實(shí)驗(yàn)九、十 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)課件

實(shí)驗(yàn)九酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-ELISA

實(shí)驗(yàn)十IgG的分離和純化程燕2014年6月9日實(shí)驗(yàn)九酶聯(lián)免疫吸附試

（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、種類和用途。

2.學(xué)習(xí)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。

3.了解HBsAg陽(yáng)性的意義。實(shí)驗(yàn)原理

將已知抗體（或抗原）結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原）按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體（或抗原）發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)原理ELISA的基本原理有三條：

（1）抗原或抗體能以物理性（疏水性）地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；（2）抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)原理常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)有間接法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗體夾心法用于抗原及半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測(cè)抗原和一定量的已知酶標(biāo)抗原，使二者競(jìng)爭(zhēng)地與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過(guò)洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。固相抗體EEE酶標(biāo)抗原待測(cè)抗原E底物E顯色反應(yīng)（弱）固相抗體EEE酶標(biāo)抗原底物顯色反應(yīng)（強(qiáng)）EEEEEEELISA-競(jìng)爭(zhēng)法

ELISA-雙抗體夾心法雙抗體夾心法常用于檢測(cè)抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體及底物溶液進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)抗體固相抗體待測(cè)抗原EEE

雙抗體夾心法檢測(cè)抗原實(shí)驗(yàn)材料1、乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒定性檢測(cè)人血清或血漿中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包括：HBsAg特異性抗體（一抗）已包被于酶標(biāo)板上

HBsAg陰、陽(yáng)性血清各1份、酶標(biāo)抗體（二抗）1份，顯色劑A、B各1份，終止液1份，洗滌液1份，2、待檢血清5份3、微量加樣器（10-100ul）及匹配的槍頭4、廢液缸注意：有污染性。酶：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)底物：3,3‘,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在辣根過(guò)氧化物酶催化下，TMB會(huì)產(chǎn)生可溶性藍(lán)色產(chǎn)物。使用2M

H2SO4終止反應(yīng)，在

450nm測(cè)定吸光度。結(jié)果判斷

1、定性：夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。2、P/N值≥2.1者判為HBsAg陽(yáng)性；P/N值＜2.1者判為陰性。介于中間為可疑。S：待測(cè)樣本OD值COV：cut-offvalue=NCx+0.100NCx：陰性對(duì)照OD值的均值陽(yáng)性判定值=S/COV≧1.0：陽(yáng)性﹤1.0：陰性實(shí)驗(yàn)十IgG的分離和純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)踐IgG分離純化過(guò)程了解分離、純化抗體的原理比較成年牛血清與新生牛血清中IgG的含量（眼觀）實(shí)驗(yàn)原理利用蛋白質(zhì)鹽析原理，分離血清中的IgG:

不同蛋白質(zhì)在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同，因此，可利用不同濃度的鹽溶液使血清中的各個(gè)蛋白質(zhì)成分分別析出。一般pH7.0時(shí)，50％硫酸銨飽和度可將所有的5種Ig（球蛋白）沉淀出來(lái)。33％飽和度大部分IgG可沉淀出來(lái)。意義：制備出的純化IgG，可用于酶標(biāo)抗體或熒光抗體的制備。實(shí)驗(yàn)器材1．動(dòng)物抗血清：成年牛血清、新生牛血清2．硫酸銨飽和溶液、0.01mol/L的PBS3．冰箱、離心機(jī)、電磁攪拌器、天平、尼龍繩等。

實(shí)驗(yàn)步驟1.取xml血清（2ml），加等量0.01mol/L的PBS稀釋，攪拌下逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液2Xml（4ml），邊加邊攪拌，4℃靜置30分鐘以上，使其充分沉淀。2.離心：3000～4000r/min離心20min，棄上清。3.以0.01mol/L的PBS溶解沉淀至Xml（5ml），再逐滴加入飽和(NH4)2SO4X/2ml（2.5ml)。置4℃，30～60分鐘。4.再離心：3000r～4000r/min離心20min，棄上清。5.重復(fù)上述第3、