高速逆流色譜應用及發(fā)展課件

逆流色譜(CCC)

CountercurrentChromatography主要內(nèi)容☆逆流色譜簡介☆☆高速逆流色譜分離原理pH區(qū)帶逆流色譜的分離原理及應用☆高速逆流色譜分離天然產(chǎn)物的應用實例☆逆流色譜發(fā)展趨勢1逆流色譜的原理及發(fā)展過程分配定律：Nernst,1891年，Ｋ＝Ｃ1／Ｃ2兩組分K相差較大：一次萃取可得到分離較?。憾啻屋腿∧媪鞣峙浞?，20世紀40年代,創(chuàng)始人Craig高速逆流色譜(HSCCC)HighSpeedCountercurrentChromatography一種連續(xù)高效的液—液分配色譜分離技術(shù)，它不用任何固態(tài)的支撐物或載體。原理:利用螺旋柱在行星運動時產(chǎn)生的多維離心力場，使互不相溶的兩相不斷混合，同時保留其中的一相（固定相），利用恒流泵連續(xù)輸入另一相（流動相），隨流動相進入螺旋柱的溶質(zhì)在兩相之間反復分配，按分配系數(shù)的次序，被依次萃取分離出。HSCCC螺旋管內(nèi)區(qū)混合運動示意圖

兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的運動分布：兩相溶劑體系在螺旋管內(nèi)存在兩種狀態(tài)（左圖）,一種是在背離中心軸的螺旋管內(nèi),互不相溶的兩相處于分離的位置,較重相(下相)處于螺旋管外側(cè),輕相(上相)處于螺旋管內(nèi)側(cè)。在朝向公轉(zhuǎn)軸線的方向的區(qū)域兩相激烈的接觸、混合、分配和傳遞。隨著流動相不斷的注入流出,樣品中分配系數(shù)小的組分先被洗脫出來,分配系數(shù)值較大的組分后被洗脫出來,最終達到分離的目的。

工作原理：利用的是螺旋管的方向性與高速行星式運動相結(jié)合產(chǎn)生的一種獨特的流體動力學現(xiàn)象。阿基米德螺線力固定相的保留是在兩個力的平衡狀態(tài)下實現(xiàn)的

阿基米德螺線力——固定相移向移動相引入端流動相的推力——固定相推向移動相流出端原理及其方法高速逆流色譜優(yōu)勢：①與普通逆流萃取相比，采取了高速旋轉(zhuǎn)的螺旋柱作為分離場所，因此在多維離心力場力的作用下，溶質(zhì)與溶劑的混合更徹底，分離的效果也比普通逆流萃取依靠萃取動力學和泵的渦轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的吸力進行逆流萃取好的多。②利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學平衡，當其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。高速逆流色譜法的發(fā)展簡史

二十世紀六十年代，首先在日本，隨后在美國國家醫(yī)學研究院發(fā)現(xiàn)了一種有趣的現(xiàn)象：即互不相溶的兩相溶劑在繞成螺旋形的小孔徑管子里分段割據(jù)，并能實現(xiàn)兩溶劑相之間的逆向?qū)α?。Ito及其后來者在此基礎上研究并設計制造出了一系列逆流色譜裝置早期的是封閉型的螺旋管行星式離心分離儀CPC（coilplanetcentrifuge），用于分離染料，蛋白質(zhì)和細胞粒子。數(shù)年后Ito把流通機制引入到螺旋管柱體系中，隨研制出在重力場作用下的大制備量分離儀器和在離心力場作用下的分析型和半制備型分離儀器。

我國是繼美國、日本之后最早開展逆流色譜應用的國家。張?zhí)煊拥仍趪鴥?nèi)首先自行研制了分析型和制備型的高速逆流色譜儀，對我國中藥功能成分的分離制備取得了顯著成果。上海同田生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)的高速逆流色譜儀，分離中藥成分純度達到99%，可用于HPLC檢測標準樣。

高速逆流色譜色譜儀的基本配置

(a)ITO多層線圈分離柱，它是由100-200米長、內(nèi)徑為1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有適當內(nèi)徑的內(nèi)軸共繞十多層而成，其管內(nèi)總體積可達300mL左右。儀器的中心部分：(b)平衡器，它可以調(diào)節(jié)重量，它的作用是讓(a)，(b)相對于中心軸兩邊重量平衡。當在旋轉(zhuǎn)控制器的控制下，在齒輪傳動裝置作用下，(a)，(b)同時繞中心軸作順時針或反時針的行星運動，即(a)-(b)本身既在自轉(zhuǎn)，但同時又在繞中心軸公轉(zhuǎn)，公轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速可從0-4000r/min。從線圈分離柱中通過中空的中心軸還同時牽引出了線圈的兩端，一端供泵入液用，一端輸出液體。儀器工作需要互不相溶的兩種液體，一相作固定相，一相作移動相。儀器工作前，先將作為固定相一相的液體通過恒流泵壓入線圈分離柱，然后用進樣器將待分離的樣品按如圖所示進樣，最后用恒流泵壓入移動相，同時啟動中心部分運轉(zhuǎn)直到轉(zhuǎn)速大于600r/min。此時，兩相在線圈分離柱中具有相對運動之勢。由于移動相源源不斷的壓入，阻止了固定相的流出，同時，移動相帶著樣品在線圈分離柱中進行無限次的分配而使復雜樣品得到分離。當移動相經(jīng)過檢測器時，由于不同的樣品組分會產(chǎn)生不同大小的信號，用記錄儀就能得到逆流色譜圖譜，同時用餾分收集器分步收集移動相就會得到復雜樣品被分開的組分。較大的制備型HSCCC，柱容積可達530m1，一次最多進樣可達20g粗品；較小的分析型的HSCCC柱容積為8m1，進樣量為幾十微克，最大轉(zhuǎn)速可達4000r/min，分析能力堪與HPLC相媲美。

它相對于傳統(tǒng)的固—液柱色譜技術(shù)，具有適用范圍廣、操作靈活、高效、快速、制備量大、費用低等優(yōu)點。目前HSCCC技術(shù)正在發(fā)展成為一種備受關注的新型分離純化技術(shù)，已經(jīng)廣泛應用于生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等領域，特別在天然產(chǎn)物行業(yè)中已被認為是一種有效的新型分離技術(shù)；適合于中小分子類物質(zhì)的分離純化。我國是繼美國、日本之后最早開展逆流色譜應用的國家，俄羅斯、法國、英國、瑞士等國也都開展了此項研究。美國FDA食品和藥物管理局(FoodandDrugAdministration)及世界衛(wèi)生組織（WHO）都引用此項技術(shù)作為抗生素成分的分離檢定，90年代以來，高速逆流色譜被廣泛地應用于天然藥物成分的分離制備和分析檢定中。2．操作簡便，容易掌握

儀器操作簡單，對樣品的預處理要求低，一般的粗提物即可進行的制備分離或分析。3．回收率高不需要固相載體，消除了由于樣品在固相載體上的不可逆吸附和降解造成的損失，理論上樣品的回收率可達。在實驗中只要調(diào)整好分離條件，一般都有很高的回收率。

4．重現(xiàn)性好如果樣品不具有較強的表面活性作用，酸堿性也不強，即使多次進樣，其分離過程都保持很穩(wěn)定，而且重現(xiàn)性相當好。5．分離效率高，分離量較大

由于其與一般的色譜分離方式不同，能實現(xiàn)梯度洗脫和反相洗脫，亦能進行重復進樣，使其特別適用于制備性分離，產(chǎn)品純度高，制備量大。6．分配系數(shù)溶劑系統(tǒng)的選擇是同時選擇色譜分離過程的兩相，是對樣品成功分離的關鍵所在，而樣品中各組分的分配系數(shù)決定著這種溶劑系統(tǒng)是否合適，因此分配系數(shù)的測定是選擇溶劑系統(tǒng)的重要環(huán)節(jié)。目前，分配系數(shù)的測定多采用薄層色譜法、毛細管電泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。上表中是根據(jù)被分離物質(zhì)的極性列出一些基本的可供參考的溶劑體系，它包括非水體系和含水體系。

溶劑系統(tǒng)的選擇對于HSCCC分離十分關鍵。遺憾的是到目前為止溶劑系統(tǒng)的選擇還沒有充分的理論依據(jù)，而是根據(jù)實際積累的豐富經(jīng)驗來選擇。通常來說，溶劑系統(tǒng)應該滿足以下要求：溶劑系統(tǒng)不會造成樣品的分解或變性樣品中各組分在溶劑系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)，一般認為分配系數(shù)在0.2-5的范圍內(nèi)是較為合適的，并且各組分的分配系數(shù)值要有足夠的差異，分離因子最好大于或等于1.5；溶劑系統(tǒng)不會干擾樣品的檢測；為了保證固定相的保留率不低于50%，溶劑系統(tǒng)的分層時間不超過30秒；上下兩相的體積比合適，以免浪費溶劑；盡量采用揮發(fā)性溶劑，以方便后續(xù)處理盡量避免使用毒性大的溶劑。根據(jù)溶劑系統(tǒng)的極性，可以分為弱極性、中等極性和強極性三類。經(jīng)典的溶劑系統(tǒng)有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在實驗中，應根據(jù)實際情況，總結(jié)分析并參照相關的專著及文獻，從所需分離的物質(zhì)的類別出發(fā)去尋找相似的分離實例，選擇極性適合的溶劑系統(tǒng)，調(diào)節(jié)各種溶劑的相對比例，測定目標組分的分配系數(shù)，最終選擇合適的溶劑系統(tǒng)。HSCCC的改進在常用的HSCCC基礎上，有人提出雙向模式的高速逆流色譜"(dua-modecountercrurrentchromatography簡稱Dccc)，即前一次的流動相作下一次的固定相，洗脫方向相反。與常規(guī)的HSCCC相比，Dccc可以降低制備時間，免去柱沖洗時間，提高分離效率，不必預測溶質(zhì)的保留時間和分配系數(shù)，減少了溶劑選擇的繁瑣。但目前由于溶劑體系系統(tǒng)不完善，應用范圍較窄。HSCCC的應用領域（1）天然產(chǎn)物已知有效成分的分離純化（2）化學合成物質(zhì)的分離純化（3）中藥一類、五類新藥的開發(fā)（4）中藥指紋圖譜和質(zhì)量控制研究（5）抗生素的分離純化（6）天然產(chǎn)物未知有效成分的分離純化及新化合物開發(fā)（7）海洋生物活性成分的分離純化（8）放射性同位素分離（9）多肽和蛋白質(zhì)等生物大分子分離以及手性分離等1天然產(chǎn)物

HSCCC可以采用不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，有很強的適應性，不

但適用于極性化合物，同時也適用于非極性化合物；既可以用于天然產(chǎn)物粗提物的去雜，也可以用于最后產(chǎn)物的精制，甚至可以得到純品。適宜從天然產(chǎn)物中提取不同極性的有效成分。因此，HSCCC被大量用于天然產(chǎn)物化學成分的分析和分離。用氯仿:甲醇：0.3mol/L:0.2mol/L鹽酸(4:1:5:2)體系和異丁基甲醚:四氫呋喃:水(2:2:3)體系從高烏頭中分離拉巴烏頭堿，冉烏頭堿等。黃丹鳳等[16]用正丁醇-乙酸乙酯-水(1:3:4)作溶劑體系，采用高速逆流色譜與硅膠柱色譜結(jié)合的方法，從老蘆薈干粉中分離制備高純度蘆薈素異構(gòu)體。以正己烷-乙酸乙酯-水-甲醇(1.5:5:5:1.5)為溶劑系統(tǒng)，用高速逆流色譜分離純化丹參水溶性成分丹酚酸類物質(zhì)，實驗發(fā)現(xiàn)：一次分離可制備63.4mg丹酚酸B，其純度98.6%。在固定相為正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比5:3:6:6)的上相，流動相為正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比5:3:6:6)到正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比5:3:5:7)的兩相溶劑系統(tǒng)中，對決明子的乙酸乙酯萃取物進行分離純化得到5種高純度的蒽醌類單體化合物，純度均大于93%。2抗生素

用HSCCC分析抗生素時，進樣量一般為1mg~5g，分離度和樣品回收率高的優(yōu)勢，使

得HSCCC在抗生素單組份標準品的制備和多組分同系物的分離純化得到更為廣泛的應用。在HSCCC中，一般用疏水性體系分離抗生素。對于強極性組分用含有正丁醇的體系，中等疏水體系用含有氯仿的體系，疏水性用含有正己烷的體系。.3蛋白質(zhì)和肽

用HSCCC分離制備蛋白或多肽的混合物是最近幾年才發(fā)展起來的，一般用親水性溶液體系的溶劑系統(tǒng)，也有采用疏水性溶液體系的報道。HSCCC設備具有較高的分辨率和穩(wěn)定性，因而為生物大分子的高效分離提供了有利的徑。最近的進展主要取決于以下3種因素：采用低粘度的溶劑體系，溶劑體系大部分包含正丁醇；新型的pH區(qū)帶提取逆流色譜的出現(xiàn)和發(fā)展；HSCCC與離子對逆流色譜的綜合應用。4食品HSCCC應用于食品分離的最大優(yōu)勢是粗品或復雜樣品可直接進樣，一般用于食品除毒去雜或制備生物活性物質(zhì)。以叔丁基甲基醚-正丁醇-乙腈-水（2:2:1:5）為溶劑系統(tǒng)分離蟲膠中的四種乳酸，經(jīng)過HPLC鑒定，其純度分別達到97.2%、98.1%、98.2%和95.0%。北京天然產(chǎn)物分離純化研究中心同英國聯(lián)合利華公司合作，利用逆流色譜儀制備的兒茶素、茶色素等開發(fā)新一代飲品，研制食品中的防腐抗氧化物，生產(chǎn)天然的抗菌消炎、防治心腦血管病、防治癌癥的藥用原料，以及作為新一代功能性食品中的天然添加劑。5無機物和有機小分子

HSCCC的分離能力很強，它能分離常規(guī)方法難以分離的混合物，如同分異構(gòu)體和無機物，在分離無機物方面的應用主要集中于稀有元素或重金屬元素。有研究報道用混溶的0.5mol/LDEPHA(二乙基己基磷酸鹽)和十二烷作固定相，鹽酸作流動相，富集稀有元素31；用鹽酸和氯仿(溶有0.15mol/LDEPHA)(1:1溶劑體系分離鑭系元素Sm、Gd、Tb、Dy、Er、Yb，效果良好。利用HSCCC分離鄰苯二酚和對苯二酚以正己烷-乙酸乙酯甲醇-水(7:3:6:4)溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動相，使鄰苯二酚和對苯二酚實現(xiàn)了基線分離，兩峰均為單一物質(zhì)。4HSCCC的最新發(fā)展近年來，分析型HSCCC的柱系統(tǒng)向微型化發(fā)展。螺旋管體積可達3~5mL，柱子內(nèi)徑可以小到0.3~0.4mm[23]。基于常規(guī)的HSCCC技術(shù)的完善，多種HSCCC技術(shù)也得到了發(fā)展。如pH-區(qū)帶精制逆流色譜(pH-zone-refiningCCC)，HSCCC與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用等1高速逆流色譜-質(zhì)譜（HSCCC/MS）聯(lián)用

基于高效液相色譜（HPLC）和質(zhì)譜（MS）聯(lián)用技術(shù)的日益成熟，發(fā)展了HSCCC與MS聯(lián)用技術(shù)。這種聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展解決了HSCCC由于固定相的流失而使得流出液乳化，導致檢測器的靈敏度降低和峰形變寬的問題。Oka設計了T型連接器，解決了HSCCC與MS的接口問題，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用技術(shù)不影響HSCCC的分離和質(zhì)譜的分析，而且適用于極性范圍較寬的被分析物。Rinehart等首次報道HSCCC與電噴霧質(zhì)譜(ESIMS)聯(lián)用技術(shù)，ESIMS作為一種可以連續(xù)檢測的分析檢測器，有很高的靈敏度，它可以利用軟電離技術(shù)克服離子化過程中因熱不穩(wěn)定樣品分解而出現(xiàn)的問題，同時，聯(lián)用技術(shù)對復雜樣品有很強的溶解能力，適用范圍更廣，廣泛地被用于天然產(chǎn)物、藥物、蛋白質(zhì)等分子量大、極性強、熱不穩(wěn)定和物資外吸收物質(zhì)的分析。2高速逆流色譜-高效液（HSCCC/HPLC）聯(lián)用HSCCC/HPLC聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，使樣品分離和檢測過程同步進行，減少了檢測過程的中間環(huán)節(jié)，避免了樣品在轉(zhuǎn)移過程中造成的污染。樣品經(jīng)過HSCCC分離后，若需采集樣品進行HPLC檢測，流經(jīng)T型分流閥部分的餾分被收集，流經(jīng)六通閥的另一部分可以通過轉(zhuǎn)換六通閥來采樣檢測。3高速逆流色譜-高速逆流色譜（HSCCC/HSCCC）聯(lián)用HSCCC可以單獨使用，也可以兩臺串用，有研究者比較了高速逆流色譜儀單臺和串聯(lián)使用對相同的溶劑系統(tǒng)和分析樣品的分離能力，發(fā)現(xiàn)雙機串聯(lián)的分離能力是單臺的四倍4離子對逆流色譜技術(shù)離子對逆流色譜(ion-pairingCCC)需要在固定相中加入配位體，以提高其保留值。實驗中使用較多的是DEHPA(二乙基己基磷酸鹽)，廣泛應用于分離稀土元素、兒茶酚胺和多肽。它為分離同系物，結(jié)構(gòu)相似的化合物提供了有效的途徑，相當于傳統(tǒng)HSCCC的柱容量增大十倍，且分離得到的物質(zhì)純度高，分離時間短。二元模式逆流色譜傳統(tǒng)的高速逆流色譜是將固定相保留在螺旋管內(nèi)，流動相從螺旋管的一端注入，另一端流出，而二元模式逆流色譜采用的是螺旋管的兩端同時流入，又同時流出，這樣才真正實現(xiàn)了兩相對流。它以同一兩相分配溶劑系統(tǒng)洗脫，既可用于正相洗脫也可用于反相洗脫，因而大大增加了HSCCC對化合物極性范圍的適應性，普遍的應用于天然產(chǎn)物的分離精制。二元逆流色譜的優(yōu)點是：分離速度快，分離效率更高，不必預測溶質(zhì)的保留時間和分配系數(shù)，減少了溶劑選擇的困惑，因而可以應用于蛋白質(zhì)的分離。6手性逆流色譜技術(shù)隨著科學不斷發(fā)展，逆流色譜技術(shù)應用范圍逐漸拓展。早在1995年，Ito博士等已提出用逆流色譜分離外消旋對映體手性化合物。例如溶劑系統(tǒng)采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水，在固定相加入手性選擇體N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺，用系列N-(3,5-dintrobenzoyl)-D,L-氨基酸作檢測樣品，可以實現(xiàn)良好的分離。7pH區(qū)帶逆流色譜pH區(qū)帶逆流色譜是20世紀90年代發(fā)展起來的逆流色譜技術(shù)，它的發(fā)展擴展了高速逆流色譜的應用空間。它是通過高速逆流色譜的固定相和流動相中加入一對試劑例如在有機固定相中加入三氟乙酸，流動相中加入氨水，三氟乙酸為保留劑，流動相以一定的流速穿過固定相，由于酸堿反應,最后達到平衡。以有機酸在固定相和流動相的濃度比標度分配系數(shù)(保留劑的分配系數(shù))、溶質(zhì)(分離物或分析物)的系數(shù)與標度值的差異決定了出