實(shí)驗(yàn)七SDSAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的分

實(shí)驗(yàn)七SDSAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的分一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理掌握垂直板電泳的操作方法聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑和加速劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)。

二、實(shí)驗(yàn)原理SDS即十二烷基硫酸鈉是陰離子去污劑，與大多數(shù)蛋白質(zhì)平均結(jié)合比為1.4gSDS/g蛋白質(zhì)。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。在蛋白質(zhì)溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使多肽分成單個(gè)亞單位。SDS可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的形狀近似雪茄形的長(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸相同，約，而長(zhǎng)軸則與蛋白質(zhì)的Mr成正比。蛋白質(zhì)分子的遷移速度只取決于分子大小。分子量在15KD到200KD之間時(shí)，lgMr=K-b*mR濃縮效應(yīng)

（1）凝膠孔徑的不連續(xù)性：在上述凝膠中，濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場(chǎng)作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動(dòng)的阻力小，移動(dòng)速度快；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí)，受到的阻力大，移動(dòng)速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。

（2）緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性：濃縮膠，Tris-Cl0.5mol/L；三羥甲基氨基甲烷分離膠，Tris-Cl1.5mol/L電極緩沖液，為Tirs-Gly緩沖液濃縮膠，，蛋白質(zhì)分子的遷移率比Cl-低，比Gly高。（3）電位梯度不連續(xù)性：快離子（Cl-）后面形成高電位梯度區(qū)，慢離子（Gly）前面形成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之間的地方，形成一個(gè)穩(wěn)定而不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界面，蛋白質(zhì)分子在界面處濃縮成一個(gè)狹小的中間層。這種在電泳開(kāi)始后產(chǎn)生的高電位梯度作用于蛋白和甘氨酸慢離子加速前進(jìn)，追趕快離子。本來(lái)夾在快慢離子之間的蛋白區(qū)帶，在這個(gè)追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。

蛋白質(zhì)離子進(jìn)入分離膠后，條件有很大變化。由于其pH升高(電泳進(jìn)行時(shí)常超過(guò)9.0)，使Gly解離成負(fù)離子的效應(yīng)增加；同時(shí)因凝膠的濃度升高，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)受到影響，遷移率急劇下降。此兩項(xiàng)變化，使Gly的移動(dòng)超過(guò)蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復(fù)存在，蛋白質(zhì)便在一個(gè)較均一的pH和電壓梯度環(huán)境中，按其分子的大小移動(dòng)。分離膠的孔徑有一定的大小，對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，通過(guò)時(shí)受到的阻滯程度不同，即使凈電荷相等的顆粒，也會(huì)由于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開(kāi)。分子篩效應(yīng)在的分離膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，則遷移快；反之，則慢。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物電荷密度相同，靜電荷量與蛋白質(zhì)分子量成相關(guān)。電荷效應(yīng)三、實(shí)驗(yàn)試劑

低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（proteinmarker）：

兔磷酸化酶BMW=94000

牛血清白蛋白MW=66200

兔肌動(dòng)蛋白MW=45000

牛碳酸酐酶MW=33000

蛋白AMW=26000

胰蛋白酶抑制劑MW=20000

雞蛋清溶菌酶MW=14400(1)單體母液

（30%丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合溶液）

（2）10%SDS

（3）緩沖液

（4）緩沖液

（5）10%過(guò)硫酸銨(APS)（現(xiàn)配現(xiàn)用）

作用：提供引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合的自由基

（6）TEMED（四甲基乙二胺）

作用：加速過(guò)硫酸銨形成自由基(7)2樣品緩沖液

SDS、甘油、巰基乙醇、溴酚蘭

(8)2電極緩沖液母液（）

Tris，Gly，SDS

(9)染色液（考馬斯亮藍(lán)染料）

(10)脫色液

甲醇、冰醋酸水溶液四、實(shí)驗(yàn)步驟

1.將玻璃板洗凈晾干,準(zhǔn)備2個(gè)干凈的燒杯

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好

3.配好分離膠（12ml）,用小燒杯連續(xù)平穩(wěn)加入，至凹槽高度的大約7/10處，之后加高正丁醇（或蒸餾水），靜置50分鐘

※凝膠配制過(guò)程中，TEMED要在注膠前再加入，否則凝結(jié)后無(wú)法注膠12%的分離膠（12ml）膠濃度12％單體母液（ml）4.80去離子水（ml）4.20分離膠緩沖液（ml）3.0010％APS（μl）50TEMED(μl)18※醇封的目的是為了使分離膠上沿平直，并排除氣泡。

※凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與醇層之間形成清晰的界面。

4.倒出正丁醇,用去離子水清洗,并用濾紙吸干，配好濃縮膠（5ml），加入濃縮膠，迅速插入樣梳，靜置約50分鐘。

※樣梳需一次平穩(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，梳底需水平。5.0%的濃縮膠（5ml）膠濃度5％單體母液（ml）0.75去離子水（ml）3.00濃縮膠緩沖液（ml）1.2510％APS（μl）40TEMED(μl)125.拔出樣梳后，將玻板固定在電泳槽上，加入電極緩沖液，上槽緩沖液液面要高過(guò)點(diǎn)樣孔，下槽要沒(méi)過(guò)電極。

6.點(diǎn)樣（Marker和待測(cè)蛋白樣，加入等體積的2樣品緩沖液）

※加樣前，樣品在沸水中加熱3分鐘，以除掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。

7.開(kāi)始電泳，電壓100V，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改為150V，距凝膠底邊約時(shí)，停止電泳。

8.凝膠板剝離與染色電泳結(jié)束后撬開(kāi)玻板，將凝膠放在大平皿內(nèi)，加入染色液，染色12-15min。

※剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損。