生物化學(xué)課件-轉(zhuǎn)錄電子教案

生物化學(xué)課件-轉(zhuǎn)錄復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的共同點(diǎn):DNA模板依賴DNA的聚合酶堿基配對(duì)規(guī)律生成磷酸二酯鍵鏈延長(zhǎng)方向5'→3'復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別模板和酶TemplatesandEnzymes第一節(jié)5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N(xiāo)······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯一、轉(zhuǎn)錄模板結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)

：能作為轉(zhuǎn)錄模板的DNA區(qū)段。模板鏈(templatestrand)有意義鏈或Watson鏈DNA雙鏈中，能按堿基配對(duì)規(guī)律指引轉(zhuǎn)錄，生成RNA的一股單鏈。編碼鏈(codingstrand)反義鏈或Crick鏈DNA雙鏈中堿基序列與RNA一致的一股鏈。反義核酸：以編碼鏈為模板合成的核酸，稱為反義核酸（反義RNA、反義DNA）。序列與模板鏈一致，能抑制mRNA表達(dá)。5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄。模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。二、RNA聚合酶定義：以DNA為模板，催化三磷酸核苷（NTP）聚合形成RNA的酶。作用特點(diǎn)：DNA為模板不需引物，兩游離NTP或一游離NTP與RNA鏈聚合.3'-OH與5'-P聚合形成磷酸二酯鍵。方向：5'→3'。（一）原核生物的RNA聚合酶核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)核心酶:轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng);全酶：轉(zhuǎn)錄起始。σ70是辨認(rèn)典型轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的蛋白質(zhì)。σ32是辨認(rèn)熱休克蛋白(Hsp)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的蛋白質(zhì)。

RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合（二）真核生物的RNA聚合酶

45S-rRNA，5S-rRNA：核糖體RNA成分。

hnRNA：mRNA的前體。

snRNA：參與mRNA剪切。

RNA聚合酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：兩個(gè)大亞基：分子量>100KDa，催化亞基，與原核β，β'亞基有同源性。50kDa亞基：分子量50kDa，與原核α亞基相似。

小亞基：10，7，11個(gè)。羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD)：(YSPTSPS)n：Y：Tyr；S：Ser；P：Pro；T：ThrRNA-polⅡ大亞基C末端磷酸化，使轉(zhuǎn)錄進(jìn)入鏈的延長(zhǎng)階段。三、模板與酶的辨認(rèn)、結(jié)合操縱子(operon):原核生物的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，包括若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。

5335結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol啟動(dòng)子(promoter):

RNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位。RNA聚合酶保護(hù)法目錄開(kāi)始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物啟動(dòng)子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)55RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因33

原核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：一致性序列(concensus保守序列)：堿基序列相對(duì)穩(wěn)定，不易發(fā)生突變。TTGACA：-35區(qū)，RNA聚合酶的辨認(rèn)位點(diǎn)，σ亞基結(jié)合位點(diǎn)。TATAAT：-10區(qū)，Pribrow盒，RNA聚合酶的穩(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)。β'亞基的結(jié)合位點(diǎn)。TATA盒CAAT盒GC盒

增強(qiáng)子

順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列轉(zhuǎn)錄過(guò)程TheProcessofTranscription第二節(jié)一、原核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程（一）轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問(wèn)題：RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開(kāi)，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。辨認(rèn)起始位點(diǎn)：

亞基辨認(rèn)啟動(dòng)子的-35區(qū)，RNA聚合酶全酶(2)與模板疏松結(jié)合。酶滑行到-10區(qū)，通過(guò)亞基與模板牢固結(jié)合。

2.DNA雙鏈解開(kāi):

RNA聚合酶擠入DNA雙鏈中，解鏈長(zhǎng)度約20個(gè)核苷酸，拓?fù)洚悩?gòu)酶參與。

轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程：3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。RNApol(2)-DNA-5'pppGpN-OH3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:

RNA聚合酶-DNA模板-四磷酸二核苷酸5-pppG-OH+

NTP5-pppGpN

-OH3+ppi（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。(NMP)n

+

NTP(NMP)n+1

+PPi3.轉(zhuǎn)錄空泡的形成：3.轉(zhuǎn)錄空泡(transcriptionbubble)：

DNA解開(kāi)的兩條單鏈與RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。目錄RNA-pol：40bp以上；解鏈：20bp；RNA/DNA：12bp。目錄DNA/DNA雙鏈比DNA/RNA雜化雙鏈穩(wěn)定

穩(wěn)定性:

G≡C>A=T>A=UDNA雙鏈超螺旋作用53DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止（三）轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶在DNA模板上停止前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落。

機(jī)制ATP依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止：具有控制轉(zhuǎn)錄終止作用的蛋白質(zhì)因子。機(jī)制：Rho因子與RNA3’-OH的polyC結(jié)合，抑制聚合酶活性，激活解螺旋活性。

2.非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板近終止處，有特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)終止轉(zhuǎn)錄。發(fā)夾結(jié)構(gòu)：反向堿基互補(bǔ)序列末端PolyU：U:A不穩(wěn)定.5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)莖環(huán)結(jié)構(gòu)終止轉(zhuǎn)錄的機(jī)理

使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；末端polyU使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG5335RNA-pol二、真核生物的轉(zhuǎn)錄起始（一）轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，RNA-pol不直接結(jié)合模板的啟動(dòng)子，其起始過(guò)程比原核生物復(fù)雜。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-25bpTATA盒CAAT盒GC盒增強(qiáng)子順式作用元件(cis-actingelement)：DNA分子上可影響（調(diào)控）轉(zhuǎn)錄的序列。啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，沉默子。1.轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段:

AATAAA切離加尾轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)修飾點(diǎn)外顯子翻譯起始點(diǎn)內(nèi)含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體2.轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactors,TF)

能與順式作用原件識(shí)別、結(jié)合，調(diào)節(jié)真核基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)錄因子。反式作用因子(trans-actingfactors)

trans-分子外順式作用元件

(cis-actingfactor)cis-分子內(nèi)基本轉(zhuǎn)錄因子（TFⅠ，TFⅡ，TFⅢ）

直接或間接參與RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子特異轉(zhuǎn)錄因子：

特異調(diào)節(jié)各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，決定該基因的時(shí)間，空間特異性表達(dá)。參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ

TBP：TATAbindingprotein,TATA結(jié)合蛋白TAF:TBPassociatedfactor,TBP輔因子,不同基因TAF不同CTD:RNA-polⅡ大亞基羧基末端結(jié)構(gòu)域3.轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiationcomplex,PIC)

真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。

POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉(zhuǎn)錄的PICPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)RNA-pol前移,核小體移位和解聚現(xiàn)象。體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn):

移位DNA酶水解法,200bp及其倍數(shù)的電泳區(qū)帶,被組蛋白保護(hù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)：解聚組蛋白精氨酸乙?；?，降低正電荷。DNA：AMP→ADP→聚ADP，降低負(fù)電荷。與原核生物大致相似，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)中的核小體移位轉(zhuǎn)錄方向5------AAUAAA-5------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)55333加尾AAAAAAA······3mRNA（三）轉(zhuǎn)錄終止——和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄終止修飾點(diǎn):

DNA讀碼框架下游的一組AATAAA和GT共同序列,參與轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程,這些序列稱之。真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾Post-transcriptionalModification第三節(jié)幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.修飾(modification)4.添加(addition)一、真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）首、尾的修飾5端形成帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppGp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)帽子結(jié)構(gòu):

(m7GpppGp—)7-甲基鳥(niǎo)嘌呤-三磷酸鳥(niǎo)苷5’-5’磷酸二酯鍵5pppGp…5GpppGp…pppGppi鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶5

m7GpppGp…甲基轉(zhuǎn)移酶SAM帽子結(jié)構(gòu)的生成5ppGp…磷酸酶Pi帽子結(jié)構(gòu)的功能:核內(nèi)生成,保護(hù)mRNA不被核酸外切酶水解。與翻譯過(guò)程有關(guān)，帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白是翻譯起始必需的因子。2.3’-末端PolyA尾:（長(zhǎng)約100-200bp）生成：在核內(nèi)修飾,與轉(zhuǎn)錄終止同時(shí)進(jìn)行.作用：增加mRNA穩(wěn)定性，維持翻譯模板活性。5------AAUAAA-5------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)55333加尾AAAAAAA······3mRNA雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA目錄（二）mRNA的剪接編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔,又連續(xù)鑲嵌而成，這些基因稱為斷裂基因。

1.斷裂基因(splitegene)CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)2.外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)外顯子：（基因上的編碼序列）在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子：（基因上的非編碼序列）在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，而在剪接過(guò)程中被除去的核酸序列。3.內(nèi)含子的分類(lèi):基因的類(lèi)型和剪接的方式I類(lèi)：線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II類(lèi)：線粒體、葉綠體mRNA基因；I

II類(lèi):自我剪切III類(lèi)：多數(shù)mRNA基因；套索結(jié)構(gòu)剪接

IV類(lèi)：是tRNA基因，剪接過(guò)程需酶及ATP。翻譯后內(nèi)含子：胰島素原，酶原。mRNA的剪接過(guò)程:

Ⅲ類(lèi)內(nèi)含子剪接,套索狀剪接除去hnRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接。雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾目錄①snRNP剪接體的形成:核內(nèi)的蛋白質(zhì)小分子核糖核酸蛋白體(snRNP)（剪接體,splicesome）snRNA

snRNA：(smallnuclearRNA)

100-300核苷酸，以U分類(lèi)：U1-6snRNP：(smallnuclearribonucleoprotein)作為mRNA剪切的場(chǎng)所。②內(nèi)含子兩端與U1,U2配對(duì)結(jié)合。

5’剪接點(diǎn):↓GU--；

3’剪接點(diǎn):

--AG↓

分支點(diǎn)序列:3’剪接點(diǎn)上游20～50核苷酸范圍內(nèi)保守序列UACUAAC，倒數(shù)第二個(gè)A為分支點(diǎn)。目錄③形成完整剪切體，內(nèi)含子成套索狀，外顯子靠近。③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA-AGUGU6E1E2U1、U4、U5pG-OH(ppG-OH,pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)UpAGpU外顯子1內(nèi)含子外顯子2G-OHUpUpGpA④二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)(twicetransesterification)I類(lèi)內(nèi)含子

剪接體與剪接圖示hnRNA剪接簡(jiǎn)圖5.mRNA的編輯(mRNAediting)mRNA轉(zhuǎn)錄后出現(xiàn)核苷酸的替換，插入或缺失，改變DNA模板來(lái)源的遺傳信息，翻譯出氨基酸序列不同的多種蛋白質(zhì)。

apoBmRNA的編輯apoB基因:29個(gè)外顯子,14500bp,4536aaapoBmRNA編輯蛋白(REPP,脫氨酶)apoBmRNA第26個(gè)外顯子第6666位C脫氨→U;密碼:CAA(Gln2153)→UAA(終止密碼);肝細(xì)胞:不表達(dá)REPP4536aaapoB100腸上皮細(xì)胞:表達(dá)REPP2152aaapoB48

人類(lèi)apoB基因

mRNA（14500個(gè)核苷酸）肝臟apoB100（分子量為500000）腸道細(xì)胞apoB48（分子量為240000）mRNA編輯

RNA編輯的生物學(xué)意義：產(chǎn)生多種表達(dá)產(chǎn)物，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，產(chǎn)生功能用途的分化，因此也稱為分化加工

(differentialRNAprocessing)。DNA上的基因數(shù)要比表達(dá)的蛋白質(zhì)種類(lèi)少。估計(jì)10萬(wàn)個(gè)基因，實(shí)際3萬(wàn)個(gè)基因。二、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA前體RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA目錄RNAaseP、內(nèi)切酶目錄5’前導(dǎo)序列：RNAaseP中部?jī)?nèi)含子：內(nèi)切酶tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶ATPADP目錄堿基修飾（2）還原反應(yīng)如：UDHU（3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：Uψ（4）脫氨反應(yīng)如：AI如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）目錄三、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工縱列串聯(lián)基因：可轉(zhuǎn)錄的DNA片段與不能轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)串聯(lián)組成的基因。（基因間隔）高度重復(fù)序列：間隔區(qū)和可轉(zhuǎn)錄區(qū)可以重復(fù)數(shù)百個(gè)到數(shù)千個(gè)以上，每重復(fù)一次構(gòu)成一個(gè)重復(fù)單位，轉(zhuǎn)錄一個(gè)rRNA，而且每個(gè)重復(fù)單位轉(zhuǎn)錄的rRNA大小基本一致，45SrRNA。豐富基因：具有高度重復(fù)序列的基因，稱之。rDNA，5srRNA基因，組蛋白基因，免疫球蛋白rRNA基因（rDNA）的特點(diǎn):轉(zhuǎn)錄45S-