綠色熒光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物學(xué)研究中 的應(yīng)用

綠色熒光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物學(xué)研究中

的應(yīng)用

整理ppt生物發(fā)光現(xiàn)象,在無脊椎動物中很普遍。它是生物能量的一種轉(zhuǎn)換方式[1,2]。在水母(Jellyfish)中,當(dāng)能量從Ca++活化的水母蛋白(Aequorin)轉(zhuǎn)移到綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein,簡稱GFP)上以后，它即發(fā)出綠色熒光。活體GFP與純化的GFP具有相同光譜特性,即吸收藍(lán)光,放射綠光?？梢杂米贤鉄?、熒光顯微鏡或熒光活化流體分光光度計進行活體檢測。由于GFP穩(wěn)定、靈敏度高、無生物毒性、熒光反應(yīng)不需要任何外源反應(yīng)底物及表達(dá)無物種或細(xì)胞組織的專一性,因此它是一種獨特的報告蛋白(Reporterprotein),可廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化,以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域。90年代后,有關(guān)GFP及其利用的研究進展較快，已引起分子生物學(xué)家極大的興趣與關(guān)注。整理ppt一GFP的結(jié)構(gòu)、特性與功能1GFP的結(jié)構(gòu)PrasherDC首先克隆了水母Jellyfish(AequoreavictoriaGFP)的cDNA[6],GFP編碼的238個氨基酸的多肽單體，推導(dǎo)分子量Mr=26888，與先前用變性電泳測得的天然GFP分子量（30KDa）接近。根據(jù)DNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與大部分天然GFP的多肽片段相同。只有完整的GFP分子才會產(chǎn)生生物熒光,但與熒光的產(chǎn)生直接有關(guān)的是GFP分子中一小段被稱為色基(Chromophore)的部位（圖2。在GFP的初級氨基酸序列上,第65～67個氨基酸(SerˉTyrˉGly）ˉˉˉˉ形成環(huán)狀六肽三體,以共價形式與GFP蛋白肽鍵骨架相連。色基形成的機理目前尚不清楚,但在有分子氧存在的條件下,酪氨酸氧化成脫氫酪氨酸,并環(huán)化形成六肽,這可能是形成色基的必然過程。Shimomura最先推導(dǎo)了水母GFP色基結(jié)構(gòu)，后來Ward等進行了進一步驗證與修改。GFP的cDNA克隆序列分析表明，在2.6kb范圍內(nèi)至少分布有3個啟動子，組成色基的SerˉTyrˉGly三體就位于第二個內(nèi)含子3’端整理ppt2GFP的光譜特性GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外)，并有一個峰值為470nm的副峰（藍(lán)光）；發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder).GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,因此為熒光素FITC設(shè)計的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀察。盡管450~490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰,但由于長波能量低,細(xì)胞忍受能力強,因此更適合于活體檢測。Chroma技術(shù)公司(ChromaTechnologyCorp.Brattlebore,VT05301,USA)已研制出一系列適合于GFP觀察的濾光片組合。利用重組突變[10,11,12]和數(shù)字聯(lián)想分光顯微鏡(DigitalImagingSpectroscopy)技術(shù)[13,14,15]可以誘發(fā)GFP色基突變,改變GFP光譜特性。HeimR等[16,17]獲得了野生型GFP的一系列隨機突變,其激發(fā)波長和發(fā)射波長都發(fā)生了變化(表1)。如獲得的藍(lán)色熒光突變,就是原GFP分子中第66個氨基酸由酪氨酸突變成的組氨酸,但熒光信號減弱了近50%。DelagraveS獲得的紅色漂移(Red-shifed)突變,與野生型GFP相比,其激發(fā)波長向紅色方向漂移了近100nm[18]。具有不同光譜特性的GFP突變體的獲得,使在同一細(xì)胞中同時分析兩種不同蛋白或啟動子成為可能,可以用于發(fā)育細(xì)胞學(xué)、藥物篩選、分析診斷等研究。整理ppt3GFP的穩(wěn)定性

GFP熒光極其穩(wěn)定,在熒光顯微鏡強光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強[19]。特別在450~490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定,但在340~390nm或395~440nm范圍內(nèi),仍會發(fā)生光漂白現(xiàn)象。GFP在不同物種中穩(wěn)定性不同,在果蠅和斑紋魚(Zebrafish)中極穩(wěn)定;在大腸桿菌中會有光漂白;在線蟲中10mM的NaN3將加速光漂白。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強還原劑如5mMNa2S2O4或2mMFeSO4能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑,如2%巰基乙醇、10mMDDT、10mM還原谷胱甘肽、10mM半胱氨酸等并不影響GFP熒光。中度氧化劑對GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等,但GFP對某些封片指甲油特別敏感,苯氧丙烷對GFP熒光也有影響。強氧化劑如1%H2O2,或硫氫基試劑如1mMDTNB會造成GFP不可逆性破壞[20]。大多數(shù)中等濃度的有機試劑不減弱GFP熒光,但其最大吸收峰值會改變[21]。在高蛋白、高鹽條件下,GFP通過疏水反應(yīng)形成二聚體,使470nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易從細(xì)胞中分離并結(jié)晶[22]。在離體狀態(tài)下,GFP蛋白對熱(70℃)、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數(shù)普通蛋白酶(鏈霉蛋白酶Pronase除外)有較強抗性[23]。GFP熒光在pH值為7~12時穩(wěn)定,在pH值為5.5~7.0時開始受影響[24]。在納克級水平,SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠中仍能觀察到GFP熒光。在高溫、極端pH、或胍基氯化物條件下,GFP會變性,熒光消失。一旦復(fù)性,熒光會部分恢復(fù)[25],但可能需要某些硫醇類化合物的作用[26]。GFP在各種生物活體條件下表現(xiàn)穩(wěn)定。例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)在生物體內(nèi)很穩(wěn)定,用35S-甲硫氨酸分別標(biāo)記CAT和GFP,并轉(zhuǎn)染玉米葉肉原生質(zhì)體,用放線菌酮處理原生質(zhì)體,通過CAT檢測,發(fā)現(xiàn)5~10μg/ml放線菌酮可完全抑制CAT在玉米原生質(zhì)體中的蛋白合成,但通過GFP觀察,轉(zhuǎn)染24小時后,仍未發(fā)現(xiàn)GFP熒光有明顯減弱,僅有部分GFP被放線菌酮降解。說明GFP在植物活體細(xì)胞中比CAT還要穩(wěn)定[27]。此外,盡管GFP的消光系數(shù)較低,但和熒光素一樣,額定含量可高達(dá)80%。在熒光顯微鏡下,GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強,因此更適用于定量測定與分析。但因為GFP不是酶,熒光信號沒有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP是迄今為止唯一一種活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。整理ppt二GFP在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.1GFP作為報告基因用于轉(zhuǎn)基因研究自PrasherDC從水母(A.victoria)中克隆了GFP的cDNA后,GFP能在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體相繼被構(gòu)建成功。ChalfieM構(gòu)建了GFP大腸桿菌表達(dá)載體,GFP基因在T7啟動子控制下很容易在大腸桿菌中高效表達(dá)。從轉(zhuǎn)染的大腸桿菌中分離的GFP蛋白與水母的天然GFP離體光譜特性無差異。利用維管蛋白(β-tubulin)基因mec-7啟動子構(gòu)建表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染線蟲(Caenorhabditiselegans),在幼蟲的4種胚性起源觸覺受體神經(jīng)元細(xì)胞中,觀察到很強、很穩(wěn)定的GFP熒光,包括部分2齡幼蟲、所有4齡幼蟲和絕大多數(shù)幼小成蟲。據(jù)報道,GFP基因在酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蠅(Drosophilamelanogaster)以及多種哺乳動物細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系、人體胚性腎細(xì)胞系、猿猴Cos-1細(xì)胞系以及鼠NIH3T3細(xì)胞系等)中表達(dá),都相繼成功[20,29,30,31,32]。GFP在高等植物中的利用較晚,表達(dá)成功的例子還不多。SheenJ等報道,通過電擊法(Electroporation)轉(zhuǎn)染玉米葉肉原生質(zhì)體,有50%原生質(zhì)整理ppt體觀察到GFP熒光,集中在細(xì)胞質(zhì)或核周圍部。紫外光下液泡顯藍(lán)色熒光,藍(lán)光下葉綠體顯紅色熒光,出現(xiàn)黃色熒光是葉綠體紅色熒光與GFP綠色熒光的重疊效果。HuW也報道,用電擊法和PEG法同時轉(zhuǎn)化玉米和擬南芥菜(Arabidopsis)原生質(zhì)體,GFP在玉米原生質(zhì)體中表達(dá),但PEG介導(dǎo)比電擊法轉(zhuǎn)化效率高,而擬南芥菜原生質(zhì)體中未觀察到GFP表達(dá)[33]。不過SheenJ等利用基因槍(Microprojectilebombardment)轟擊擬南芥菜完整葉片和根組織,觀察到活體GFP熒光。NiedzRP等用電擊法轉(zhuǎn)化甜橙(Citrussinensis)原生質(zhì)體,450~490nm藍(lán)光下觀察到20%~60%原生質(zhì)體發(fā)生較強綠色熒光[34]。此外,也有GFP在菸草、水稻中表達(dá)的報道。GFP在多種原核和真核生物細(xì)胞中表達(dá),表明GFP色基形成的翻譯后修飾過程并非需要原有水母(A.victoria)細(xì)胞中任何其它成份或共因子。亦表明GFP作為報告基因,其表達(dá)不受生物類型、基因型或細(xì)胞組織類型的限制,具有廣泛的利用前景。整理ppt2.2GFP作為報告蛋白用于基因表達(dá)的調(diào)控效果研究Clontech公司構(gòu)建了一種叫啟動子報告載體(Promoterreportervector)即沒有啟動子的GFP質(zhì)粒,專門用來測試各種啟動子對GFP表達(dá)的效率,以及某些增強子對GFP表達(dá)的調(diào)控效果。發(fā)現(xiàn)用玉米C4PPDK基因5′端的非翻譯片段(5′VTR)與花椰菜花葉病毒的35S啟動子連接,GFP在玉米原生質(zhì)體中的表達(dá)效率比對照質(zhì)粒(只有35S啟動子)提高近15倍,因為5′VTR片段中含轉(zhuǎn)錄增強子。用擬南芥菜熱體克(Heat-shock)基因啟動子構(gòu)建GFP表達(dá)載體,用以轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。發(fā)現(xiàn)42℃熱激處理中50%原生質(zhì)體表達(dá)GFP熒光;37℃處理的熒光較弱;而常溫下培養(yǎng),則完全觀察不到原生質(zhì)體中的GFP熒光。在高等植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)調(diào)控研究中,已有很多報告蛋白被應(yīng)用,包括LacZ(β-galactosidase)[35]、CAT(Chloramphenicolacethytransferase)[36]、Luc(熒光蟲Luciferase)[37,38]和GUS(β-glucuronidase)[39]等。但這些報告蛋白都是酶,其表達(dá)產(chǎn)物的檢測都需要進行細(xì)胞固定、組織切片或蛋白提取等破壞性處理,很難用于活體觀察和檢測。GFP作為一種活體報告蛋白[40],用于研究基因表達(dá)的調(diào)控,明顯具有其它報告蛋白不可替代的優(yōu)點整理ppt2.3GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移動及相互作用異質(zhì)蛋白可以和GFP的N-端或C-端連接組成融合蛋白。GFP融合蛋白既保留了異質(zhì)蛋白的固有特性,也保留了GFP的正?；钚?。因此,GFP融合蛋白,實際上可作為一種“熒光標(biāo)簽”用來研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位、轉(zhuǎn)移、相互作用等內(nèi)容。Clontech公司構(gòu)建了6種GFP融合蛋白載體。KaimSR利用GFP融合蛋白載體研究細(xì)菌致病性,即用GFP融合蛋白載體轉(zhuǎn)化沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium),再侵染人的HEP-2細(xì)胞,并用若丹明(rhodamine-phalloidin)染色,在熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)菌只侵染到細(xì)胞表面,只在細(xì)胞表面呈現(xiàn)綠色熒光(GFP表達(dá)信號);若細(xì)菌已侵入細(xì)胞內(nèi)部,則培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光,這是GFP表達(dá)的綠色熒55薛啟漢:綠色熒光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用光與細(xì)胞若丹明染色的紅色熒光的重疊效果。因此,利用GFP融合蛋白為“熒光標(biāo)簽”,可以直接活體觀察到細(xì)菌蛋白和報告蛋白在細(xì)胞中的確切位置,以表明細(xì)菌在活體細(xì)胞中的侵染狀況。同樣原理,Youvan構(gòu)建了菸草花葉病毒和GFP的融合蛋白載體TWV-GFP。BanlcombeDC構(gòu)建了馬鈴薯X病毒和GFP的融合蛋白載體PVX-GFP[41]接種菸草(N.clevelandii)1~2天后,在紫外光下可以直接觀察到病毒侵染的確切部位。再用首次感染的菸草汁液接種另一種菸草(N.benthamiana),觀察到已放大的第二次系統(tǒng)感染的綠色熒光斑點。葉片提取液蛋白電泳凝膠在紫外光下也能見到GFP熒光信號,從感染葉片中回收的病毒經(jīng)鑒定,確認(rèn)為PVX-GFP。構(gòu)建載體時,直接用GFP基因替代病毒外殼蛋白基因,接種后觀察到GFP綠色熒光只局限于接種的細(xì)胞部位,不擴散。證實了早先的論斷,即PVX外殼蛋白對于病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的增殖,以及在細(xì)胞間的移動、擴展是不可缺少的條件[42,43,44,45,46,47]。顯然,GFP融合蛋白作為一種報告標(biāo)記,可以為病毒學(xué)研究,或以病毒載體為途徑研究外源基因在轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞中的表達(dá)及蛋白質(zhì)定位,提供理想的工具[48,49,50]。與傳統(tǒng)的熒光抗體相比,GFP不僅靈敏度高,不需要反應(yīng)底物,還可以消除因抗體與非靶位點結(jié)合帶來的背景熒光的干擾。整理ppt2.4GFP報告蛋白用于細(xì)胞活體分離與純化

利用細(xì)胞表面標(biāo)記,通過流體細(xì)胞分光光度計或熒光活化細(xì)胞篩選儀(FACS),可以分離與純化特殊類型細(xì)胞,對分析cDNA文庫、研究基因的細(xì)胞發(fā)育或組織專一性表達(dá)十分重要[51,52]。利用GFP融合蛋白為細(xì)胞表面活體熒光標(biāo)記,通過篩選已經(jīng)獲得GFP表達(dá)的大腸桿菌、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì)胞特殊類型。SheenJ等在GFP轉(zhuǎn)染玉米原生質(zhì)體的流體參數(shù)分析中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染15~18小時后,對照中只有一類細(xì)胞叢,表現(xiàn)較強紅色熒光和微弱的綠色熒光,并且細(xì)胞間熒光強度相當(dāng)一致,沒有明顯差異。而GFP轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體中出現(xiàn)兩類細(xì)胞叢,第一類與對照相似,呈現(xiàn)紅色熒光,約占細(xì)胞總數(shù)66.3%;第二類細(xì)胞叢呈現(xiàn)綠色熒光,熒光強度是對照的74倍。因此,用流式細(xì)胞分光光度計或熒光活化細(xì)胞篩選儀(EpicsElite,ConlterElectronics,MiamiFL,USA)很容易將兩類細(xì)胞分離開來。原生質(zhì)體可以來源于不同類型的組織細(xì)胞原生質(zhì)體表達(dá)的GFP信息,