PCR常見問題分析及對策

PCR常見問題分析及對策（無擴增產(chǎn)物、非特異性擴增、拖尾、假陽性）問題1：無擴增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無原因：模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短對策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間M樣品樣品正對照問題2：非特異性擴增現(xiàn)象：條帶與預(yù)計的大小不一致或者非特異性擴增帶原因：引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多對策：重新設(shè)計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)問題3:拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。原因：模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+度偏高循環(huán)次數(shù)過多對策：純化模板更換Buffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)問題4：假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交*污染對策：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。炫口

精口口假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設(shè)計引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93°C變性，65C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8:1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul2X連接液,50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？A） 涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B） 轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ngDNA，用SOC稀釋到1000u后含10ngDNA，用1/10鋪板，共用1ngDNA。轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10（3次方）ng/鋪板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低。C） 如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生＞20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801,M1804,M1794）質(zhì)量標準好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4DNA連接酶替換。D） 用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生〉20-40藍斑，沒有菌落或少有菌落，連接有問題。對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？A） 連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4oC過夜。B） 插入片段帶有污染，使3'-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy載體3'-T缺失。C） 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。D） 帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-TEasy載體克隆所需。加TaqDNA聚合酶和核普酸可在末端加A。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資料（TM042）。E） 高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞PCR疑難解答當PCR結(jié)果不甚滿意時，首先檢查以下幾方面并遵照執(zhí)行：將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。當酶反應(yīng)混合物以70C"熱啟動”開始循環(huán)時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。對于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進行預(yù)變性，后加模板進行正常PCR擴增。沒有擴增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA,則按上述提示濃度補加MgCl2，因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。檢查模板和引物的用量。增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。泳道中出現(xiàn)模糊條帶：減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過68°C。重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物。其他值得注意的條件：建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92C時不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/LMgCl2:350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2:500mmol/LdNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴增片段至10kb。要擴增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻。降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進行長片段PCR擴增時，引物長度一般為24~34個核普酸，溶點在60~68C間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴增的影響。變性：第一步變性在94C下進行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（94C下進行20--3。秒），除非模板中富含GC,則95C下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段終長度超過12kb時，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。延伸：68--72C下進行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統(tǒng)擴增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A,因此建議采用T/A克隆。若要進行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補平后再進行。測序時因酶的混合物帶有3'^5'外切酶活性，用Sanger方法進行測序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。引物設(shè)計：一般長度20-30bp;至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)；引物對的Tm值應(yīng)該接近。也可下列圖示提示找到解決問題的突破口：

PCR實驗操作程序1.在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣:反應(yīng)物加樣順序體積叫）終濃度去離子水129.410XBufferB251X4XdNTP混合物35各200pmol/LMgCl/31.5mmol/L有義引物52.60.25pmol/L反義引物62.60.25pmol/L模板720.1瞄TaqDNA聚合酶80.41unit用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50〃礦物油。每加一管換一次Tip。振蕩每只管，然后短暫離心。將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中，按下列程序開始循環(huán)：預(yù)變性94°C4分鐘1次變性94°C1分鐘退火37-65C1分鐘延伸72C1分鐘循環(huán)30次終延伸72C7分鐘1次保存4C將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果。電泳條件：60-80V,15-20分鐘。紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。1.假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：①模板中含有Taq酶抑制劑，②在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。③模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，有可能是模板核酸提取過程出了毛病，可使用陽性對照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul,應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2,離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：炫口精品①必要時重新設(shè)計引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法93°C變性，65°C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2,濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR常見問題的精辟總結(jié)--耶魯大學(xué)TroubleshootingforPCRandmultiplexPCRTroubleshootingdiscussionisbasedonthePCRprotocolasdescribedinthetablebelow.Allreactionsarerunfor30cycles.COMPONENTVOLUMEFINALCONCENTRATION1.autoclavedultra-filteredwater(pH7.0)20.7rL-2.10xPCRBuffer*2.5rL1x3.dNTPsmix(25mMeachnucleotide)0.2rL200p.M(eachnucleotide)4.primermix(25pmoles/^Leachprimer)0.4rL0.4[xM(eachprimer)5.TaqDNApolymerase(nativeenzyme)0.2rL1Unit/25[xL6.genomicDNAtemplate(100ng/^L)1.0rL100ng/25[xL*The10xPCRbuffercontains:500mMKCl;100mMTris-HCl(pH8.3);15mMMgCl2(thefinalconcentrationsoftheseingredientsinthePCRmixare:50mMKCl;10mMTris-HCl;1.5mMMgCl2).SOLUTIONSQUESTIONSSOLUTIONS1.Iget(many)longerunspecificproducts.DecreaseannealingtimeWhatcanIdo? IncreaseannealingtemperatureDecreaseextensiontimeDecreaseextensiontemperatureto62-68°CIncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mM.IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.TakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheabove2.Iget(many)shorterunspecificproducts.WhatIncreaseannealingtemperaturecanIdo?IncreaseannealingtimeIncreaseextensiontimeIncreaseextensiontemperatureto74-78°CDecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mMIncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstantTakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheabove3.Reactionwasworkingbefore,butnowIcan'tMakesureallPCRingredientsaretakeninthereaction(buffer,template,getanyproduct.Taq,etc)ChangethedNTPsolution(verysensitivetocyclesofthawingandfreezing,especiallyinmultiplexPCR)Ifyoujustboughtnewprimers,checkfortheirreliability(badprimersynthesis?)IncreaseprimeramountIncreasetemplateamountDecreaseannealingtemperatureby6-10°Candcheckifyougetanyproduct.Ifyoudon't,checkallyourPCRingredients.Ifyoudogetproducts(includingunspecificones)reactionconditionsasdescribedabove.Combinesome/alloftheabove4.MyPCRproductisweak.IsthereawaytoGraduallydecreasetheannealingtemperaturetothelowestpossible.increasetheyield?IncreasetheamountofPCRprimerIncreasetheamountofDNAtemplateIncreasetheamountofTaqpolymeraseChangebuffer(KCl)concentration(higherifproductislowerthan1000bporlowerifproductishigherthan1000bp)Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8[xg/^Lfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerol.Checkprimersequencesformismatchesand/orincreasetheprimerlengthby5nucleotidesCombinesome/alloftheabove5.MytwoprimershaveverydifferentmeltingAneasysolutionistoincreasethelengthoftheprimerwithlowTm.If精品locus.WhatcanIdotoimprovePCRamplification?locus.WhatcanIdotoimprovePCRamplification?temperatures(Tm)butIcannotchangetheiryouneedtokeepthesizeoftheproductconstant,addafewbasesatthe3'end.Ifsizeisnotaconcern,addafewbasesateitherthe3'orthe5'endofthatprimer.6.IhaveanumberofprimerpairsIVerylikely,yes.wouldliketousetogether.CanIrunaTryamplifyalllociseapratelyusingthesamePCRprogram.IfoneoftheprimermultiplexPCRwiththem?.How?pairsyieldsunspecificproducts,keepthecyclingconditionsconstantandchangeotherparametersasmentionedabove(#1and#2).Mixequimolaramountsofprimersandrunthemultiplexreactioneitherinthesamecyclingconditionsorbydecreasingonlytheannealingtemperatureby4°C.Ifsomeofthelociareweakornotamplified,readbelow!!7.HowmanylocicanIamplifyinDifficulttosay.Theauthorhasroutinelyamplifiedfrom2to14loci.multiplexPCRatthesametime?Literaturedescribesupto25lociorso.8.OneorafewlociinmymultiplexThefirstchoiceshouldbeincreasingtheamountofprimerforthe"weak"lociatthereactionareveryweakorinvisible.sametimewithdecreasingtheamountofprimerforalllocithatcanbeamplified.Howcanamplifythem?Thebalancebetweentheseamountsismoreimportantthantheabsolutevaluesused!!.Checkprimersequencesforprimer-primerinteractions9.ShortPCRproductsinmyIncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2concentrationatmultiplexreactionareweak.Howcan1.5-2mMIimprovetheiryield?DecreasedenaturingtimeDecreaseannealingtimeandtemperatureDecreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe"weak"lociwhiledecreasingtheamountforthe"strong"loci.Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8[xg/^Lfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheabove10.LongerPCRproductsinmyDecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2concentrationatmultiplexreactionareweak.Howcan1.5-2mMIimprovetheiryield?IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.IncreasedenaturingtimeIncreaseannealingtimeDecreaseannealingtemperatureIncreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe"weak"lociwhiledecreasingtheamountforthe"strong"lociAddadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8Xg/xLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheabove11.AllproductsinmyDecreaseannealingtimeinsmallsteps(2°C)multiplexreactionareweak.Decreaseextensiontemperatureto62-68°CHowcanIimprovetheyield?IncreaseextensiontimeIncreasetemplateconcentrationIncreaseoverallprimerconcentrationAdjust