溶血空斑實驗

關(guān)于溶血空斑實驗第一頁，共十七頁，2022年，8月28日實驗?zāi)康恼莆杖苎瞻咴囼灆z測原理掌握溶血空斑的操作方法第二頁，共十七頁，2022年，8月28日實驗原理●溶血空斑實驗（plaqueformingcellassay,PFC）體外檢測單個抗體形成細胞（B淋巴細胞）的一種方法?！衿湓硎菍⒕d羊紅細胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴結(jié)或小鼠脾細胞制成細胞懸液，與一定量的SRBC結(jié)合，在37℃條件下免疫活性淋巴細胞釋放出溶血素，在補體的參與下，可溶解周圍的綿羊紅細胞，從而在每個抗體形成細胞周圍形成一個可見的溶血空斑。第三頁，共十七頁，2022年，8月28日●一個空斑代表一個抗體形成細胞（即B細胞），空斑的數(shù)量反映機體的體液免疫功能?！窨瞻叽笮”硎究贵w生成細胞產(chǎn)生抗體的多少。由于溶血空斑試驗具有特異性高，篩選力強，可直接觀察等優(yōu)點，故可用做判定免疫功能的指標，觀察免疫應(yīng)答的動力學(xué)變化，并可進行抗體種類及亞類的研究。

第四頁，共十七頁，2022年，8月28日第五頁，共十七頁，2022年，8月28日實驗材料與試劑器材：平皿、37℃水浴箱、離心機、顯微鏡試劑：①SRBC懸液：取無菌脫纖維羊血，用NS或PBS離心洗滌3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）懸成細胞濃度為2.00×109個/mL第六頁，共十七頁，2022年，8月28日②Hanks液（含Ca2+、Mg2+

）③底層基（1.4%）和表層基（0.7%）：將瓊脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%兩種濃度。將表層基分裝于小試管中，每管2ml④補體：新鮮豚鼠血清⑤小牛血清：56℃滅活30min第七頁，共十七頁，2022年，8月28日實驗步驟㈠免疫脾細胞懸液的制備①小鼠免疫：每只小鼠經(jīng)尾靜脈注入上述SRBC懸液2.00×104個/0.2ml或者腹腔注射4.00×108

個/1ml。②單個脾細胞懸液的制備：將免疫后第四天的小鼠拉頸處死，解剖取出脾臟，放入PH7.2的PBS中漂洗，去掉結(jié)締組織，加入適量的PBS，用鑷子擠壓脾臟，稍靜置，吸上清液至離心管中，2500r/min離心5min，棄上清后，定量加入PBS液1ml，混勻，再用PBS液稀釋10倍（濃度約為5×106個/ml）第八頁，共十七頁，2022年，8月28日（二）傾注底層瓊脂將1.4%瓊脂凝膠加熱融化后，傾注于水平位置的平皿內(nèi)，每皿6ml，凝固后，用前置55℃水浴鍋中預(yù)溫。第九頁，共十七頁，2022年，8月28日（三）表層瓊脂的制備將0.7%的瓊脂融化后，置于55℃恒溫水浴箱中，依次加入以下試劑：⑴20%SRBC懸液0.1ml。⑵小牛血清0.1ml。⑶5.00×106/ml脾細胞懸液0.1ml。迅速混勻后，傾注于已鋪好底層瓊脂的平皿內(nèi)，使之均勻鋪平凝固后，靜置約15min，放37℃溫育2h。第十頁，共十七頁，2022年，8月28日（四）加補體從溫箱中取出平皿，每皿加入1:5稀釋的新鮮豚鼠血清1ml，繼續(xù)放37℃溫箱中溫育30min后取出，觀察溶血空斑。也可在室溫下放置1h，4℃冰箱過夜，次日觀察結(jié)果。第十一頁，共十七頁，2022年，8月28日結(jié)果判定

觀察時，將平皿對著光亮處，用肉眼或放大鏡觀察每個溶血空斑的溶血狀況，并記錄整個平皿中的空斑數(shù)，同時求出每百萬個脾細胞內(nèi)含空斑形成細胞的平均數(shù)。

第十二頁，共十七頁，2022年，8月28日注意事項⒈

對SRBC的要求：因為SRBC既是免疫原，也是靶細胞和指示細胞，故要求SRBC應(yīng)新鮮，洗滌不超過3次，每次2

000r/min離心5min，細胞變形或脆性增大者均不能使用。2．免疫所用SRBC的數(shù)量：尾靜脈注射以2.00×104

個/0.2ml為宜。腹腔注射為4.00×108

個

/ml，用量小，如低于1.00×107個/ml注射0.5ml，空斑形成極少；用量過大，超過2.50×109個/ml，不能形成空斑。第十三頁，共十七頁，2022年，8月28日3．采取免疫脾的時間：無論是經(jīng)尾靜脈還是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾為宜，過早或過晚空斑都形成極少。4．脾細胞的活力：

為了保證脾細胞的活力，制備脾細胞過程中所用PBS（或Hank’s液），最好臨用時方從4℃冰箱中取出，或整個操作過程應(yīng)在冰浴中進行。5．傾注平板的要求：底層要平，表層要把握好溫度。不要有氣泡，表層基要求混合均勻。第十四頁，共十七頁，2022年，8月28日6．補體的活力：補體活力的大小，對溶血空斑的形成關(guān)系很大。如出現(xiàn)抗體或補體的活力低下，將不能形成空斑。所以補體要新鮮，并宜將3只以上豚鼠血清混合。試驗中加入Ca2+、Mg2+是為了活化補體。7．空斑計數(shù)：要求判讀準確，避免辨認造成的誤差。遇可疑空斑時，應(yīng)鏡檢，對肉眼結(jié)果進行核對。第十五頁，共十七頁，2022年，8月28日所以器皿和各種試劑在加入表層基前均需預(yù)溫。SRBC可大致計數(shù)，但脾細