密度梯度離心法取單個(gè)核細(xì)胞具體方法

密度梯度離心法取單個(gè)核細(xì)胞整理ppt密度梯度離心法密度梯度離心法又稱為區(qū)帶離心法，可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組分分離，具有良好的分辨率。離心時(shí)先將樣品溶液置于一個(gè)由梯度材料形成的密度梯度液體柱中，離心后被分離組分以區(qū)帶層分布于梯度柱中。整理ppt密度梯度離心法整理ppt密度梯度離心原理不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成，介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。整理ppt密度梯度離心可用來(lái)分離核酸、蛋白質(zhì)、核糖體亞基及其它成分。

整理ppt密度梯度離心法也稱“平衡密度梯度離心法”：用超離心機(jī)對(duì)小分子物質(zhì)溶液，長(zhǎng)時(shí)間加一個(gè)離心力場(chǎng)達(dá)到沉降平衡，在沉降池內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會(huì)上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。利用這種現(xiàn)象，測(cè)定核酸或蛋白質(zhì)等的浮游密度，或根據(jù)其差別進(jìn)行分析的一種沉降平衡法。整理ppt蔗糖密度梯度離心法采用蔗糖等一些小分子溶液，預(yù)先在分離超離心機(jī)的樣品地內(nèi)制備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液后，離心，大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降系數(shù)不同的許多成分，就會(huì)出現(xiàn)許多層。這種情況采用適當(dāng)?shù)木幣盘?hào)碼，取出樣品池內(nèi)的溶液，然后進(jìn)行研究。這是與密度梯度離心法不同的一種沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分離物這點(diǎn)上是有優(yōu)越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦稱為蔗糖密度梯度離心法。按同樣原理，也可使用分析超離心機(jī)進(jìn)行測(cè)定。整理ppt分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時(shí)滲透壓不大；4）對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。整理ppt密度梯度離心法應(yīng)用利用密度梯度離心的原理，用ficoll液或precoll液分離和純化人或動(dòng)物外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。目前比較常用ficoll密度梯度法。整理pptFicoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的實(shí)驗(yàn)方法一、步驟1.在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。2.取肝素抗凝靜脈血與等量Hank‘s液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。3.離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank‘s液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。整理ppt整理pptFicoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的實(shí)驗(yàn)方法4.用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。5.末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2％臺(tái)盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。整理ppt單個(gè)核細(xì)胞濃度(細(xì)胞數(shù)／1毫升細(xì)胞懸液)＝

×104×2（稀釋倍數(shù)）Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的實(shí)驗(yàn)方法4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)4整理ppt6.細(xì)胞活力檢測(cè)：死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞。計(jì)算出活細(xì)胞百分率。

活細(xì)胞百分率＝×100％

用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的實(shí)驗(yàn)方法活細(xì)胞數(shù)總細(xì)胞數(shù)整理pptFicoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的實(shí)驗(yàn)方法二、試劑和材料比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名為淋巴細(xì)胞分離液)。Hank's液(無(wú)Ca２＋、Mg２＋)10％小牛血清RPMI16400.2％臺(tái)酚蘭染色液，用生理鹽水或等滲的PBS配制。肝素用Hank‘s液或生理鹽水稀釋成500單位／ml，牽9凝人外周血肝素用量約為50單位／1毫升血。短中管、毛細(xì)滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。無(wú)菌干燥注射器針頭。血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、水平式離心機(jī)。碘酒，75％酒精，無(wú)菌棉球，鑷子，橡皮止血帶。整理pptFicoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的實(shí)驗(yàn)方法三、注意事項(xiàng)抽取人外周靜脈血時(shí)要注意無(wú)菌操作。操作全程應(yīng)盡可能短時(shí)間內(nèi)完成，以免增加死細(xì)胞數(shù)。用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加和減少要均勻、平穩(wěn)，使保持清晰的界面。小鼠、兔等動(dòng)物淋巴細(xì)胞比重與人不同，配制相應(yīng)密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。

整理ppt實(shí)驗(yàn)所需試劑的配置方法一、Hank‘s液(無(wú)Ca２＋、Mg２＋)配制法

NaCl：8.0克KCl：0.4克Na２HPO４·12H２O：0.12克

KH２HPO４：0.06克

葡萄糖1.0克

雙蒸水1000毫克

1％酚紅液2毫克將上列成分混合后溶化，分裝于500毫升鹽水瓶?jī)?nèi)，8磅15分鐘滅菌，4℃冰箱保存，臨用時(shí)調(diào)PH至7.3～7.6。

整理ppt實(shí)驗(yàn)所需試劑的配置方法二、細(xì)胞分層液配制法

9％聚蔗糖24份

34％泛影葡胺10％

混合，測(cè)比重為1.077～1.078，G５玻璃濾器過(guò)濾除菌。４℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

整理ppt實(shí)驗(yàn)所需試劑的配置方法三、磷酸緩沖液(PB)

原液:

A液:0.2MNaH２PO４溶液

NaH２PO４27.6克

或NaH２PO４·2H２O31.2克

蒸餾水溶解至1000毫升

B液：0.2MHa２HPO４溶液

Ha２HPO４·12H２O71.6克

蒸餾水溶解至1000毫升

各種不同PH值PB的配法整理ppt實(shí)驗(yàn)所需試劑的配置方法PH7.07.27.47.67.88.0A液（ml）39.028.019.013.08.55.5B液（ml）61.072.081.087.091.094.5舉例：0.1MPH7.2PB

A液28mlB液72ml

加蒸餾水100ml

整理ppt實(shí)驗(yàn)所需試劑的配置方法四、血球保存液

葡萄糖2.05克枸椽酸鈉0.8克氯化鈉0.42克蒸餾水100毫升

將上述成分混勻，略加溫使其溶解，分裝小瓶(100毫升)。經(jīng)10磅、10分鐘高壓滅菌。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

整理ppt實(shí)驗(yàn)所需試劑的配置方法五、RPMI-1640培養(yǎng)液RPMT-1640(FLOW公司出品)1袋三蒸水1000毫升

電磁攪拌30分鐘：1NHCl調(diào)PH7.2～7.4(約加2.5毫升)，過(guò)濾除菌，作無(wú)菌試驗(yàn)，4℃保存。整理ppt實(shí)驗(yàn)所需試劑的配置方法六、不完全RPMI-1640培養(yǎng)液

RPMI-164095毫0.1M丙酮酸鈉1毫0.2M谷氨酰胺1毫升

1MHepes1毫升

7.5％NaHCO３1毫升

青霉素、鏈霉素(各1萬(wàn)單位)1毫升

整理ppt實(shí)驗(yàn)所需試劑的配置方法七、完全RPMI-1640培養(yǎng)液

不完全1640培養(yǎng)液90毫升

滅活胎牛(或新生牛)血清10毫升

整理ppt實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充知識(shí)聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細(xì)胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll），分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無(wú)毒性的特點(diǎn)。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細(xì)胞聚集，故通常使用60g/L的低濃度溶液，密度為1.020，添加比重為1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。國(guó)外常用商品Isopaque或Hypaque，故又稱Ficoll-Hypaque分層液，將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液。整理ppt實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充知識(shí)分離人外周淋巴細(xì)胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，因?yàn)槿说募t細(xì)胞密度為1.093，粒細(xì)胞密度為1.092，單個(gè)核細(xì)胞在1.076～1.090之間。而不同動(dòng)物血中的單個(gè)核細(xì)胞對(duì)分離液的密度要求各不相同，如小鼠為1.088，馬為1.090。分離時(shí)先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個(gè)清晰的界面。水平式