生物化學(xué)課件34 DNA的復(fù)制和修復(fù)

本章主要內(nèi)容一、DNA的半保留復(fù)制二、DNA復(fù)制的起點與方向三、DNA的半不連續(xù)復(fù)制四、與DNA復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)五、大腸桿菌DNA的復(fù)制過程六、復(fù)制起始的時序控制七、真核生物DNA復(fù)制特點八、DNA損傷的修復(fù)目的要求第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)

1.掌握遺傳信息傳遞的中心法則。

2.

掌握DNA復(fù)制的一般規(guī)律：DNA的半保留復(fù)制、

DNA的半不連續(xù)復(fù)制的概念。

3.

了解三種大腸桿菌DNA聚合酶的催化特性及其功用；了解原核生物DNA的復(fù)制過程。

4.

了解使DNA損傷的因素；DNA損傷的修復(fù)機制：錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、直接修復(fù)、重組修復(fù)及傾向差錯的修復(fù)的過程及過程所需要的酶類；了解DNA損傷修復(fù)的意義。目的要求第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)1964-1970發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉(zhuǎn)錄

1953年，Watson和Crick提出中心法則：遺傳信息的單向流動。

中心法則：病毒（復(fù)制）復(fù)制轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)翻譯逆轉(zhuǎn)錄RNA的復(fù)制存在于RNA病毒

DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序，并通過DNA的復(fù)制由親代傳遞給子代。在后代的生長發(fā)育過程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA,然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)Reversetranscription中心法則圖示

復(fù)制：以親代DNA或RNA為模板，根據(jù)堿基配對的原則，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。幾個基本概念：

逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過程。

翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的氨基酸順序的過程。

轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則合成RNA，即將DNA所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)一、DNA的半保留復(fù)制2.半保留復(fù)制的實驗證據(jù):1.定義：

1958年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復(fù)制。

以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)TestingModelsforDNAreplicationMatthewMeselsonandFranklinStahl(1958)DNA復(fù)制的可能方式全保留與全新復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制DNA半保留復(fù)制圖示：半保留復(fù)制的證明：

Meselson

和Stahl將同位素15N標(biāo)記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌的DNA都帶上15N的標(biāo)記，然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進行氯化銫密度梯度離心，實驗證明了DNA的半保留復(fù)制。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度親代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子二代DNA(15N～14N，14N～14N1:1)子三代DNA(15N～14N，14N～14N1:3)子四代DNA(15N～14N，14N～14N1:7)親代DNA與子二代DNA的混合物親代DNA與子四代DNA的混合物復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖

(Cairns實驗)將3H-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA，經(jīng)過近兩代的時間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA。用溶菌酶把細胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分占整個染色體的三分之二，其中一條雙鏈（B

）僅有一股鏈?zhǔn)菢?biāo)記的，另外一股雙鏈（A

）的兩股鏈都是標(biāo)記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長約為1100微米。ABC環(huán)狀DNA的復(fù)制ABC復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖DNA的半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：

DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質(zhì)。

DNA的半保留復(fù)制表明了DNA在代謝上的穩(wěn)定性，是保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代必要措施。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)二、DNA復(fù)制的起點與方向雙向復(fù)制單向復(fù)制復(fù)制中的DNA

復(fù)制原點復(fù)制叉第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)DNA復(fù)制的主要方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個復(fù)制起點，雙向復(fù)制）3不同位置D-環(huán)式復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNA：兩條鏈的復(fù)制起點不同位置，且復(fù)制不同步）真核細胞線狀染色體DNA的復(fù)制方式（多個復(fù)制起點，雙向復(fù)制）單向滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）DNA的幾種復(fù)制方式親代雙鏈（或單鏈）DNA的一條鏈在DNA復(fù)制起點處被切開，其5'端游離出來。DNA聚合酶Ⅲ便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。當(dāng)復(fù)制向前進行時，親代DNA上被切斷的5'端繼續(xù)游離下來，并且很快被單鏈結(jié)合蛋白所結(jié)合。因為5'端從環(huán)上向下解鏈的同時伴有環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)繞其軸不斷的旋轉(zhuǎn)，而且以3'-OH端為引物的DNA生長鏈則不斷地以另一條環(huán)狀DNA鏈為模板向前延伸，因而稱為滾環(huán)(Rollingcircle)復(fù)制。在這種復(fù)制方式中，DNA的延伸可以一直進行下去，產(chǎn)生的DNA鏈可以是親代DNA單位長度的許多倍。這么長的DNA鏈?zhǔn)侨绾无D(zhuǎn)變?yōu)閱挝婚L度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特異的內(nèi)切酶切開產(chǎn)生單位長度的子代DNA。這些DNA可自身環(huán)繞，或保持線性分子狀態(tài)。雙鏈環(huán)在固定點解開進行復(fù)制，但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下可以看到呈D環(huán)形狀。待一條鏈復(fù)制到一定程度，露出另一鏈的復(fù)制起點，另一條鏈才開始復(fù)制。這表明復(fù)制起點是以一條鏈為摸板起始合成DNA的一段序列；兩條鏈的起點并不總在同一點上，當(dāng)兩條鏈的起點分開一定距離時就產(chǎn)生D－環(huán)（D-loop）復(fù)制。F.多復(fù)制叉復(fù)制第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點就開始第二輪的復(fù)制。三、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段前導(dǎo)鏈：以3’→5’方向的親代鏈為模板連續(xù)合成的子代鏈。滯后鏈：以5’→3’方向的親代鏈為模板的子代鏈先逆復(fù)制叉移動方向合成岡崎片段，再連接成滯后鏈。半不連續(xù)復(fù)制的發(fā)現(xiàn)

同位素實驗，用含3H的dT標(biāo)記用T4噬菌體感染的大腸桿菌短時間內(nèi)分離的DNA均為DNA小片段一段時間后檢測到DNA大片段。當(dāng)用DNA連接酶的缺失的變異株時，檢測到大量DNA片段的積累?！C明DNA復(fù)制中有小片段合成。測定DNA小片段，遠遠大于合成DNA的一半。似乎兩條鏈都是不連續(xù)合成的，后發(fā)現(xiàn)是由于U替代dT滲入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，DNA的U不再被切除，則檢測到一半3H標(biāo)記出現(xiàn)在小片段（岡崎片段）中。

1968日本學(xué)者岡崎：ArthurKornberg

1918

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"四、與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)原料：四種脫氧核苷三磷酸

（dATP、dGTP

dCTP

dTTP)需要模板：以DNA為模板鏈，合成子代DNA，模板可以是雙鏈，也可以是單鏈DNA。合成產(chǎn)物與模板互補。需要引物：一小段RNA(或DNA）為引物，在大腸桿菌中，DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物，引物含3’-OH.合成方向：53(一)DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大腸桿菌中首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，其后發(fā)現(xiàn)該酶在許多生物中廣泛存在。該酶的催化性質(zhì)如下：第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)（二）大腸桿菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（但持續(xù)合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（對雙鏈無作用，在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長鏈，只作用于生長中不配對的單鏈，校對功能。）；（3）還具有53’外切酶活性（雙鏈有效）；1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先從大腸桿菌中分離。該酶為單體酶,含一個鋅原子。為多功能酶，具有:該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNA合成酶活性，只是對DNA損傷的修復(fù)能力下降，容易導(dǎo)致變異和死亡。推測該酶主要是對DNA損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時RNA引物切除及其缺口的填補。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)DNA聚合酶催化的反應(yīng)：ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能[1]聚合作用在引物RNA3'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進3'-OH與5'-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯誤的核苷酸進入結(jié)合位點，則不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點所識別并切除之。[2]3'→5'外切酶活性──校對作用這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。[3]5'→3'外切酶活性──切除修復(fù)作用從5‘→3’方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5‘-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用。每次能切除10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5'末端DNA引物的去除依賴此種外切酶活性。[4]焦磷酸解作用DNApolⅠ的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi→(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA

[5]焦磷酸交換作用催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA（[4]、[5]兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。）2、DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持續(xù)合成DNA的能力差。該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNA合成能力，推測該酶仍然不是真正的DNA聚合酶。該酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修復(fù)紫外光引起的DNA損傷中起作用。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)3、DNA聚合酶Ⅲ

多亞基酶，含十種亞基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）稱為核心酶，β2稱為夾子，（γ2δδ’χΨ）組成γ復(fù)合物，其主要功能是幫助β亞基夾住DNA，故稱為夾子裝配器，該酶DNA合成的持續(xù)能力強，主要與該結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外，該酶合成速度大，活性高，缺失時大腸桿菌因DNA復(fù)制抑制而致死。因此認為該酶DNA的真正復(fù)制酶。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)DNA聚合酶Ⅲ全酶的亞基組成亞基相對分子量亞基數(shù)目基因亞基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校對功能組建核心酶使核心酶二聚化依賴DNA的ATP酶，形成γ復(fù)合物與β亞基結(jié)合，形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物兩個β亞基形成滑動夾子，以提高酶的持續(xù)合成能力。DNA聚合酶Ⅲ的異二聚體前導(dǎo)鏈的合成滯后鏈的合成

DNA聚合酶Ⅲ的β-鉗子俯視圖DNA雙螺旋大腸桿菌三種聚合酶比較DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ結(jié)構(gòu)基因＊不同種類的亞基數(shù)目相對分子質(zhì)量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持續(xù)合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修復(fù)PolB≥788,000＋－2,4001,500修復(fù)PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000復(fù)制大腸桿菌三種DNA聚合酶比較(三）DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈切口作用特點：大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌體中的DNA連接酶，則要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能連接雙鏈DNA上的粘性切口，而且能連接無粘性末端的平頭雙鏈DNA。

DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)DNA連接酶作用機理1、拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶：催化DNA的拓撲連環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶，在DNA重組修復(fù)和其它轉(zhuǎn)變方面起重要作用。除連環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的DNA分子稱為拓撲異構(gòu)體，引起拓撲異構(gòu)體反應(yīng)的酶稱為拓撲異構(gòu)酶。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)(四)與DNA合成有關(guān)的其它蛋白因子(大腸桿菌中)蛋白質(zhì)功能相對分子量（×103）分子/細胞DNA旋轉(zhuǎn)酶（或拓撲異構(gòu)酶）DNA解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松開超螺旋使雙鏈DNA解鏈穩(wěn)定單鏈區(qū)合成RNA引物除去引物并填滿缺口40065746010950300100300拓撲異構(gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負超螺旋，反應(yīng)不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓撲異構(gòu)酶Π：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入負超螺旋時需要由ATP提供能量，同復(fù)制有關(guān)。兩類拓撲異構(gòu)酶作用特點:

二者共同控制DNA的拓撲結(jié)構(gòu)。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)2、解螺旋酶（解鏈酶）

通過水解ATP將DNA兩條鏈打開。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開一對堿基需要水解2個ATP分子。穩(wěn)定DNA解開的單鏈，防止復(fù)性和保護單鏈部分不被核酸酶水解。3、單鏈結(jié)合蛋白：第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)解螺旋酶（helicase）可以促使DNA在復(fù)制叉處打開雙鏈。解螺旋酶可以和單鏈DNA結(jié)合，并且與ATP結(jié)合，利用ATP分解成ADP時產(chǎn)生的能量沿DNA鏈向前運動促使DNA雙鏈打開。目前，大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)有兩種解螺旋酶參與這個過程，一種稱為解螺旋酶I、II、III，與滯后鏈的模板DNA結(jié)合沿5'→3'方向運動;第二種稱為Rep蛋白，和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3'→5'方向運動。單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSBP)螺旋酶沿復(fù)制叉方向向前推進產(chǎn)生了一段單鏈區(qū)，但是這種單鏈DNA不會長久存在，會很快重新配對形成雙鏈DNA或被核酸酶降解。在細胞內(nèi)有大量單鏈DNA結(jié)合蛋白能很快地和單鏈DNA結(jié)合，防止其重新配對形成雙鏈DNA或被核酸酶降解。一個SSBP四聚體結(jié)合于單鏈DNA上可以促進其他SSBP四聚體現(xiàn)相鄰的單鏈DNA結(jié)合，這個過程稱為協(xié)同結(jié)合(cooperativebinding)，SSBP結(jié)合到單鏈DNA上后，使其呈伸展?fàn)顟B(tài)，沒有彎曲和結(jié)節(jié)，有利于單鏈DNA作為模板。SSBP可以重復(fù)使用，當(dāng)新生的DNA鏈合成到某一位置時，該處的SSBP便會脫落，并被重復(fù)利用。引發(fā)體可以沿模板鏈5’3’方向移動,具有識別合成起始位點的功能，移動到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。移動和引發(fā)均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引發(fā)體的移動與復(fù)制叉移動的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。3、引物合成酶與引發(fā)前體引物合成酶：催化引物RNA的生成

引發(fā)前體:它由多種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)（五）、參與DNA復(fù)制的酶與蛋白因子總覽圖五、DNA的復(fù)制過程：（以大腸桿菌為例）復(fù)制的終止：復(fù)制的起始1、起始復(fù)合物的形成：稱為引發(fā)2、RNA引物的合成鏈的延伸：第34章DNA的復(fù)制和修復(fù)復(fù)制原點oriC和原點的識別：從復(fù)制原點到終點，組成一個復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨立進行復(fù)制的單位）。

DNA的復(fù)制有特定的起始位點，叫做復(fù)制原點。常用oriC(或o）表示。大腸桿菌的復(fù)制原點oriC由245個bp構(gòu)成，含兩組保守的重復(fù)序列：三個13bp的序列（富含A、T的序列）和四個9bp的序列；許多生物的復(fù)制原點也都是富含A、T的區(qū)段。復(fù)制原點由DnaA蛋白識別，在原點由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補鏈(DNA雙鏈的解開還需DNA拓撲異構(gòu)酶Π、SSB),在原點處形成一個眼狀結(jié)構(gòu)，叫復(fù)制眼。（一）復(fù)制起始1、拓撲異構(gòu)酶解開超螺旋。2、DnaA蛋白識別并在ATP存在下結(jié)合于四個9bp的重復(fù)序列。3、在類組蛋白（HU、ATP參與下,DanA蛋白變性13個bp的重復(fù)序列,形成開鏈復(fù)合物。4、DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC的幫助下沿5’→3’方向移動，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。5、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6、引物合成酶（DnaG蛋白）開始合成RNA引物。(二)鏈的延長（岡崎片段的合成）

真核生物的岡崎片段為：100-200bp

原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp

DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’-脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型岡崎片段引物的切除、缺口的填補和切口的連接:前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成（DNA聚合酶的異二聚體催化）(三)復(fù)制的終止順時針終止陷阱逆時針終止陷阱

Ter:終止陷阱，引起復(fù)制終止的特定區(qū)域，20bp的序列，終止利用物質(zhì)Tus可識別并結(jié)合，從而導(dǎo)致DNA復(fù)制的終止。大腸桿菌DNA

復(fù)制的終止(四)DNA復(fù)制的精確性（高保真復(fù)制）1、堿基的配對規(guī)律：摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對保證堿基配錯幾率約為1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校對功能，使堿基的錯配幾率又降低100～1000倍。3、DNA的損傷修復(fù)系統(tǒng)。

DNA復(fù)制必須具有高度精確性，在大腸桿菌的細胞DNA復(fù)制中其錯誤率約為1/109～1/1010，即每109～1010個核苷酸才出現(xiàn)一個錯誤，也就是大腸桿菌染色體DNA復(fù)制1000～10000次才出現(xiàn)一個核苷酸的錯誤。這么高的精確性的保證主要與下列因素有關(guān)：六、復(fù)制起始

的時序控制七、真核生物DNA復(fù)制的特點4、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點不再重新開始復(fù)制；而在快速生長的原核生物染色體DNA復(fù)制中，起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復(fù)制起點。1、真核生物染色體有多個復(fù)制起點，稱為自主復(fù)制序列（ARS）或復(fù)制基因(replicator);多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。2、岡崎片段長約200bp(原核1000-2000bp)。3、真核生物DNA復(fù)制速度比原核慢，速度為1000～3000bp/min(僅為原核生物的1/20～1/50）。真核DNA復(fù)制特點7、RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填補缺口。5、真核生物有多種DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的復(fù)制酶，在PCNA存在下有持續(xù)的合成能力（PCNA稱為增殖細胞核抗原，相當(dāng)于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夾子）。RFC蛋白相當(dāng)于夾子裝配器。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，它是由許多成串的重短復(fù)序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接，并可補償滯后鏈5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色體保持一定長度。端粒酶是含一段RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶.端粒酶（telomerase）

DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清，端粒酶是一種含RNA的蛋白復(fù)合物，實質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它能催化互補于RNA模板的DNA片段的合成，使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進一步加工繼續(xù)延伸動畫真核細胞內(nèi)有五種DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶β

DNA聚合酶γ

DNA聚合酶δDNA聚合酶ε定位亞基數(shù)目外切酶活性引物合成酶活性持續(xù)合成能力抑制劑功能細胞核4－＋中等蚜腸霉素引物合成細胞核1－－低雙脫氧TTP修復(fù)線粒體23’→5’外切酶－高雙脫氧TTP線粒體DNA合成細胞核23’→5’外切酶－有PCNA時高蚜腸霉素核DNA合成細胞核＞15’→3’外切酶－高蚜腸霉素修復(fù)真核細胞DNA復(fù)制示意圖八、DNA損傷的修復(fù)

DNA突變：

DNA的核苷酸順序永久性的改變稱為DNA的突變。其主要形式有：

1.點突變：DNA分子中一個堿基對替代另一個堿基對稱為點的突變。

2.插入作用：DNA分子中插入一個或幾個堿基稱為插入作用。

3.缺失作用：

DNA分子中缺失一個或多個堿基對稱為缺失作用。

DNA在復(fù)制時產(chǎn)生錯配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，都可能使DNA的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變。從而引起生物突變，甚至導(dǎo)致死亡。

DNA的損傷與DNA突變：DNA突變可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生:著色性干皮病：對嘧啶二聚體和大的DNA損傷修復(fù)酶的缺失而產(chǎn)生的一種皮膚癌。

沉默突變：突變影響非必需的DNA或突變對一個基因的功能的影響可忽略，稱為沉默突變?；貜?fù)突變：一些突變可以克服第一次突變造成的影響，這類突變稱為回復(fù)突變。動物細胞的突變與癌的發(fā)生有強烈的相關(guān)性。通常生物體DNA的損傷有一系列的修復(fù)機制，如：錯配修復(fù)、堿基的切除修復(fù)、核苷酸的切割修復(fù)、直接修復(fù)、重組修復(fù)等。DNA損傷的修復(fù)機制:1、參與錯配修復(fù)的酶與蛋白質(zhì)Dam甲基化酶;MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;DNA聚合酶Ⅲ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶DNA連接酶；SSB（一）錯配修復(fù)MutS識別并結(jié)合于堿基錯配處MutH-MutL二聚體結(jié)合后沿兩個方向移動，形成DNA環(huán)，直至遭遇半甲基化的CTAG。MutH在CTAG的5’-端切開一個切口，核酸外切酶Ⅰ、Ⅶ沿3’→5’方向切除含配錯堿基的新鏈DNA聚合酶Ⅲ補缺，DNA連接酶連接切口。高度耗能的錯配修復(fù)

這是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式。修復(fù)是由細菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受300-600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。后來發(fā)現(xiàn)類似的修復(fù)酶廣泛存在于動植物中，人體細胞中也有發(fā)現(xiàn)。（二）直接修復(fù)(三)切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶插入酶堿基取代