腫瘤病理生物學(xué)-腫瘤病理生物學(xué)基礎(chǔ)

第一節(jié)脫氧核糖核酸和核糖核酸第二節(jié)遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯第三節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控第四節(jié)人類基因組計(jì)劃第五節(jié)RNA干擾和微小RNA

第一章腫瘤病理生物學(xué)基礎(chǔ)◆要求掌握基因構(gòu)成，堿基互補(bǔ)原則，復(fù)制形式和基因表達(dá)調(diào)控過程；◆了解人類基因組計(jì)劃和基因組圖譜；◆了解miRNA與siRNA的概念、異同點(diǎn)。

學(xué)習(xí)要求第一節(jié)脫氧核糖核酸和核糖核酸一、脫氧核糖核酸（DNA）（一）DNA的基本結(jié)構(gòu)基本構(gòu)成單位是核苷酸基本成分構(gòu)成：堿基（A、G、C、T）戊糖（D2脫氧核糖）磷酸（二）生物體中的DNA

◆主要是以雙股鏈的構(gòu)型存在于細(xì)胞核內(nèi)，由堿基（T.A.C.G=n4),脫氧戊（核）糖和磷酸成分所組成。

◆雙鏈彼此方向相反（5’→3’,3’

→

5’），并遵循堿基互補(bǔ)原則（A=T，G≡C；T=A，C≡G），以氫鍵相連接。DNA分子立體構(gòu)型有三級(jí)

?一級(jí)結(jié)構(gòu)為單核苷酸長鏈；

?二級(jí)結(jié)構(gòu)為雙股螺旋結(jié)構(gòu)（主要是右手螺旋構(gòu)型）；

?三級(jí)結(jié)構(gòu)為超螺旋結(jié)構(gòu)，以高度折疊壓縮狀態(tài)存在于染色體內(nèi)。DNA的分子構(gòu)型

（三）DNA的性質(zhì)及影響因素1、變性

DNA變性是指DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，雙螺旋結(jié)構(gòu)解體的過程。2、復(fù)性

DNA的變性是可逆的，在適宜條件下，如溫度或pH值逐漸恢復(fù)到生理范圍，分離的DNA雙鏈可以自動(dòng)退火，再次互補(bǔ)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這個(gè)過程叫做復(fù)性。3、疏水作用DNA分子間存在疏水相互作用4、堿基堆積作用堿基在DNA分子內(nèi)部聚積在一起5、溶液的離子強(qiáng)度對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響

溶液中鹽離子濃度對(duì)DNA穩(wěn)定性有影響二、核糖核酸（RNA）（一）RNA的特點(diǎn)①堿基組成不同：A,G,C,U②戊糖性質(zhì)不同:D-核糖③RNA主要是由單鏈核苷酸構(gòu)成，細(xì)胞中不存在于其互補(bǔ)的配對(duì)鏈；④因?yàn)槭菃捂湥訰NA分子里的堿基比例常不相等；⑥RNA是合成蛋白質(zhì)的模板、遺傳信息的傳遞和表達(dá)者;⑦某些RNA分子具有酶蛋白的催化活性；⑧某些RNA分子具有調(diào)節(jié)基因功能的作用。（二）RNA的種類、功能和結(jié)構(gòu)主要包括三種：信使RNA（messengerRNA,mRNA）；轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transferRNA,tRNA）；核糖體RNA（ribosomalRNA,rRNA）。不同種類的RNA行使不同的功能。tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（三葉草）tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)（倒L形）第二節(jié)遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯一、遺傳信息的復(fù)制

DNA(基因)復(fù)制具有一定的特征（一）半保留式復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制

半保留復(fù)制方式

?DNA復(fù)制時(shí)，分別以解開的親鏈為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成新的DNA鏈（子鏈）。

?復(fù)制完成后的子代DNA分子，其雙螺旋鏈必然是由一股親代原有的舊鏈與合成的子鏈互補(bǔ)形成的。

?這就是Watson及Crick提出的著名的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)方式。原始親代分子第一子代分子第二子代分子半保留復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制-岡畸片斷(Okazakifragment):◆生物體內(nèi)催化DNA合成的DNA聚合酶只能催化5’→3’方向的合成，而不能催化3’→5’方向的新鏈合成?！粼谝?’→5’方向的母鏈為模板時(shí)，復(fù)制合成出一條5’→3’方向的前導(dǎo)鏈（leadingstrand）?！羟皩?dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的?！羲裕瑥目傮w上看DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制(semidiscontinuousreplication)，隨從鏈的合成比前導(dǎo)鏈的合成要遲些，為此，兩者的形成是不對(duì)稱的。5'3'親代DNA3'5'3'5'先導(dǎo)鏈岡崎片段滯后鏈半不連續(xù)復(fù)制DNA復(fù)制過程

（二）DNA復(fù)制相關(guān)的酶

Ⅰ：還具有核酸外、內(nèi)切酶作用1、DNA聚合酶Ⅱ：核酸外切酶作用

Ⅲ：起主要作用2、DNA連接酶：只能連接一個(gè)切口而不能連接一個(gè)缺口。3、與解鏈相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)包括單鏈結(jié)合蛋白，解旋酶，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、Ⅱ，

引物酶，引發(fā)前體蛋白等。DNA連接酶的作用方式

（三）復(fù)制子、復(fù)制的起點(diǎn)與終點(diǎn)◆基因組中能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子(replicon)。◆復(fù)制子含有控制起始的特定位點(diǎn)稱為復(fù)制起始點(diǎn)（origin），真核細(xì)胞一般有幾個(gè)起始點(diǎn)，即有多個(gè)復(fù)制子。◆終止復(fù)制的位點(diǎn)稱為復(fù)制終點(diǎn)(terminus）。titit(1)(2)(3)(4)復(fù)制子復(fù)制子復(fù)制叉真核生物DNA的復(fù)制二、遺傳信息的轉(zhuǎn)錄◆mRNA行使轉(zhuǎn)錄功能時(shí)，則以DNA單鏈為模板，依照A-U，G-C；U-A，C-G堿基配對(duì)規(guī)則轉(zhuǎn)錄遺傳信息；◆由于mRNA的半衰期很短，故用于檢測的樣品必須新鮮。啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始序列內(nèi)含子末端序列DNA編碼序列（外顯子）內(nèi)含子5'3'mRNA前體5'端加帽，3'端加poly(A)尾5'帽剪切剪切內(nèi)含子環(huán)化5'5'內(nèi)含子切除AAA…AAA3'AAA…AAA3'Poly(A)尾AAA…AAA3'成熟的真核mRNA帽Poly(A)尾前導(dǎo)序列尾隨序列編碼序列真核mRNA轉(zhuǎn)錄后加工成熟過程示意圖DNA復(fù)制mRNA翻譯tRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄中心法則三、遺傳信息的翻譯◆tRNA則以mRNA為模板通過反密碼子的特異性接傳，翻譯成具有相應(yīng)氨基酸序列的肽鏈或蛋白質(zhì)。◆遺傳信息（基因）的表達(dá)一般是通過合成各種各樣的蛋白質(zhì)體現(xiàn)的，使生物細(xì)胞表現(xiàn)出各種各樣的生理功能，以及千差萬別的生物學(xué)性狀?！暨z傳密碼的擺動(dòng)學(xué)說

tRNA在蛋白質(zhì)的肽鏈合成過程中起到了“搬運(yùn)工”的作用，tRNA帶有30種左右的反密碼子，而密碼子卻有64種,1966年Crick提出了密碼子－反密碼子之間堿基配對(duì)的擺動(dòng)假說，即密碼子5’端的前兩個(gè)堿基必須嚴(yán)格地按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與反密碼子配對(duì)，但是第三個(gè)堿基可以擺動(dòng)，與密碼子形成非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)。遺傳密碼的擺動(dòng)假說

◆翻譯的基本過程核糖體是蛋白質(zhì)合成的工廠，有一系列蛋白質(zhì)合成相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)：①一個(gè)mRNA結(jié)合位點(diǎn)；②三個(gè)tRNA結(jié)合位點(diǎn)(氨基酰tRNA結(jié)合位點(diǎn)：A位點(diǎn)；肽酰tRNA結(jié)合位點(diǎn)：P位點(diǎn)；釋放的tRNA結(jié)合位點(diǎn)：E位點(diǎn))；③各種因子如起始因子、延伸因子以及釋放因子等的結(jié)合位點(diǎn)。翻譯過程示意圖翻譯的基本過程

第三節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控從DNA到蛋白質(zhì)的過程叫基因表達(dá)(geneexpression)，對(duì)這個(gè)過程的調(diào)節(jié)即為基因表達(dá)調(diào)控

(regulationofgeneexpressionorgenecontrol)?；虮磉_(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①染色體水平；②DNA復(fù)制水平；③轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平；④翻譯及翻譯后水平。一、轉(zhuǎn)錄前的調(diào)控（包括兩大方面）1、DNA序列改變或基因拷貝數(shù)改變引起的基因表達(dá)水平的改變；如：基因丟失、突變、擴(kuò)增、重排等2、基因序列或拷貝數(shù)沒有改變，但發(fā)生了表觀遺傳學(xué)的改變。如：基因甲基化、組蛋白乙?；榷?、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控

順式調(diào)控元件

其他順式調(diào)控元件：應(yīng)答元件、轉(zhuǎn)座子

反式作用因子啟動(dòng)子增強(qiáng)子沉默子DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄活化域三、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控?前體RNA(hnRNA)加工成熟包括加尾、剪接、修飾等?mRNA運(yùn)輸

包括RNA干擾四、翻譯水平的調(diào)控?翻譯起始因子(IF)的調(diào)節(jié)：主要通過磷酸化和去磷酸化作用來實(shí)現(xiàn)的?起始密碼子的上游序列與翻譯控制：

同一mRNA可翻譯出兩條肽鏈?mRNA穩(wěn)定性與翻譯控制：五、翻譯后水平的調(diào)控：?多肽加工；?化學(xué)修飾（磷酸化、乙?；龋?。

DNA基因轉(zhuǎn)錄初級(jí)轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)錄后加工氨基酸核酸翻譯成熟mRNA蛋白(非活性）修飾蛋白(活性)蛋白降解氨基酸基因表達(dá)的多水平調(diào)控第四節(jié)人類基因組計(jì)劃一、人類基因組計(jì)劃的概念和意義：

1990年10月1日，美國國會(huì)正式批準(zhǔn)美國的“人類基因組計(jì)劃”（HumanGenomeProject,HGP）啟動(dòng)。這項(xiàng)由美國、英國、法國、德國、日本和中國六個(gè)國家共同參與。

研究的最終目的是對(duì)生命進(jìn)行系統(tǒng)和科學(xué)的解碼，以此達(dá)到了解和認(rèn)識(shí)生命的起源、種間和個(gè)體間存在差異的起因、疾病產(chǎn)生的機(jī)制等生命現(xiàn)象。該計(jì)劃歷經(jīng)十年，耗資數(shù)十億美元，成為人類基因研究史上一個(gè)重要的里程碑。2001年，上述計(jì)劃宣告完成，繪制出了四種不同的圖譜：遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜和基因圖譜。（一）遺傳圖譜（geneticmap）又稱為連鎖圖譜（linkagemap）或遺傳連鎖圖譜◆是某一物種的染色體圖譜，顯示所知的基因和/或遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置，而不是在每條染色體上特殊的物理位置。由遺傳重組測驗(yàn)結(jié)果推算出來的、在一條染色體上可以發(fā)生的突變座位的直線排列（基因位點(diǎn)的排列）圖?！羝溲芯拷?jīng)歷了從經(jīng)典的基因連鎖圖譜到現(xiàn)代的DNA標(biāo)記連鎖圖譜的過程。第一代多態(tài)性標(biāo)記：限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）第二代多態(tài)性標(biāo)記：微衛(wèi)星位點(diǎn)或短串聯(lián)重復(fù)片段（VNTR）第三代遺傳標(biāo)記：單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）（二）物理圖譜◆利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離堿基對(duì)(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)的圖譜?！粢匀祟惢蚪M物理圖譜為例，它包括兩層含義，一是獲得分布于整個(gè)基因組30000個(gè)序列標(biāo)志位點(diǎn)(STS，其定義是染色體定位明確且可用PCR擴(kuò)增的單拷貝序列)?！敉暾奈锢韴D譜包括人類基因組的不同載體DNA克隆片段重疊圖譜、大片段限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)圖譜、DNA片段或一段特異DNA序列或序列標(biāo)簽位點(diǎn)以及基因組中廣泛存在的特征性序列（CpG序列、Alu序列等）的標(biāo)記圖等。（三）序列圖譜隨著遺傳圖譜和物理圖譜的完成，測序工作成了重中之重的任務(wù)，其主要策略是把龐大的基因組分成若干有路標(biāo)的區(qū)域，然后進(jìn)行測序分析。

2003年完成了人類全基因組測序，差錯(cuò)率為萬分之一，比預(yù)期的目標(biāo)提前兩年完成。（四）基因圖譜在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。

基因圖譜就是鑒別出約全部基因的位置、結(jié)構(gòu)與功能，其中包括決定各類RNA的基因。人類基因組計(jì)劃催生了更先進(jìn)、更快速、高通量的測序技術(shù)。于是，基于大規(guī)模平行測序思想的第二代基因測序技術(shù)（NGS）應(yīng)運(yùn)而生。NGS的出現(xiàn)使得基因研究領(lǐng)域快速發(fā)展，測序成本也大大降低。如：全基因組測序在2001年時(shí)需要耗費(fèi)100萬美元，而2011年二代測序已經(jīng)降到1萬美元?，F(xiàn)在四代測序技術(shù)（又稱納米孔測序技術(shù)）已經(jīng)問世，該技術(shù)利用分子在通過納米孔道時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的電流，識(shí)別基因中的堿基排列順序。二、后基因組計(jì)劃

2004年10月，人類基因組完成圖公布，初步確定人類基因約為3.5萬條。

功能基因組研究的進(jìn)一步發(fā)展以及“后基因組時(shí)代”的到來，蛋白組學(xué)（proteomics）為核心的研究計(jì)劃成為新的熱點(diǎn)。除蛋白組學(xué)外，大規(guī)模的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、比較基因組學(xué)、代謝組學(xué)等一系列“組學(xué)(omics)”相繼產(chǎn)生，后基因組計(jì)劃將成為21世紀(jì)生命科學(xué)中繼基因組研究后的主要任務(wù)。表1-1人類基因組計(jì)劃和后基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃后基因組計(jì)劃研究方向結(jié)構(gòu)基因組學(xué)功能基因組學(xué)研究目標(biāo)最終明確人類基因遺傳多樣性及疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ)通過分析基因組所表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律和生物學(xué)功能，闡明復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象研究任務(wù)基因組測序；疾病基因的定位克隆；多基因病研究等基因功能及表達(dá)調(diào)控研究；代謝組學(xué)研究；蛋白組學(xué)研究等研究手段RFLP、SSCP、全基因組測序、生物信息學(xué)等EST法、SAGE法、蛋白雙向電泳和質(zhì)譜分析、反向遺傳學(xué)和基因誘變技術(shù)、RNA干擾、生物信息學(xué)等第五節(jié)RNA干擾和微小RNA

◆小RNA是非編碼的RNA分子，控制著真核細(xì)胞的許多功能，影響基因表達(dá)、細(xì)胞周期和個(gè)體發(fā)育等多種行為?！粜NA主要包括微RNA(microRNA/miRNA)和小干擾RNA(shortinterferingRNA,siRNA)兩類。一、RNA干擾和siRNARNA干擾（RNAinterference,RNAi）是1998年由華盛頓卡耐基研究院AndrewFire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心CraigMeno首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)的，指一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。

（一）RNA干擾的基本原理RNAi引起的基因沉默具有以下特征：①通過降解細(xì)胞中mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平來調(diào)控目的基因的表達(dá)，對(duì)靶基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄并無影響；②具有高度序列特異性；③抑制靶基因表達(dá)具有高效性；④RNAi可在不同細(xì)胞間長距離傳遞和長時(shí)間維持，而在某些生物（如線蟲）中則具有遺傳特性。（二）RNAi在腫瘤研究中的應(yīng)用?抑制腫瘤生長、血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移?確認(rèn)藥物靶標(biāo)?發(fā)現(xiàn)新的腫瘤基因?特定基因功能解析和人類疾病的研究二、MicroRNA/微小RNA?MiRNA是一類長度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，長度約21～22個(gè)核苷酸;?能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控;?其轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他基因并不翻譯成蛋白質(zhì)，而是具有調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)的活性;?在生物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。（一）miRNA的合成先轉(zhuǎn)錄生成較長的初級(jí)RNA分子(pri-miRNA)，在Drosha酶(RNaseⅢ家族成員)的作用下，被剪切成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA(pre-miRNA)，然后在exportin-5(GTP依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)因子)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用下，從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，pre-miRNA在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過Dicer酶被加工成為成熟的miRNA分子，然后與相關(guān)蛋白相結(jié)合，形成復(fù)合物后發(fā)揮其生物學(xué)作用。（二）miRNA的特點(diǎn)①廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA;②miRNA的長度一般為20～24個(gè)堿基，但在3′端可以有1～2個(gè)堿基的長度變化;③成熟miRNA的5’端有一磷酸基團(tuán)，3’端為羥基;④miRNA基因在基因組上不是隨機(jī)排列的,其中一些通常形成基因簇;⑤有些miRNA分子在一些物種中是高度保守的;⑥miRNA還呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)和發(fā)育階段特異性表達(dá)的特點(diǎn)。（三）miRNA的作用機(jī)制?miRNA的作用機(jī)制類似于siRNA。?細(xì)胞內(nèi)miRNA前體經(jīng)過剪切和加工后形成雙鏈RNA，其中只有一條鏈穩(wěn)定而形成單鏈，即miRNA，可與成熟mRNA上任意與之互補(bǔ)的序列相結(jié)合，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄和(或)使mRNA降解而抑制基因表達(dá)。?miRNA只與其靶基因3’端非翻譯區(qū)的特殊位點(diǎn)結(jié)合抑制其翻譯過程，從而調(diào)控基因表達(dá)。?在大多數(shù)情況下(例如在動(dòng)物中)，復(fù)合物中的單鏈miRNA與靶mRNA的3pUTR不完全互補(bǔ)配對(duì)，從而阻斷該基因的翻譯過程。miRNA的合成及作用簡圖

（四）miRNA的研究手段主要有兩種：?利用核酸雜交技術(shù)研究miRNA的特征，具體包括Northern雜交、實(shí)時(shí)定量-PCR、微陣列雜交、原位雜交及miRNA受體轉(zhuǎn)基因等技術(shù)?通過cDNA文庫、分子克隆技術(shù)和生物信息學(xué)分析來發(fā)現(xiàn)新的miRNA（五）MiRNA的應(yīng)用前景?MiRNA在生命活動(dòng)中起著重要作用，對(duì)基因表達(dá)、生長、發(fā)育和行為等都具有十分深遠(yuǎn)和復(fù)雜的影響。?目前正圍