在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)液中加入一定劑量的血清和冷凍保護(hù)劑，如二甲亞砜（DMSO）、甘油或乙二醇。

冷凍保護(hù)劑可使冰點(diǎn)降低，提高細(xì)胞膜對水的通透性，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1細(xì)胞的營養(yǎng)需要基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸，維生素，碳水化合物，無機(jī)離子。促生長因子等物質(zhì)：血清中含多種促細(xì)胞生長所需的物質(zhì)。2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度：37℃

氣體：O2和CO2，CO2常用濃度為5%pH值：7.2-7.4

滲透壓：260－320mmol/L3無污染及無毒常用實(shí)驗(yàn)用品培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶，血清瓶，吸管，離心管，凍存管超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀培養(yǎng)瓶血清瓶培養(yǎng)板配制培養(yǎng)液必須使用三蒸水或Millipore超純水，不可用無離子水配制。純水儀全自動高壓滅菌鍋濾器

原理用比細(xì)菌直徑(一般為0.5-5μm)小的微孔濾膜(直徑0.22μm)將細(xì)菌從培養(yǎng)液中除去，實(shí)際上為除菌而非滅菌。CO2培養(yǎng)箱

設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)蒸餾水槽中滅菌蒸餾水3000毫升以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。倒置顯微鏡液氮罐1.浸泡（自來水）:初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。2.刷洗（洗滌液）：刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。3.酸泡（24小時(shí)）：浸泡在由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成的清潔液中。浸泡時(shí)間一般為過夜，不應(yīng)少于6小時(shí)。4.沖洗：需流水沖洗10次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，50℃烘干備用。常用玻璃器皿清洗基本步驟：洗瓶子消毒培養(yǎng)液抽濾除菌分裝培養(yǎng)液質(zhì)量鑒定水：三蒸水或Millipore超純水，不可用無離子水配制。細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制配洗滌液1600、消化液300配培養(yǎng)液1600、基礎(chǔ)液剩余除菌保存冷凍液以后再配用4袋DMEMDMEM基礎(chǔ)液配方（1000ml）DMEM13.5g（一個(gè)包裝的干粉培養(yǎng)基）NaHCO33.7gHEPES2.38g青霉素0.1g鏈霉素0.075g

調(diào)節(jié)pH值至7.2

加水定容至1L用無菌0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于無菌血清瓶中4℃冰箱保存。消化液DMEM基礎(chǔ)液＋0.25％胰蛋白酶(trypsin)＋0.02％EDTA-Na2洗滌液DMEM基礎(chǔ)液＋5％胎牛血清（終濃度）培養(yǎng)液DMEM基礎(chǔ)液＋10％胎牛血清（終濃度）用無菌0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于無菌血清瓶中4℃冰箱保存。注意事項(xiàng)1.由于培養(yǎng)液是細(xì)胞賴以生存的環(huán)境，制備過程要操作嚴(yán)格，避免混入雜質(zhì)，使用的成分應(yīng)精心選擇，必須用分析純試劑。2.配制培養(yǎng)液時(shí)必須使用干凈的藥匙，在稱取完一種試劑后必須用干凈紙擦拭干凈，在條件允許時(shí)每種試劑單獨(dú)使用一把藥匙，避免不同試劑間的交叉混合，影響培養(yǎng)效果。3.所有存放培養(yǎng)液的容器都必須事先嚴(yán)格清洗和高壓滅菌；制備好的培養(yǎng)液要標(biāo)注培養(yǎng)液名稱、配制日期，并按不同培養(yǎng)液的要求妥善貯存。4.使用非一次