目的基因的制備

關于目的基因的制備第一頁，共八十三頁，2022年，8月28日目的基因：那些已被或者準備要分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA片段，編碼蛋白質（酶）的結構基因。外源基因：插入到載體內(nèi)的那個特定的片段基因。第二頁，共八十三頁，2022年，8月28日經(jīng)典原核克隆體系流程圖核酸限制內(nèi)切酶消化機械切割雙鏈cDNA合成直接化學合成PCR擴增含目的基因片段的獲得同聚物加尾法連接粘性末端連接平末端連接接頭或銜接物分子重組噬菌體DNA的轉染重組質粒的轉化重組噬菌體DNA或柯斯質粒體外包裝成噬菌體顆粒的轉導目的基因序列測定體外重組導入宿主細胞篩選T-A克隆遺傳標記檢測結構分析篩選免疫學篩選核酸雜交篩選免疫印跡篩選轉譯篩選第三頁，共八十三頁，2022年，8月28日1基因組DNA片斷化2PCR技術擴增目的基因3化學合成基因4基因文庫技術獲取目的基因基因組文庫的構建

cDNA文庫的構建目的基因的獲取第四頁，共八十三頁，2022年，8月28日

1基因組DNA片斷化

1.1限制性內(nèi)切核酸酶酶切法該法適于從簡單基因組中分離目的基因，如質粒和病毒等DNA。BamHI和EcoRI

酶切，可獲得目的基因。第五頁，共八十三頁，2022年，8月28日特點：優(yōu)點：由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。缺點：目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene第六頁，共八十三頁，2022年，8月28日1.2機械切割法1）超聲波超聲波強烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片斷。2）高速攪拌

1500轉/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片斷。第七頁，共八十三頁，2022年，8月28日1基因組DNA片斷化2PCR技術擴增目的基因3化學合成基因4基因文庫技術獲取目的基因基因組文庫的構建

cDNA文庫的構建目的基因的獲取第八頁，共八十三頁，2022年，8月28日PCR，PolymeraseChainReaction

（1）反應體系：含有目的基因或序列的DNA模板熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）一對脫氧寡核苷酸引物（primer）4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)Buffer及Mg2+等第九頁，共八十三頁，2022年，8月28日5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555

（2）基本工作原理第十頁，共八十三頁，2022年，8月28日Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。第十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日（3）PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日如果知道目的基因的全序列或其兩側的序列，可以合成一對與模板DNA互補的引物，利用PCR技術擴增出含目的基因的DNA片段。2利用PCR擴增目的基因第十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日局限性：必須知道側接靶序列的核苷酸序列，以制備引物。常規(guī)PCR擴增片段一般在lkb以內(nèi)。未知序列的目的基因和大片段基因的擴增，則需要特殊類型的PCR

：套式PCR、反向PCR、不對稱PCR、多重PCR、錨定PCR、長程PCR、反轉錄PCR、熒光定量PCR和原位PCR等。第十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日1）Nestedpcr （套式PCR）特點:

需要設計兩對引物，一對引物擴增稍長片段，在這一擴增范圍內(nèi)再設計一對引物，擴增的產(chǎn)物是以第一對引物的產(chǎn)物為模版套式PCR

通過內(nèi)外引物進行兩次擴增，大大提高了檢測的敏感性第十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日2）反向PCR（InversePCR）基本原理：擴增一段已知序列旁側的DNA，在引物外側合成DNA。第十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日已知序列未知序列未知序列連接酶第十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日3）不對稱PCR

目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。

第十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日

高濃度引物低濃度引物第十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日

以其中的mRNA作為模板，以Oligo（dT）或隨機引物或基因特異性為引物，利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達

4）RT-PCR:提取組織或細胞中的總RNA第二十頁，共八十三頁，2022年，8月28日5）多重PCR：在一個反應體系中使用一對以上引物的PCR稱，其結果是產(chǎn)生多個PCR產(chǎn)物，用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物第二十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日6）原位PCR將樣品組織切片或細胞涂片，然后固定在載玻片上；加熱變性，加引物、dNTP、TaqDNA聚合酶到載玻片上在原位PCR儀內(nèi)進行PCR擴增、檢測?？梢詸z測組織細胞中微量DNA或RNA，且可精確定位人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片第二十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日7）定量PCR：熒光實時定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。第二十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日1基因組DNA片斷化2PCR技術擴增目的基因3化學合成基因4基因文庫技術獲取目的基因基因組文庫的構建

cDNA文庫的構建目的基因的獲取第二十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日3化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列第二十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因的化學合成20世紀70年代，Khorana提出，

提出體外擴增DNA1922-）印度-美國化學家遺傳密碼的破譯，獲得1968年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。第二十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日3.1DNA合成儀的基本工作原理是：將要合成的DNA片段3’端的第一個核苷酸固定于不溶性載體上．該核苷酸開始與另一核苷酸進行縮合反應，形成二核苷酸分子通過酸或堿洗脫其一端的保護基團，再次與另一個5’或3’保護的核苷酸分子進行第二次縮合反應，形成三核苷酸分子；再用同樣的步驟與下一個核苷酸進行循環(huán)反應。接長的鏈始終被固定在不溶的固相載體上，合成結束后，將寡核苷酸鏈從固相載體上洗脫下來。第二十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日3.2DNA片斷的組裝化學合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。3.2.1互補連接法1）互補配對預先設計合成的片斷之間都有互補區(qū)域，不同片斷之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。2）5’端磷酸化用T4多核苷酸激酶使各個片段的5’端帶上磷酸。（合成的DNA單鏈的5’端是-OH）第二十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA雙鏈3）連接酶連成完整雙鏈第二十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日3.2.2互補延伸連接法預先設計的片斷之間有局部互補區(qū)，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3’

5’

5’

3’

5’

3’

T4DNA連接酶Klenow片段引物第三十頁，共八十三頁，2022年，8月28日化學合成法優(yōu)缺點優(yōu)點：準確性極高，合成速度較快缺點：合成的寡核苷酸鏈長度短(不大于80個堿基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探針、人工接頭或銜接物序列、較小基因的合成。第三十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日對于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達數(shù)萬個，且基因組成結構復雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復序列.因此，單個目的基因在整個基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。第三十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日為了解決這個難題，一種可行的方法就是將這個基因擴增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對它進行特異性擴增，只能對所有的基因進行擴增，也就是構建該生物材料的基因文庫，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因。第三十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日1基因組DNA片斷化2PCR技術擴增目的基因3化學合成基因4基因文庫技術獲取目的基因

基因組文庫的構建

cDNA文庫的構建目的基因的獲取第三十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日

基因文庫(genelibrary)：指某一生物類型全部基因的集合。以重組體形式出現(xiàn)?；蛭膸煊赏庠碊NA片段、載體和宿主組成。一個理想的基因文庫應包括該生物染色體基因組全部遺傳信息(即全部DNA序列)。4基因文庫技術分離目的基因第三十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因文庫構建的基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②載體的選擇及制備。③DNA片段或cDNA與載體連接。④重組體轉化宿主細胞。⑤轉化細胞的篩選。第三十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日限制性內(nèi)切酶……克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫第三十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因文庫技術分離目的基因----未知基因

基因的克?。韩@得含重組DNA的宿主細胞克隆基因的分離:從文庫中分離出目的基因分離基因的鑒定:

確定基因的結構及功能

第三十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日3）基因文庫的類別基因組文庫與cDNA文庫基因組文庫：指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的DNA片段克隆到某種載體上而形成的集合?；蚪M文庫分為：核基因組文庫、葉綠體基因組文庫及線粒體基因組文庫。第三十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日cDNA文庫：是指某生物基因組轉錄的mRNA經(jīng)反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉錄后形成的互補DNA。第四十頁，共八十三頁，2022年，8月28日結構基因外顯子內(nèi)含子轉錄、加工修飾mRNA克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定cDNA文庫第四十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日

基因組文庫的概念和大小

λ噬菌體基因組文庫的構建

4.1基因組文庫構建第四十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因組DNA文庫的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：質粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。4.1基因組文庫的構建第四十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日一個理想的基因組文庫要有足夠多的克隆子數(shù)，保證所有的基因都在克隆子群體中。以某生物基因組約3106kb，酶切片段平均長度15kb。理論克隆數(shù)：

基因組DNA總長

DNA片段平均長度

3106/15=21054.1.1基因組文庫的大小實際克隆數(shù)：DNA片段是隨機克隆的，因此理論值只是基因組文庫所需要的最小數(shù)值。一個完全的基因文庫就必須含有更多的重組體克隆數(shù)。

文庫理論克隆子數(shù)＝第四十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日以上的例子，N值應是：ｌｎ（１－0.99）ｌｎ[1-（15/3106

）]1975年，L.Clark和J.Carbon的經(jīng)驗公式：文庫實際克隆子數(shù)N＝ｌｎ（１－ｐ）ｌｎ（１－ｆ）N:基因組文庫必需的克隆子數(shù)；P:文庫中目的基因出現(xiàn)的機率，一般情況下期望值99％，即0.99?:分離的DNA片段平均大小與基因組大小的比值。一個完全的基因文庫必須含有3-10倍于最低重組體克隆數(shù)的克隆。

N==91053106/15=2105第四十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因組文庫應具有的克隆子數(shù)第四十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日

連接克隆載體的選擇

質粒載體可承載15kbDNA片段

載體23kbDNA片段

Cosmid載體45kbDNA片段

YAC文庫4000kbBAC文庫300kb第四十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日

基因組文庫的概念和大小

λ噬菌體基因組文庫的構建

4.1基因組文庫構建第四十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日1）載體的特點：λ噬菌體是一種溫和噬菌體，可保存在大腸桿菌中。承載較大外源DNA，約23kb。有多種限制酶識別位點。

4.1.2λ噬菌體基因組文庫第四十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日獲得含目的基因的DNA片段與λ噬菌體載體重組重組DNA的包裝轉化受體菌2）構建λ噬菌體基因組文庫的步驟重組克隆的挑選和保存第五十頁，共八十三頁，2022年，8月28日

目的基因DNA片段化方法：超聲波處理限制性內(nèi)切酶部分酶切第五十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日A機械切割法（超聲波處理）：優(yōu)點：可獲得較均一的隨機片段，缺點：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，需經(jīng)末端修飾，連上接頭后再用限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生黏性末端。B限制酶消化：選用四或六核苷酸的限制性內(nèi)切酶，如：（GATC）Sau3AI或MboI、BamHI(GGATCC)等。優(yōu)點：直接產(chǎn)生黏性末端，缺點：片段的隨機性較差。第五十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日載體的結構左臂：編碼噬菌體頭部和尾部蛋白的基因右臂：復制起始點、轉錄啟動區(qū)和其它必須基因左臂和右臂末端的Cos位點中央片段：不含必須基因第五十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因文庫

Sau3AI或MboI密度梯度離心或電泳第五十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日YAC基因組文庫的構建過程脈沖電場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)第五十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日1基因組DNA片斷化2PCR技術擴增目的基因3化學合成基因4基因文庫技術獲取目的基因基因組文庫的構建

cDNA文庫的構建目的基因的獲取第五十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日4.2cDNA基因文庫的構建及目的基因分離4.2.1cDNA基因文庫的概念cDNA文庫：是指某生物基因組轉錄的mRNA經(jīng)反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。4.2.2cDNA基因文庫的構建4.2.3mRNA豐度與cDNA基因文庫大小的關系4.2.4cDNA克隆的優(yōu)越性第五十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日4.2.2cDNA基因文庫的構建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導入大腸桿菌宿主細胞增值。第五十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日mRNA的提取全長mRNA具有一個polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分離；用寡聚纖維素柱，選擇性地吸附mRNA純化第五十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日①分離細胞總RNA，從中分離純化mRNA；②合成cDNA的第一條鏈：

a.oligo(dT)引導的DNA合成法：原理：真核mRNA分子具有poly(A)尾巴，加入oligo(dT)短片段，由反轉錄酶合成cDNA的第一鏈。缺陷：逆轉錄酶通常無法到達mRNA分子的5’-末端，必須從3’-末端開始合成cDNA。第六十頁，共八十三頁，2022年，8月28日b.隨機引物引導的cDNA合成法：原理：隨機引物：人工合成的含有各種可能的排列順序的六核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸片段雜交，并作為聚合酶反應的引物。應用這種混合引物，cDNA的合成從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，從而保證得到mRNA的編碼區(qū)和5’端旁側。多用于mRNA分子較大且3’端非編碼區(qū)序列較長；AAAAAAAAAAAA3’

5’3’第六十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日4.2.2cDNA基因文庫的構建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導入大腸桿菌宿主細胞增值。第六十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日③合成cDNA第二條鏈a.自身引導合成法b.大腸桿菌RNaseH酶降解取代法c.oligo(dG)寡聚引物引導法d.PCR法

第六十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日a.自身引導合成法：原理：單鏈cDNA的3’端能夠形成發(fā)夾狀的結構作為引物，在大腸桿菌聚合酶I、Klenow或反轉錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點：S1核酸酶切割發(fā)夾狀結構會丟失對應于mRNA5’端的序列。

S1核酸酶偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。第六十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日b.大腸桿菌RNaseH酶降解取代法-置換合成法原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA-mRNA作為切口平移的模板，

RNA酶H對mRNA造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，大腸桿菌DNA聚合酶I

的作用下合成cDNA的第二鏈。第六十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日優(yōu)點：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA第六十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日c.oligo(dG)寡聚引物引導法oligo(dG)作為引物可與cDNA第一鏈3’末端的poly(C)序列相結合，有效的引發(fā)cDNA第二鏈的合成。第六十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日d.RCR法

以cDNA的第一條鏈為模板設計引物。優(yōu)點：可獲得多拷貝的雙鏈cDNA;不用純化mRNA;同聚物尾巴保護末端.

第六十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日4.2.2cDNA基因文庫的構建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導入大腸桿菌宿主細胞增值。第六十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日④cDNA與載體的重組后導入大腸桿菌宿主細胞增值。

cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對雙鏈cDNA的末端進行加工.方法：添加特異性接頭以形成適合于克隆的黏性末端第七十頁，共八十三頁，2022年，8月28日方法：在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌?；蚪柚┒宿D移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶第七十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日第七十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日第七十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日第七十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日4.2cDNA基因文庫的構建及目的基因分離4.2.1cDNA基因文庫的概念4.2.2cDNA基因文庫的構建4.2.3mRNA豐度和cDNA基因文庫大小4.2.4cDNA克隆的優(yōu)越性第七十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日4.2.3mRNA豐度和cDNA基因文庫大小的關系某種mRNA在不同組織不同發(fā)育時期的豐度不同。cDNA文庫中儲存某種基因的概率與總mRNA中這種基因的mRNA的拷貝數(shù)有關。某種mRNA的拷