抗炎中藥機(jī)理教材課件

抗炎免疫中藥的作用機(jī)制及相關(guān)研究楊偉鵬中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究室中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院碩士研究生中藥藥理學(xué)抗炎免疫中藥的作用機(jī)制及相關(guān)研究楊偉鵬中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院碩士研究1主要內(nèi)容炎癥簡(jiǎn)介抗炎免疫中藥的作用機(jī)制雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎作用的機(jī)理研究主要內(nèi)容炎癥簡(jiǎn)介2炎癥炎癥概念：炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的，由多種細(xì)胞、多種因子參與的復(fù)雜防御反應(yīng)。是人類(lèi)疾病的一種最常見(jiàn)的病理過(guò)程，大多數(shù)疾病均與此有關(guān)，如感染，腫瘤，心腦血管病，老年癡呆等。它是醫(yī)學(xué)生物學(xué)中最原始、最復(fù)雜又最具挑戰(zhàn)的新課題（NewAdventuresofanOldFlame）。它是我們防治人類(lèi)重大疾病的一個(gè)最基本、最重要的共同公路。炎癥炎癥概念：3臨床表現(xiàn)：局部表現(xiàn)：紅、腫、熱、痛及功能障礙。紅、熱：血管擴(kuò)張、血流加速。腫脹：炎癥性充血、液體和細(xì)胞成分滲出。疼痛：滲出物壓迫和炎癥介質(zhì)直接作用于神經(jīng)末梢。功能障礙：在以上病變基礎(chǔ)上基于部位性質(zhì)和嚴(yán)重程度不同引起不同的功能障礙。全身反應(yīng)：發(fā)熱、外周白細(xì)胞變化等。發(fā)熱：致炎因子作用于機(jī)體，通過(guò)各種細(xì)胞因子作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，產(chǎn)熱增加，散熱減少，體溫升高。白細(xì)胞變化：中性粒細(xì)胞增加-細(xì)菌感染引起的急性炎癥早期和化膿性炎癥。淋巴細(xì)胞增加-慢性炎癥和病毒感染。嗜酸性粒細(xì)胞增加-過(guò)敏或寄生蟲(chóng)感染。白細(xì)胞減少-病毒、立克次體、傷寒等臨床表現(xiàn)：4常見(jiàn)致炎因素：物理因素（高熱低溫、紫外線、放射線等）化學(xué)因素（強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、松節(jié)油、芥子氣等）機(jī)械因素（切割、撞擊、擠壓等）生物因素（細(xì)菌、病毒、立克次體、支原體、真菌等）免疫因素（各種變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病等）炎癥基本病理變化：變質(zhì)、滲出、增生變質(zhì)--炎癥局部組織所發(fā)生的變性或壞死滲出--炎癥局部組織血管內(nèi)的液體和白細(xì)胞通過(guò)血管壁進(jìn)入間質(zhì)和漿膜腔的過(guò)程。以血管反應(yīng)為中心的滲出病變是炎癥的標(biāo)志。增生--炎癥局部的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞的增生。炎癥是損傷（變質(zhì)）、抗損傷（滲出）、修復(fù)（增生）三位一體的過(guò)程。常見(jiàn)致炎因素：5炎癥過(guò)程及參與炎癥反應(yīng)的組織成分：吞噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞）、血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞，受刺激后活化，產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì)，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。激活的巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞能殺滅病原體，清除異物，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。炎癥的防御作用及潛在危害：防御作用對(duì)機(jī)體有利，消除致病因子，液體的滲出可稀釋毒素，吞噬搬運(yùn)壞死組織以利于再生和修復(fù)，使致病因子局限在炎癥部位而不致蔓延全身。危害：嚴(yán)重過(guò)敏危及生命、喉部嚴(yán)重水腫可致窒息、腦膜炎可致顱內(nèi)壓升高壓迫中樞而至死亡，炎癥性瘢痕可致腸梗阻或關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等。炎癥過(guò)程及參與炎癥反應(yīng)的組織成分：6炎癥的分類(lèi)急性炎癥慢性炎癥起病起病急驟，持續(xù)時(shí)間短持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)特征以滲出病變?yōu)樘卣饕栽錾∽優(yōu)橹餮准?xì)胞浸潤(rùn)以中性粒細(xì)胞為主以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主程度此類(lèi)炎癥反應(yīng)劇烈，組織和器官在短期內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的損害，甚至導(dǎo)致機(jī)體死亡致炎因子毒力較弱，但持續(xù)存在并引起異常免疫反應(yīng)，全身癥狀不明顯，但常有嚴(yán)重的繼發(fā)功能障礙炎癥的分類(lèi)急性炎癥慢性炎癥起病起病急驟，持續(xù)時(shí)間短持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)7抗炎實(shí)驗(yàn)方法非特異性炎癥模型早期炎癥模型毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)法：耳腫脹、腹腔染料滲出–毛細(xì)血管擴(kuò)張及通透性亢進(jìn)急性關(guān)節(jié)腫脹實(shí)驗(yàn)：足腫脹—滲出、水腫中期炎癥模型：羧甲基纖維素囊法—血小板黏附、白細(xì)胞游走晚期炎癥模型：棉球肉芽腫法–纖維組織增生、肉芽屏障形成抗炎實(shí)驗(yàn)方法非特異性炎癥模型8特異性炎癥模型大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎：常作為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。將福氏完全佐劑（FCA）皮內(nèi)注入大鼠足跖或尾根部致炎，歷經(jīng)急性局部炎癥（第1-4天）、急性炎癥緩解（7-12天）、以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征的慢性周身炎癥（10-28天）及永久性關(guān)節(jié)畸形（第35天以后）等四個(gè)階段。本病的發(fā)生與單核細(xì)胞的異常活化和抑制性T細(xì)胞功能的降低有關(guān)。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎：將II型膠原（關(guān)節(jié)軟骨的一種主要成分）加入福氏不完全佐劑（FICA）中，皮內(nèi)注入大鼠足跖或尾根部致炎。反應(yīng)與大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎相似?？乖T導(dǎo)關(guān)節(jié)炎：將抗原加入FCA中，給家兔皮內(nèi)注射致敏，2-3周后，給已致敏兔的一側(cè)關(guān)節(jié)內(nèi)注射抗原，其關(guān)節(jié)病變的病理組織學(xué)和慢性過(guò)程，與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相似。被動(dòng)轉(zhuǎn)移關(guān)節(jié)炎：用ConA活化佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的脾淋巴細(xì)胞，將其與IgG一起靜脈注射受體鼠，3天后出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，第13-15天，病變最嚴(yán)重，可見(jiàn)四肢關(guān)節(jié)廣泛性骨質(zhì)疏松、骨膜增厚等，最后引起關(guān)節(jié)畸變。一般認(rèn)為該模型較其它模型更接近人的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。特異性炎癥模型9炎性介質(zhì)的分類(lèi)雖然部分致炎因子可直接引起局部組織發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，但多數(shù)急性炎癥過(guò)程是由一系列內(nèi)源性化學(xué)因子介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，這類(lèi)化學(xué)因子稱為炎癥介質(zhì)。包含細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)和體液中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)。細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)：血管活性胺、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞產(chǎn)物、細(xì)胞因子、血小板活化因子、神經(jīng)肽、NO體液中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)：補(bǔ)體系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)。炎性介質(zhì)的分類(lèi)雖然部分致炎因子可直接引起局部組織發(fā)生急性炎癥101，血管活性胺（組胺和5-羥色胺）組胺：存在于肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的顆粒中，也存在于血小板顆粒中。可引起細(xì)動(dòng)脈擴(kuò)張、細(xì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞收縮，導(dǎo)致血管通透性升高。對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞有趨化作用。5-羥色胺：由血小板釋放，與血管通透性升高有關(guān)。2，花生四烯酸代謝產(chǎn)物：（前列腺素、白三烯）1，血管活性胺（組胺和5-羥色胺）11炎癥過(guò)程中花生四烯酸的代謝膜磷脂花生四烯酸5-HPETEPGG2血小板活化因子PAFPGH2PGI2PGF2PGE2TXA2白三烯A4（LTA4）LTB4LTC4，LTD4，LTE4痛敏感血管擴(kuò)張，血小板解聚收縮支氣管致痙原血管舒張、痛敏感、致熱血小板聚集、血管收縮趨化作用血管收縮、支氣管收縮、血管通透性增加環(huán)氧酶5-脂氧酶血管舒張、通透性增加、支氣管收縮、趨化作用PGD2磷脂酶A2炎癥過(guò)程中花生四烯酸的代謝膜磷脂花生四烯酸5-HPETEPG123，白細(xì)胞產(chǎn)物：活性氧代謝產(chǎn)物：氧化應(yīng)激：是1990年美國(guó)提出的一種病生理概念，是指機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境有害刺激的條件下，體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）所引起的細(xì)胞和組織的生理和病理反應(yīng)。ROS有超氧陰離子（O2-）、羥自由基（OH-）和過(guò)氧化氫（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO-）等等。由于它們可以直接或間接氧化或損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，可誘發(fā)基因的突變、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過(guò)氧化，被認(rèn)為是人體衰老和各種重要疾病如腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病（老年癡呆）、糖尿病等等最主要的危險(xiǎn)因子。除殺傷細(xì)菌外，還可釋放到細(xì)胞外引起多種細(xì)胞因子表達(dá)增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)1，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管通透性增加，2，滅活抗蛋白酶，導(dǎo)致蛋白酶活性增加，可破壞組織結(jié)構(gòu)成分3，損傷紅細(xì)胞和其他實(shí)質(zhì)細(xì)胞中性粒細(xì)胞溶酶體成分：中性粒細(xì)胞的死亡、吞噬泡形成過(guò)程中的外溢及出胞作用，溶酶體成分可外釋，介導(dǎo)急性炎癥。3，白細(xì)胞產(chǎn)物：134，細(xì)胞因子：主要由激活的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。見(jiàn)后5，血小板活化因子（PAF）：激活血小板，引起血小板粘附、聚集、釋放組胺、5-HT，還能活化單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性、促進(jìn)白細(xì)胞聚焦和粘著以及趨化作用。此外還具有影響全身血流動(dòng)力學(xué)的功能。嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均能釋放PAF，PAF一方面可直接作用于靶細(xì)胞，還可刺激細(xì)胞合成其他炎癥介質(zhì)，特別是PG和白三烯的合成。6，神經(jīng)肽：例如P物質(zhì)，可直接和間接刺激肥大細(xì)胞脫顆粒，通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8以及巨噬細(xì)胞蛋白-1β，引起血管擴(kuò)張和通透性增加；血管活性腸肽（VIP）可抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和改變其顆粒內(nèi)容物，抑制前炎癥因子IL-6、IL-12、TNF-α和iNOS的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥的作用；降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）有較強(qiáng)的舒張真皮微血管作用，又能刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞活化，使其分泌趨化因子IL-8，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的粘附作用。4，細(xì)胞因子：147，一氧化氮NO：生理狀況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞有少量NO產(chǎn)生，可松弛血管平滑肌，引起血管擴(kuò)張。炎癥和損傷，如缺血-再灌注損傷時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致NO生成減少；而單核巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等在LPS、TNF-α、IL-1、IFN作用下，產(chǎn)生大量NO。作用：一方面，NO可通過(guò)增加局部血流，促進(jìn)血漿的滲出和水腫的形成，引起細(xì)胞毒作用和組織損傷；另一方面，NO還具有抗炎作用，可減少血小板的聚集和粘附、抑制肥大細(xì)胞誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、減少急性炎癥灶內(nèi)的白細(xì)胞聚集，而阻斷NO的產(chǎn)生則可促進(jìn)白細(xì)胞的滾動(dòng)和粘著；NO有個(gè)不成對(duì)電子，可與白細(xì)胞的活性氧代謝產(chǎn)物結(jié)合，形成過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO-）和NO2等，通過(guò)破壞微生物的DNA、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)而殺滅之。7，一氧化氮NO：15體液中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)：補(bǔ)體系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)補(bǔ)體系統(tǒng)：C3和C5的激活最重要，C3a和C5a是重要的炎癥介質(zhì)，從以下三方面影響炎癥：1，C3a和C5a通過(guò)肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞增加血管通透性，引起血管擴(kuò)張；C5a還能激活花生四烯酸代謝的脂氧酶途徑，使中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎癥介質(zhì)；2，C5a是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化因子，通過(guò)激活中性粒細(xì)胞增加整合素的表達(dá)，引起中性粒細(xì)胞粘著于血管內(nèi)皮細(xì)胞；3，C3b結(jié)合于細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)具有調(diào)理素作用，可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬活性。體液中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)：補(bǔ)體系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)和纖維蛋白16激肽系統(tǒng)：血漿中的激肽原在激肽釋放酶作用下裂解生成具有活性的緩激肽，緩激肽可引起細(xì)動(dòng)脈擴(kuò)張、內(nèi)皮細(xì)胞收縮、細(xì)靜脈通透性增加，還可使血管以外的平滑肌收縮以及在炎癥局部產(chǎn)生疼痛。緩激肽作用十分短暫，很快被血漿和組織中的激肽酶滅活，其作用主要局限在血管通透性增加的早期。激肽釋放酶本身也具有趨化性，能直接使C5轉(zhuǎn)化為C5a。凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)：凝血酶在使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的過(guò)程中釋放纖維蛋白多肽，凝血酶可促使白細(xì)胞粘著和成纖維細(xì)胞增生，纖維蛋白多肽可使血管通透性增高，同時(shí)具有白細(xì)胞趨化作用。纖維蛋白溶解系統(tǒng)可通過(guò)激肽系統(tǒng)引起炎癥的血管變化。由內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和其他組織產(chǎn)生的纖維蛋白溶解原激活因子，能使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白溶酶，表現(xiàn)出炎癥活性：?jiǎn)?dòng)緩激肽的生成過(guò)程、裂解C3生成C3a、降解纖維蛋白產(chǎn)生裂解產(chǎn)物，使血管通透性增加。激肽系統(tǒng)：17炎癥介質(zhì)的特點(diǎn)特點(diǎn)：炎性介質(zhì)來(lái)自白細(xì)胞和血漿，前者以顆粒形式儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)，需要時(shí)或在致炎因子作用下合成并釋放；后者以前體形式存在于血漿中，經(jīng)蛋白水解酶裂解才能被激活。多數(shù)炎性介質(zhì)通過(guò)與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮生物活性，少數(shù)本身具有酶活性。炎性介質(zhì)可使靶細(xì)胞產(chǎn)生第二級(jí)炎性介質(zhì)，后者的作用可以與原介質(zhì)相同或相似，也可以截然相反。一種炎性介質(zhì)可作用于一種或多種靶細(xì)胞，其產(chǎn)生的效果取決于細(xì)胞和組織的類(lèi)型。炎性介質(zhì)一旦被激活或由細(xì)胞釋放，存在的時(shí)間很短。大多數(shù)炎性介質(zhì)具有潛在的致?lián)p傷能力。炎癥介質(zhì)的特點(diǎn)特點(diǎn)：18主要炎癥介質(zhì)的作用功能主要炎癥介質(zhì)種類(lèi)血管擴(kuò)張組胺、緩激肽、前列腺素、NO血管通透性增高組胺、緩激肽、C3a、C5a、LTC4、LTD4、LTE4、PAF、活性氧代謝產(chǎn)物、P物質(zhì)趨化作用LTB4、C5a、細(xì)菌產(chǎn)物、中性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、IL-8、TNF發(fā)熱IL-1、IL-6、TNF、PG疼痛PGE2、緩激肽組織損傷氧代謝產(chǎn)物、溶酶體酶、NO主要炎癥介質(zhì)的作用功能主要炎癥介質(zhì)種類(lèi)血管擴(kuò)張組胺、緩激肽、19抗炎免疫中藥的作用機(jī)制

興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的釋放作用于細(xì)胞因子調(diào)節(jié)一氧化氮水平調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激/抗氧化平衡調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)基因轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的調(diào)控作用抗炎免疫中藥的作用機(jī)制興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進(jìn)腎上腺皮201，興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的釋放

下丘腦-垂體-腎上腺軸促腎上腺皮質(zhì)激素分泌激素促腎上腺皮質(zhì)激素GC1，興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的釋放

下丘腦21人參皂苷大鼠腹腔注射后，血漿內(nèi)皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平的升高相平行，提示其促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素分泌的始初部位可能在垂體前葉。人參皂苷在使血漿皮質(zhì)酮升高時(shí)腎上腺內(nèi)cAMP含量也相應(yīng)升高，但于去垂體大鼠，人參皂苷則失去了升高腎上腺cAMP的作用，表明人參皂苷興奮腎上腺皮質(zhì)功能的作用必須通過(guò)垂體前葉，即首先釋放垂體前葉ACTH才能得以實(shí)現(xiàn)。柴胡皂苷能使腎上腺增重，胸腺萎縮，柴胡皂苷a，d能興奮垂體前葉分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）促進(jìn)腎上腺合成和分泌腎上腺皮質(zhì)激素；還能提高糖皮質(zhì)激素與其受體的親和力，進(jìn)而增加糖皮質(zhì)激素的抗炎作用。人參皂苷大鼠腹腔注射后，血漿內(nèi)皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平的22白芍總苷對(duì)正常大鼠的下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPAA）呈現(xiàn)小劑量興奮（血漿皮質(zhì)醇CS含量升高），大劑量抑制（血漿皮質(zhì)醇CS含量降低）的劑量依賴性調(diào)節(jié)作用。白芍總苷在降低束縛應(yīng)激大鼠血漿CS、ACTH水平的同時(shí)，上調(diào)受抑制的大鼠脾淋巴細(xì)胞ConA增殖反應(yīng)，提示白芍總苷的免疫調(diào)節(jié)作用可能與其調(diào)節(jié)HPAA的功能有關(guān)。青藤堿降低大鼠腎上腺維生素C的含量，切除大鼠腎上腺或垂體后，青藤堿的抗炎作用消失。黃褐毛忍冬總皂苷能使幼年大鼠胸腺萎縮，摘除雙側(cè)腎上腺后對(duì)大鼠角叉菜膠性足腫脹的抑制作用消失，也不能延長(zhǎng)切除腎上腺幼年大鼠的生存時(shí)間，表明抗炎作用有賴于腎上腺的完整存在。白芍總苷對(duì)正常大鼠的下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPAA）呈現(xiàn)小23云南白藥總苷給大鼠皮下注射15mg/kg，連續(xù)7天，可顯著降低腎上腺內(nèi)抗壞血酸含量，抑制幼年小鼠胸腺生長(zhǎng)，提示其抗炎作用部分可能通過(guò)腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)產(chǎn)生。娑羅子皂苷5mg/kg腹腔注射一次給藥，可顯著降低清醒大鼠及戊巴比妥鈉麻醉大鼠腎上腺內(nèi)維生素C含量，表明本品通過(guò)刺激腎上腺皮質(zhì)發(fā)揮作用；給大鼠腹腔注射B-七葉皂苷5mg/kg可使血漿中的皮質(zhì)甾酮明顯升高，引起ACTH分泌增加，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)甾酮的合成。雪蓮黃酮5mg/kg腹腔注射對(duì)去腎上腺大鼠蛋清性足腫脹無(wú)明顯抑制作用，致炎后4h后才表現(xiàn)出顯著性差異，提示抗炎途徑主要是通過(guò)腎上腺皮質(zhì)發(fā)揮作用。大鼠腹腔注射雪蓮黃酮可使大鼠腎上腺維生素C含量明顯減少，進(jìn)一步證實(shí)該藥主要通過(guò)促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)功能而發(fā)揮抗炎作用。云南白藥總苷給大鼠皮下注射15mg/kg，連續(xù)7天，可顯著降242，作用于細(xì)胞因子細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞所分泌的能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、調(diào)節(jié)免疫功能，參與炎癥發(fā)生和創(chuàng)傷愈合等小分子多肽的通稱，包含白介素、干擾素、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族（TGF-β）等。它們由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等產(chǎn)生。現(xiàn)已證實(shí)細(xì)胞因子在局部炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起重要作用，IL-1,IL-6,IL-8和TNF等是公認(rèn)的促炎癥細(xì)胞因子。機(jī)體在致炎因子的作用下，可引起多種細(xì)胞產(chǎn)生和釋放細(xì)胞因子，如IL-1、TNF-α、PGE2等，誘導(dǎo)iNOS生成，促進(jìn)NO合成和釋放，這些因子互相影響，促進(jìn)炎癥發(fā)展。當(dāng)機(jī)體在重度感染時(shí)，腹腔巨噬細(xì)胞受到大量脂多糖刺激，產(chǎn)生大量的IL-1、IL-6、TNF等，它們相互誘生，相互協(xié)同。這些細(xì)胞因子的過(guò)量存在，進(jìn)一步激活多形核白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，并釋放氧自由基、蛋白酶等，加速花生四烯酸代謝，釋放血栓素、前列腺素、白三烯等炎癥介質(zhì)，形成瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致過(guò)度炎癥反應(yīng)。2，作用于細(xì)胞因子25IL-1是由多種細(xì)胞合成和分泌的細(xì)胞因子，按其結(jié)構(gòu)主要分為IL-1α和IL-1β兩種，后者為其主要分泌形式。IL-1與炎癥關(guān)系極為密切，它可使中性粒細(xì)胞聚集和發(fā)生急性反應(yīng)，還可引起其他炎性因子的產(chǎn)生，可以通過(guò)誘導(dǎo)COX-2基因的表達(dá)，使前列腺素的分泌增加而參與介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)。IL-1β不僅能夠協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)B、T細(xì)胞活化，而且能夠誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，加強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，屬于一種前炎性細(xì)胞因子。TNF是一種主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的蛋白，可分為T(mén)NF-α和TNF-β兩大類(lèi)。其中TNF-α可由感染、缺血和損傷誘導(dǎo)，屬于前炎癥細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)功能。IL-1是由多種細(xì)胞合成和分泌的細(xì)胞因子，按其結(jié)構(gòu)主要分為I26發(fā)生炎癥時(shí)，單核巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生大量TNF-α和IL-1β，這兩種細(xì)胞因子具有許多相同的生物活性：如致熱作用、促進(jìn)細(xì)胞分解代謝、產(chǎn)生急性反應(yīng)期蛋白以及使內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO、PGI2、PGE2和血小板活化因子等，這將導(dǎo)致炎癥面積的擴(kuò)大以及炎癥介質(zhì)、破壞性酶類(lèi)、自由基分泌的增加。IL-1β還可通過(guò)自分泌或旁分泌刺激其他炎癥介質(zhì)如IL-6,IL-8和TNF-α的產(chǎn)生。TNF-α則可使中性粒細(xì)胞聚集、內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子上調(diào)以及增加上皮緊密連接的通透性和抑制上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)等。發(fā)生炎癥時(shí)，單核巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生大量TNF-α和IL-1β，這27IL-1和TNF在炎癥中的主要作用細(xì)菌產(chǎn)物、免疫復(fù)合素、毒素、物理?yè)p傷、細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞（其他細(xì)胞）激活內(nèi)皮細(xì)胞效應(yīng)：促進(jìn)白細(xì)胞粘著PG合成增多PAF合成增多凝血活性增高抗凝血活性下降IL-1分泌增多急性反應(yīng)期：發(fā)熱、嗜睡、食欲不振急性期蛋白升高血液流變學(xué)改變中性粒細(xì)胞增多纖維母細(xì)胞作用：促進(jìn)纖維母細(xì)胞增殖膠原合成增加膠原酶分泌增加蛋白酶分泌增加PGE合成增加IL-1/TNFIL-1和TNF在炎癥中的主要作用細(xì)菌產(chǎn)物、免疫復(fù)合素、毒素28A，對(duì)白細(xì)胞介素的影響：商陸皂苷甲對(duì)人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的TNF有明顯的抑制作用，且能抑制LPS誘導(dǎo)的兔滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1、和TNF，認(rèn)為抑制IL-1、和TNF的產(chǎn)生可能是商陸皂苷甲強(qiáng)大抗炎作用的機(jī)制之一。青藤堿可抑制IL-2R的表達(dá)，從而阻斷IL-2信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)并改善類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀和體征，這可能是其治療該病的機(jī)制之一。雷公藤總苷可有效降低AA大鼠血清中細(xì)胞因子IL-1、IL-6，降低AA大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、IL-8、TNF的含量，抑制AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌的IL-1、IL-6、IL-8、TNF和脾淋巴細(xì)胞誘生的IL-6、IL-8的能力。A，對(duì)白細(xì)胞介素的影響：29B，促進(jìn)干擾素生成：人參三醇型皂苷促進(jìn)人頸部淋巴細(xì)胞-干擾素誘生，促進(jìn)-干擾素基因表達(dá)伴有活性增強(qiáng)。黃芪多糖、人參多糖、柴胡多糖、刺五加多糖當(dāng)歸多糖等均能誘生干擾素。C，對(duì)TNF的影響：白芍總苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF具有雙向調(diào)節(jié)作用。另外白芍總苷可抑制原代培養(yǎng)的AA大鼠滑膜細(xì)胞過(guò)度分泌IL-1、TNF和PGE2等炎性細(xì)胞因子的能力，并使異常活化的滑膜細(xì)胞細(xì)胞因子降至正常。B，促進(jìn)干擾素生成：303，調(diào)節(jié)一氧化氮水平NO由NOS催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)而生成，具有活躍的生化性質(zhì)。NO在炎癥及其免疫機(jī)制中發(fā)揮雙重作用：它能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)外微生物和腫瘤細(xì)胞的活性；同時(shí)它又介導(dǎo)細(xì)胞毒性。一般地說(shuō)，組織中誘生型NO合酶（iNOS）在炎癥中被誘導(dǎo)生成，產(chǎn)生大量NO，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，包括使血管舒張，形成水腫和局部紅斑，增加炎性滲出，細(xì)胞毒性以及細(xì)胞因子依賴過(guò)程的介導(dǎo)作用，促進(jìn)敗血癥的發(fā)展，激活PG合成酶以及參與類(lèi)風(fēng)濕的發(fā)展等。相反的，由內(nèi)皮細(xì)胞中原生型NO合酶（cNOS）所產(chǎn)生的NO，則通過(guò)激活微血管中的中性粒細(xì)胞，抑制白細(xì)胞和血小板在內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附，抑制淋巴細(xì)胞增殖，抑制巨噬細(xì)胞的氧化產(chǎn)物，而發(fā)揮其保護(hù)作用及抑制炎癥反應(yīng)的作用。受到抗原、LPS以及某些細(xì)胞因子刺激時(shí)多種免疫活性細(xì)胞表達(dá)iNOS并產(chǎn)生大量NO，抑制特異性免疫反應(yīng)，觸發(fā)免疫病理過(guò)程而造成組織損傷，調(diào)整NO水平有助于許多自身免疫疾病的治療。3，調(diào)節(jié)一氧化氮水平NO由NOS催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步31

雷公藤總苷對(duì)LPS激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的NO生成具有明顯的抑制作用，呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，提示雷公藤總苷的抗炎及免疫抑制作用可能與其抑制巨噬細(xì)胞一氧化氮生成有關(guān)。白芍總苷50mg/kg治療7天上調(diào)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠細(xì)胞低下ConA反應(yīng)是其下調(diào)腹腔巨噬細(xì)胞NO等抑制介質(zhì)的結(jié)果；使佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO、TNF產(chǎn)生降低或恢復(fù)，白芍總苷能使AA大鼠14、21、28d低下脾細(xì)胞增殖反應(yīng)恢復(fù)正常，同時(shí)還使其過(guò)低的SOD活性增高或恢復(fù)正常。雷公藤總苷對(duì)LPS激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的NO324，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抗氧化平衡ROS和氧化應(yīng)激：是一把“雙刃劍”，產(chǎn)生過(guò)多，作用不當(dāng)?shù)拇_可以引起細(xì)胞凋亡和組織損傷，誘發(fā)多種疾病。但體內(nèi)還有強(qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)，如超氧化歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-PrX）等等，可以及時(shí)快速清除體內(nèi)過(guò)剩的ROS。在正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)平衡，既保證正常氧化應(yīng)激反應(yīng)，又防止ROS對(duì)人體的危害。只有在ROS生成過(guò)盛，抗氧化酶表達(dá)不足，氧化和抗氧化平衡失調(diào)，ROS不能及時(shí)清除和體內(nèi)大量積蓄，才會(huì)引起細(xì)胞和組織的損傷，危害人體的健康。氧化和抗氧化的平衡和諧是健康的基礎(chǔ)。4，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抗氧化平衡ROS和氧化應(yīng)激：33氧化應(yīng)激和抗氧化不單純是一種生化反應(yīng)，它更有著極其復(fù)雜的細(xì)胞和分子機(jī)制，包括膜氧化、線粒體代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、核的重構(gòu)、DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、泛素和泛素化、自吞和溶酶體、細(xì)胞外基質(zhì)、信號(hào)傳遞、蛋白折疊等多重的細(xì)胞和分子改變。它們還是體內(nèi)多種代謝和信號(hào)通路的啟動(dòng)者和調(diào)節(jié)者，如JNK/SAPK、P38MAPK、IKK/NF-κB等；激活和調(diào)控各種轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、Nrf2、NF-κB、p53等，影響體內(nèi)各種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與體內(nèi)炎癥、免疫、生殖、發(fā)育、代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞再生、修復(fù)等各種重要生命過(guò)程的調(diào)節(jié)。氧化應(yīng)激和抗氧化不單純是一種生化反應(yīng)，它更有著極其復(fù)雜的細(xì)胞34Nrf2（nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor2）是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，為鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，在細(xì)胞調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞對(duì)抗外來(lái)異物和氧化損傷中發(fā)揮重要作用。正常情況下，Nrf2定位于細(xì)胞質(zhì)中并與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Keap1相互作用，可被泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當(dāng)受到來(lái)源于活性氧的信號(hào)攻擊后，Nrf2從Keap1中解離，然后穩(wěn)定狀態(tài)的Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與其它的bZIP蛋白結(jié)合成異二聚體，異二聚體通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）相互作用調(diào)控靶基因Ⅱ相酶的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，這些酶能夠保護(hù)機(jī)體免受毒性物質(zhì)（如致癌物、藥物代謝活化產(chǎn)物等）及一些活性氧的侵害。受到氧化沖擊時(shí)，Nrf2的激活和隨后的細(xì)胞保護(hù)基因的誘導(dǎo)可以恢復(fù)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，其在細(xì)胞的防御保護(hù)中發(fā)揮重要作用。Nrf2（nuclearfactor-erythroid35內(nèi)源性Nrf2參與炎癥反應(yīng)與創(chuàng)傷修復(fù)，創(chuàng)傷后上皮細(xì)胞Nrf2有高表達(dá)，Nrf2缺失則炎性因子IL-1β、TNFα持續(xù)增高，創(chuàng)傷上皮修復(fù)期延長(zhǎng)。Nrf2-Keap1系統(tǒng)在細(xì)胞抵御外源性或內(nèi)源性氧化應(yīng)激的機(jī)制中有重要地位。目前認(rèn)同的Nrf2激活機(jī)制包括Nrf2與Keap1的解偶連、蛋白酶對(duì)Nrf2的降解減弱、Nrf2磷酸化等。Nrf2缺失或激活障礙，會(huì)引起細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的敏感性增高，與化學(xué)促癌的發(fā)生、炎癥修復(fù)進(jìn)程延長(zhǎng)、細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞調(diào)亡等病變過(guò)程密切相關(guān)。內(nèi)源性Nrf2參與炎癥反應(yīng)與創(chuàng)傷修復(fù)，創(chuàng)傷后上皮細(xì)胞Nrf36Nrf2-ARE通路在氧化應(yīng)激中的調(diào)控作用

Nrf2-ARE通路在氧化應(yīng)激中的調(diào)控作用375，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路

A，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑1）NF-κB的功能NF-κB是一種分布和作用均十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，功能性NF-κB結(jié)合序列存在于許多基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中，故NF-κB可與許多基因上的啟動(dòng)子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，控制著細(xì)胞因子、粘附因子、生長(zhǎng)因子、酶（COX-2、iNOS）、神經(jīng)肽等多種靶基因的表達(dá)，在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。5，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路

A，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑38靜止細(xì)胞中的NF-κB與IκB結(jié)合以非活性異寡聚體的形式存在于胞漿中。細(xì)胞受刺激后，由信號(hào)誘導(dǎo)激活的IκB激酶（IKK）引起IκBα蛋白第32位絲氨酸的磷酸化，磷酸化的IκB則由泛素蛋白在多個(gè)位點(diǎn)形成泛素化，泛素化后的IκBα被26S蛋白酶小體降解，暴露出Rel蛋白上的核定位信號(hào)NLS，NF-κB遂從三聚體上釋放出來(lái)，迅速移位入細(xì)胞核與靶基因上啟動(dòng)子區(qū)特定的κB位點(diǎn)DNA序列發(fā)生特異性結(jié)合，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成。NF-κB在核內(nèi)與新合成的IκB結(jié)合后出核，進(jìn)入胞漿，從而失活。靜止細(xì)胞中的NF-κB與IκB結(jié)合以非活性異寡聚體的形式存在39NF-κB為氧化應(yīng)激反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，可被多種能引起胞漿IκB磷酸化或被體內(nèi)泛素/蛋白酶體系識(shí)別而降解的因素所激活，如過(guò)氧化氫、活性氧（ROS）、促炎性細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β、氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣增加、促T細(xì)胞和B細(xì)胞分裂劑、細(xì)菌、病毒及內(nèi)毒素等。其中ROS可能是激活I(lǐng)KK的共同第二信使，NF-κB的各誘導(dǎo)因素可能通過(guò)產(chǎn)生ROS激活I(lǐng)KK，使IκB快速磷酸化，此激活過(guò)程可在細(xì)胞受刺激后數(shù)分鐘內(nèi)完成。不同抗氧化劑均能抑制NF-κB活化，抑制粘附分子表達(dá)。NF-κB為氧化應(yīng)激反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，可被多種能引起胞漿IκB40抗炎中藥機(jī)理教材課件412）.NF-κB活化調(diào)節(jié)與炎癥性疾病NF-κB是前炎癥因子基因表達(dá)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵成分之一，它誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子等的表達(dá)。NF-κB在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腹瀉、多發(fā)性硬化癥、哮喘等。用NF-κB特異性抗體進(jìn)行組織切片染色顯示核定位的NF-κB活性的增加，同時(shí)伴有炎癥細(xì)胞聚集的增加和前炎癥細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和TNF的合成。2）.NF-κB活化調(diào)節(jié)與炎癥性疾病42NF-κB的活化在體內(nèi)受到精細(xì)的調(diào)控,包括正負(fù)反饋調(diào)控途徑：(1)正反饋調(diào)節(jié)途徑：細(xì)胞受到前炎癥因子如TNF-α、IL-1刺激，經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB，增強(qiáng)TNF-α、IL-1的轉(zhuǎn)錄，后者水平增高可進(jìn)一步活化NF-κB，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。(2)負(fù)反饋調(diào)節(jié)途徑：NF-κB激活的同時(shí)，IκBα和p105基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，IκBα和p105基因的順式作用元件中均含有NF-κB的結(jié)合序列，抑制成分增多，一方面與細(xì)胞漿中NF-κB二聚體結(jié)合，將其限制在細(xì)胞漿中，下調(diào)NF-κB活化水平，細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄被終止而限制炎癥反應(yīng)；另一方面IκBα可連續(xù)穿梭于核質(zhì)間，將大量入核的活化NF-κB再次帶回胞漿，避免NF-κB的過(guò)渡活化。NF-κB的活化在體內(nèi)受到精細(xì)的調(diào)控,包括正負(fù)反饋調(diào)控途徑：43這兩種調(diào)節(jié)同時(shí)存在，NF-κB的狀態(tài)取決于占優(yōu)勢(shì)的調(diào)節(jié)方式。研究證實(shí)，通過(guò)IKβ亞單位的磷酸化，正負(fù)反饋調(diào)節(jié)IκB激酶活性。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，受TNF、IL-1等前炎癥因子刺激后,IKKβT環(huán)中二個(gè)Ser殘基的磷酸化是IKK活化的基礎(chǔ)。而將IKKα中二個(gè)Ser殘基消除，并不影響IKK的活化。因此,IKKβ是前炎癥刺激的靶單位。IKK一旦活化，IKKβ在C末端富含的Ser自動(dòng)磷酸化，這種磷酸化可降低IKK活性，可防止炎癥反應(yīng)的過(guò)渡，從而起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。這兩種調(diào)節(jié)同時(shí)存在，NF-κB的狀態(tài)取決于占優(yōu)勢(shì)的調(diào)節(jié)方式。44NF-κB調(diào)節(jié)的蛋白包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、粘附分子、免疫受體、轉(zhuǎn)錄因子、氧化應(yīng)激相關(guān)酶以及急性期蛋白等。眾多的研究表明NF-κB參與炎癥和免疫反應(yīng)、某些疾病的病理產(chǎn)生、急性期反應(yīng)、細(xì)胞周期控制與分化以及對(duì)病毒感染的反應(yīng)等。所以NF-κB是非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，與藥物研究有密切的關(guān)系。NF-κB調(diào)節(jié)的蛋白包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、粘附分45B，MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，普遍存在于多種生物，包括酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括JNK、p38、ERK1等亞族。MAPK在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子生成中起著重要的作用，其中p38和ERK1通路與炎癥反應(yīng)有著密切的關(guān)系。B，MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介導(dǎo)46研究發(fā)現(xiàn)，ERK通路在某些生長(zhǎng)因子刺激引起的細(xì)胞反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用，還參與應(yīng)激刺激、細(xì)菌產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)等引起的細(xì)胞反應(yīng)；p38蛋白激酶可被促炎因子、應(yīng)激刺激以及LPS等激活，在炎癥反應(yīng)中起主要作用，炎癥刺激如LPS、TNF、IL-1等均可介導(dǎo)單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等先天性免疫細(xì)胞中p38MAPK激活，單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF、IL-1、IL-6、IL-8和環(huán)加氧酶-2均依賴p38MAPK。研究發(fā)現(xiàn)，ERK通路在某些生長(zhǎng)因子刺激引起的細(xì)胞反應(yīng)中起重要47LPS介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)是一個(gè)典型的病原體與機(jī)體相互作用的過(guò)程。LPS刺激細(xì)胞能夠激活ERK、JNK和p38，然后作用于各自的底物，影響多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而調(diào)節(jié)包括TNF、IL-1、IL-6、IL-8等多種細(xì)胞因子在內(nèi)的基因的表達(dá)。而TNF-α、IL-1、花生四烯酸(AA)產(chǎn)物、內(nèi)皮素等多種炎癥介質(zhì)能激活不同MAPK，通過(guò)促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控其它炎癥介質(zhì)的生成。LPS介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)是一個(gè)典型的病原體與機(jī)體相互作用的過(guò)48研究發(fā)現(xiàn)LPS可激活Raw264.7細(xì)胞p38，使其移位入核；p38激活入核后參與了LPS誘導(dǎo)的TNF-α基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控。ERK、JNK和p38通路都能被TNF-α強(qiáng)烈激活，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的作用而影響TNF-α的產(chǎn)生和生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)LPS可激活Raw264.7細(xì)胞p38，使其移位入核49IL-1也是參與炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。它在炎癥中的主要作用包括刺激其它炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-6、IL-8和PGs等的釋放、激活T和B淋巴細(xì)胞。增加粘附分子的表達(dá)、刺激急性期蛋白的生成和釋放等。有報(bào)道，IL-1β能通過(guò)激活p38而上調(diào)PGE2和下調(diào)NO的合成。IL-1也是參與炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。它在炎癥中的主要作用包括50AA代謝產(chǎn)物前列腺素(PGs)和白三烯類(lèi)(LTs)在促進(jìn)炎癥的過(guò)程中起重要作用。ERK1/2激活可誘導(dǎo)COX-2生成，限制氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。COX是PG合成的限速酶，經(jīng)典抗炎藥水楊酸類(lèi)通過(guò)抑制其活性而減少PG的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)。P38通路和JNK通路激活后能上調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的COX表達(dá)，使PGE2合成增加，利用p38抑制劑能完全抑制這種作用。AA代謝產(chǎn)物前列腺素(PGs)和白三烯類(lèi)(LTs)在促進(jìn)炎癥51研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號(hào)途徑參與了LPS介導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)和NO產(chǎn)生。用ERK的特異性抑制劑處理細(xì)胞后可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞ERK的活性。與對(duì)照組相比，LPS刺激后的ECV304細(xì)胞iNOS蛋白和mRNA的表達(dá)明顯增加，培養(yǎng)基中NO水平也顯著升高，用ERK抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后，可顯著抑制細(xì)胞iNOS表達(dá)和NO和產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號(hào)途徑參與了LPS介導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞iNOS52研究表明，在LPS誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，p38MAPK可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上快速調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)。在小鼠內(nèi)毒素血癥模型中，發(fā)現(xiàn)在p38MAPK參與內(nèi)毒素性休克，iNOS在肺組織的表達(dá)最快、最顯著，提示在多器官功能障礙綜合癥的發(fā)生中肺是起始器官，p38MAPK和iNOS參與多器官功能障礙綜合癥過(guò)程中的起始反應(yīng)。研究表明，在LPS誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，p38MAPK可在轉(zhuǎn)錄53NF-κB在調(diào)節(jié)慢性炎癥疾病中粘附分子、酶和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄中起重要作用。p38MAPK能活化NF-κB。研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK特異性抑制劑可以抑制NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在中性粒細(xì)胞中,高泳動(dòng)類(lèi)蛋白1(HMGB1)活化p38MAPK，從而增加NF-κB的核轉(zhuǎn)移和致炎因子的表達(dá)；然而，NF-κB亞單位的磷酸化、核轉(zhuǎn)移和NF-κB與DNA結(jié)合不受p38MAPK抑制劑的影響。這說(shuō)明NF-κB和p38MAPK通過(guò)獨(dú)立的效應(yīng)通路活化，可能在細(xì)胞核內(nèi)有共同的下游通路。NF-κB在調(diào)節(jié)慢性炎癥疾病中粘附分子、酶和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄中54研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用ERK抑制劑或p38MAPK抑制劑，僅能部分降低LPS刺激的肺泡巨噬細(xì)胞因子IL-6和TNFmRNA表達(dá)，而聯(lián)合使用則能降低細(xì)胞因子基因表達(dá)，使之接近正常水平。說(shuō)明ERK和p38MAPK協(xié)同在LPS刺激的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用ERK抑制劑或p38MAPK抑制劑，僅能部556，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的調(diào)控作用A，調(diào)控細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)人參皂苷皮下注射，可逆轉(zhuǎn)IL-2、IL-2mRNA的受抑制狀態(tài)，使IL-2mRNA和IL-2蛋白含量顯著增加；人參三醇型皂苷對(duì)淋巴細(xì)胞分泌的IL-6有促進(jìn)作用，是通過(guò)對(duì)IL-6mRNA轉(zhuǎn)譯的直接促進(jìn)作用。B，影響核因子的結(jié)合活性明黨參多糖可顯著降低LPS刺激的NF-κB結(jié)合活性的升高，從而降低IL-1、TNF、IL-6等細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)揮抗炎抗應(yīng)激作用。6，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的調(diào)控作用56慢性炎癥致突變途徑示意圖慢性炎癥致突變途徑示意圖57雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎作用的機(jī)理研究楊偉鵬周鐘鳴中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所抗炎中藥機(jī)理教材課件58前言野生雪蓮（國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物）藥用價(jià)值高，資源有限，目前已瀕臨滅絕。雪蓮人工栽培周期較長(zhǎng)，多年生，投入高，占用土地，受自然條件限制。雪蓮的細(xì)胞培養(yǎng)周期短（僅需12天），有效成份得率高（總黃酮含量是野生雪蓮的8~9倍）成本低。研究雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎作用機(jī)理，為開(kāi)發(fā)我國(guó)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥提供實(shí)驗(yàn)方面的支持。前言野生雪蓮（國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物）藥用價(jià)值高，資源有限，目59研究?jī)?nèi)容：1.野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮的藥效學(xué)研究2.野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體內(nèi)外炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的影響3.雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響4.雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎作用的分子機(jī)制研究研究?jī)?nèi)容：60第一部分野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮的藥效學(xué)研究

表1野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)小鼠熱刺激甩尾的影響（x±s），n＝10組別劑量(mg/kg)鎮(zhèn)痛率（％）0.5h1h2h4h對(duì)照組

-16.5±25.5-1.54±21.5-2.02±14.5-4.59±16.1安痛定10ml/kg71.4±74.9**59.1±44.3**70.2±23.4**11.7±33.4培養(yǎng)總黃酮4038.9±20.8**46.5±20.8**64.9±30.1**40.3±43.4*2036.4±24.6**48.6±32.9**70.1±51.9**20.5±24.1*1044.6±89.340.4±54.8*34.5±52.512.4±43.3野生總黃酮4040.0±42.2**59.7±26.3**41.9±44.8*28.0±39.7*2032.3±28.7**37.3±33.5**19.3±26.4*15.6±23.5*1028.0±33.2**24.7±28.5*52.8±56.3*14.0±32.3注：與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01第一部分野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮的藥效學(xué)研究61圖1野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)小鼠耳廓腫脹的影響與模型組相比**P<0.01圖1野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)小鼠耳廓腫脹的影62圖2野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)大鼠角叉菜膠足腫脹的影響與模型組相比**P<0.01圖2野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)大鼠角叉菜膠足腫63圖3野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的影響與溶劑對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01圖3野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)64圖4野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響與溶劑對(duì)照組相比**P<0.01圖4野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)65野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮都具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制的作用，二者在鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制作用上沒(méi)有顯著性差別。野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮都具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑66第二部分野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體內(nèi)外炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的影響

表2野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)致炎大鼠血清IL-1含量的影響(x±s)注：與模型組相比，**P<0.01*P<0.05，以下同。組別動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）IL-1含量(ng/ml)空白組10-0.36±0.20模型組10-0.43±0.11野生總黃酮9400.14±0.06**8200.17±0.13**培養(yǎng)總黃酮9400.20±0.12**8200.26±0.05**9100.31±0.18氫化可的松10250.29±0.14*第二部分野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體內(nèi)外炎癥介67表3野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)致炎大鼠血清NO含量的影響(x±s)組別動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）NO含量（μmol/L）空白組10-2.26±0.61模型組10-6.61±2.26野生總黃酮9404.52±0.76*10205.54±1.6410105.13±1.08培養(yǎng)總黃酮10404.46±0.74*10204.11±1.73*10104.30±1.31*氫化可的松10253.24±1.00**表3野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)致炎大鼠血清NO68表4野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)炎大鼠血清PGE2含量的影響(x±s)，n=10組別給藥劑量（mg/kg）PGE2含量（ng/ml）空白組-266.00±20.81模型組-294.90±27.2野生總黃酮40238.60±27.09**20272.30±22.59培養(yǎng)總黃酮40271.70±34.6520263.30±35.77*10260.40±20.13**氫化可的松25263.50±18.40**表4野生雪蓮總黃酮、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)炎大鼠血清PGE69

野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮均能明顯抑制致炎鼠血清中的炎癥介質(zhì)NO、PGE2和炎性細(xì)胞因子IL-1的分泌而起到抗炎作用。野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮在抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的作用上無(wú)顯著性差異。

野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮均能明顯抑制致炎鼠血清70野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞IC50的測(cè)定。MTT法測(cè)定野生、培養(yǎng)雪蓮總黃酮的IC50，結(jié)果如圖：得到野生雪蓮總黃酮的IC50＝0.4377mg/ml.、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮的IC50＝0.8999mg/ml。圖5MTT法測(cè)定IC50

野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞I71表5野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞分泌NO含量的影響(x±s)，n=3組別給藥劑量（g/ml）NO含量（μmol/L）抑制率（％）正常-5.940.33

LPS511.460.98△△

野生總黃酮43.84.410.33**61．521.95.490.30**52．110.96.840.55**40．35.57.290.69**36．42.78.830.51*22．91.48.630.51*24．7培養(yǎng)總黃酮904.730.59*58．7457.230.59**36．922.57.990.48*30．311.29.110.77*20．55.611.581.73

-2.811.650.59

-注：模型組與對(duì)照組相比△△P<0.01,給藥組與模型組相比，**P<0.01*P<0.05，以下同。表5野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞72表6野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞分泌PGE2含量的影響(x±s)，n=3組別給藥劑量（g/ml）PGE2含量（pg/ml）抑制率（％）正常-1328.05386.46

LPS52535.17167.08△△

DMSO5l1459.47381.27

野生總黃酮43.81590.8298.9**37．321.92095.8178.21*17．310.91662.3242.24**34．45.51836.8344.63**27．52.71795.2279.5229．21.42079.45308.4618．0培養(yǎng)總黃酮452001.0130.52*21．122.51700.23291.20*32．911.21789.3473.5429．45.62176.3323.5514．22.82186.8325.3613．8表6野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞73表7野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞分泌IL-1含量的影響(x±s)，n=3

組別給藥劑量（g/ml）IL-1含量（ng/ml）抑制率（％）正常-0.180.06

LPS50.440.08△△

野生總黃酮43.80.230.04*47．721.90.220.07*50．010.90.310.1029．55.50.100.01*77．32.70.180.08*59．11.40.320.0727．3培養(yǎng)總黃酮900.240.04*45．5450.200.08*54．522.50.230.05*47．711.20.260.04*40．95.60.240.08*45．52.80.270.1038．6表7野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞74表8雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞分泌TNF含量的影響(x±s)，n＝6組別給藥劑量（g/ml）OD值抑制率（％）不含ACD

2.130.29

空白組

1.840.21

DMSO

1.770.16

LPS51.310.22△△

培養(yǎng)總黃酮451.500.12**41.322.51.370.2413.04.51.240.28-表8雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞分泌TNF含量75圖6雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞分泌IL-6含量的影響注：模型組與溶劑對(duì)照組相比△△P<0.01,給藥組與模型組相比，**P<0.01△△圖6雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞分泌IL-6含量76

野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)NO、PGE2以及炎性細(xì)胞因子IL-1具有顯著的抑制作用，二者無(wú)顯著性差異。雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF、IL-6也有顯著的抑制作用。

野生雪蓮總黃酮和雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞77第三部分雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響ABDEF實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1μg/ml、0.1μg/mlLPS雖可促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，但并沒(méi)有顯示出顯著性差異，而吲哚美辛和雪蓮總黃酮均可在LPS存在的基礎(chǔ)上進(jìn)一步顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。圖7Raw264.7細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（LPS1μg/mL）第三部分雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響ABDEF78圖8Raw264.7細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（LPS0.1μg/mL）圖8Raw264.7細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（LPS0.179第四部分雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎作用的

分子機(jī)制研究對(duì)RNA表達(dá)的影響提取細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAPCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳第四部分雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎作用的

分子機(jī)制研究對(duì)RN80COX-2（244bp）A：空白組；B：DMSO對(duì)照組；C：LPS刺激組；D：45g/ml；E：22.5g/ml；F：4.5g/ml；G：2.25g/ml；H：0.45g/ml；I：0.045g/mlGAPDH（358bp）

圖9.雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)的影響

ABCDEFGHI

COX-2（244bp）A：空白組；B：DMSO對(duì)81iNOS（499bp）

GAPDH（358bp）

a：空白組；b：DMSO對(duì)照組；c：LPS刺激組；d：45g/ml；e：4.5g/mll；f：0.45g/ml；g：0.045g/ml圖10.雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞iNOSmRNA表達(dá)的影響

abcdefgiNOS（499bp）GAPDH（358bp）a：空白組82IL-1β（529bp）

GAPDH（358bp）

A：空白組；B：DMSO對(duì)照組；C：LPS刺激組；D：45g/ml；E：22.5g/ml；F：4.5g/ml；G：2.25g/ml；H：0.45g/ml；I：0.045g/mlABCDEFGHI

圖11.雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞IL-1βmRNA表達(dá)的影響

IL-1β（529bp）GAPDH（358bp）A：空83

雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮能顯著抑制巨噬細(xì)胞COX-2、IL-1β、iNOSmRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制PGE2IL-1、NO的產(chǎn)生而達(dá)到抗炎效果。

雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮能顯著抑制巨噬細(xì)胞COX-2、IL-184NF-кBp65（404bp）

GAPDH（358bp）

A：空白組；B：DMSO對(duì)照組；C：LPS刺激組；D：45g/ml；E：22.5g/ml；F：4.5g/ml；G：2.25g/ml；H：0.45g/ml；I：0.045g/mlABCDEFGHI

圖12.雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞NF-кBp65

mRNA表達(dá)的影響

NF-кBp65（404bp）GAPDH（358bp85對(duì)蛋白表達(dá)的影響提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白Westernblot法測(cè)定蛋白表達(dá)圖13.雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞NF-кB、P38、ERK1胞漿蛋白、核蛋白的表達(dá)的影響對(duì)蛋白表達(dá)的影響圖13.雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞NF86雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮能顯著抑制巨噬細(xì)胞NF-кBp65mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，其抗炎機(jī)理可能與抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)有關(guān)。

LPS刺激可明顯增加巨噬細(xì)胞中Erk1、p38的蛋白表達(dá)，各給藥組同刺激組相比，可以降低Erk1、p38的蛋白表達(dá)。雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮的抗炎作用可能與MAPK途徑中Erk1、p38兩條傳導(dǎo)通路有關(guān)。雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮能顯著抑制巨噬細(xì)胞NF-кBp65m87LPS雪蓮總黃酮NF-кB

P38

ERK1

iNOSmRNANO抗炎作用

雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎機(jī)理示意圖巨噬細(xì)胞COX-2mRNAIL-6mRNAIL-1βmRNAPGE2IL-1βTNF-αIL-6TNF-αmRNALPS雪蓮總黃酮NF-кBP38ERK1iNOSm88通過(guò)本研究，我們認(rèn)為雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮和野生雪蓮總黃酮有著相近的抗炎效果，均能夠抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，二者沒(méi)有顯著性差異，并探討了雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎作用的相關(guān)機(jī)制。用雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮代替野生雪蓮總黃酮作為抗炎藥物完全是可行的，將會(huì)極大緩解瀕危保護(hù)植物藥材的需求緊張狀況。通過(guò)本研究，我們認(rèn)為雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮和野生雪蓮總黃酮有著89Thanks!抗炎中藥機(jī)理教材課件90抗炎免疫中藥的作用機(jī)制及相關(guān)研究楊偉鵬中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究室中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院碩士研究生中藥藥理學(xué)抗炎免疫中藥的作用機(jī)制及相關(guān)研究楊偉鵬中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院碩士研究91主要內(nèi)容炎癥簡(jiǎn)介抗炎免疫中藥的作用機(jī)制雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物總黃酮抗炎作用的機(jī)理研究主要內(nèi)容炎癥簡(jiǎn)介92炎癥炎癥概念：炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的，由多種細(xì)胞、多種因子參與的復(fù)雜防御反應(yīng)。是人類(lèi)疾病的一種最常見(jiàn)的病理過(guò)程，大多數(shù)疾病均與此有關(guān)，如感染，腫瘤，心腦血管病，老年癡呆等。它是醫(yī)學(xué)生物學(xué)中最原始、最復(fù)雜又最具挑戰(zhàn)的新課題（NewAdventuresofanOldFlame）。它是我們防治人類(lèi)重大疾病的一個(gè)最基本、最重要的共同公路。炎癥炎癥概念：93臨床表現(xiàn)：局部表現(xiàn)：紅、腫、熱、痛及功能障礙。紅、熱：血管擴(kuò)張、血流加速。腫脹：炎癥性充血、液體和細(xì)胞成分滲出。疼痛：滲出物壓迫和炎癥介質(zhì)直接作用于神經(jīng)末梢。功能障礙：在以上病變基礎(chǔ)上基于部位性質(zhì)和嚴(yán)重程度不同引起不同的功能障礙。全身反應(yīng)：發(fā)熱、外周白細(xì)胞變化等。發(fā)熱：致炎因子作用于機(jī)體，通過(guò)各種細(xì)胞因子作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，產(chǎn)熱增加，散熱減少，體溫升高。白細(xì)胞變化：中性粒細(xì)胞增加-細(xì)菌感染引起的急性炎癥早期和化膿性炎癥。淋巴細(xì)胞增加-慢性炎癥和病毒感染。嗜酸性粒細(xì)胞增加-過(guò)敏或寄生蟲(chóng)感染。白細(xì)胞減少-病毒、立克次體、傷寒等臨床表現(xiàn)：94常見(jiàn)致炎因素：物理因素（高熱低溫、紫外線、放射線等）化學(xué)因素（強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、松節(jié)油、芥子氣等）機(jī)械因素（切割、撞擊、擠壓等）生物因素（細(xì)菌、病毒、立克次體、支原體、真菌等）免疫因素（各種變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病等）炎癥基本病理變化：變質(zhì)、滲出、增生變質(zhì)--炎癥局部組織所發(fā)生的變性或壞死滲出--炎癥局部組織血管內(nèi)的液體和白細(xì)胞通過(guò)血管壁進(jìn)入間質(zhì)和漿膜腔的過(guò)程。以血管反應(yīng)為中心的滲出病變是炎癥的標(biāo)志。增生--炎癥局部的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞的增生。炎癥是損傷（變質(zhì)）、抗損傷（滲出）、修復(fù)（增生）三位一體的過(guò)程。常見(jiàn)致炎因素：95炎癥過(guò)程及參與炎癥反應(yīng)的組織成分：吞噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞）、血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞，受刺激后活化，產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì)，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。激活的巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞能殺滅病原體，清除異物，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。炎癥的防御作用及潛在危害：防御作用對(duì)機(jī)體有利，消除致病因子，液體的滲出可稀釋毒素，吞噬搬運(yùn)壞死組織以利于再生和修復(fù)，使致病因子局限在炎癥部位而不致蔓延全身。危害：嚴(yán)重過(guò)敏危及生命、喉部嚴(yán)重水腫可致窒息、腦膜炎可致顱內(nèi)壓升高壓迫中樞而至死亡，炎癥性瘢痕可致腸梗阻或關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等。炎癥過(guò)程及參與炎癥反應(yīng)的組織成分：96炎癥的分類(lèi)急性炎癥慢性炎癥起病起病急驟，持續(xù)時(shí)間短持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)特征以滲出病變?yōu)樘卣饕栽錾∽優(yōu)橹餮准?xì)胞浸潤(rùn)以中性粒細(xì)胞為主以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主程度此類(lèi)炎癥反應(yīng)劇烈，組織和器官在短期內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的損害，甚至導(dǎo)致機(jī)體死亡致炎因子毒力較弱，但持續(xù)存在并引起異常免疫反應(yīng)，全身癥狀不明顯，但常有嚴(yán)重的繼發(fā)功能障礙炎癥的分類(lèi)急性炎癥慢性炎癥起病起病急驟，持續(xù)時(shí)間短持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)97抗炎實(shí)驗(yàn)方法非特異性炎癥模型早期炎癥模型毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)法：耳腫脹、腹腔染料滲出–毛細(xì)血管擴(kuò)張及通透性亢進(jìn)急性關(guān)節(jié)腫脹實(shí)驗(yàn)：足腫脹—滲出、水腫中期炎癥模型：羧甲基纖維素囊法—血小板黏附、白細(xì)胞游走晚期炎癥模型：棉球肉芽腫法–纖維組織增生、肉芽屏障形成抗炎實(shí)驗(yàn)方法非特異性炎癥模型98特異性炎癥模型大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎：常作為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。將福氏完全佐劑（FCA）皮內(nèi)注入大鼠足跖或尾根部致炎，歷經(jīng)急性局部炎癥（第1-4天）、急性炎癥緩解（7-12天）、以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征的慢性周身炎癥（10-28天）及永久性關(guān)節(jié)畸形（第35天以后）等四個(gè)階段。本病的發(fā)生與單核細(xì)胞的異?；罨鸵种菩訲細(xì)胞功能的降低有關(guān)。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎：將II型膠原（關(guān)節(jié)軟骨的一種主要成分）加入福氏不完全佐劑（FICA）中，皮內(nèi)注入大鼠足跖或尾根部致炎。反應(yīng)與大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎相似?？乖T導(dǎo)關(guān)節(jié)炎：將抗原加入FCA中，給家兔皮內(nèi)注射致敏，2-3周后，給已致敏兔的一側(cè)關(guān)節(jié)內(nèi)注射抗原，其關(guān)節(jié)病變的病理組織學(xué)和慢性過(guò)程，與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相似。被動(dòng)轉(zhuǎn)移關(guān)節(jié)炎：用ConA活化佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的脾淋巴細(xì)胞，將其與IgG一起靜脈注射受體鼠，3天后出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，第13-15天，病變最嚴(yán)重，可見(jiàn)四肢關(guān)節(jié)廣泛性骨質(zhì)疏松、骨膜增厚等，最后引起關(guān)節(jié)畸變。一般認(rèn)為該模型較其它模型更接近人的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。特異性炎癥模型99炎性介質(zhì)的分類(lèi)雖然部分致炎因子可直接引起局部組織發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，但多數(shù)急性炎癥過(guò)程是由一系列內(nèi)源性化學(xué)因子介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，這類(lèi)化學(xué)因子稱為炎癥介質(zhì)。包含細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)和體液中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)。細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)：血管活性胺、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞產(chǎn)物、細(xì)胞因子、血小板活化因子、神經(jīng)肽、NO體液中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)：補(bǔ)體系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)。炎性介質(zhì)的分類(lèi)雖然部分致炎因子可直接引起局部組織發(fā)生急性炎癥1001，血管活性胺（組胺和5-羥色胺）組胺：存在于肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的顆粒中，也存在于血小板顆粒中?？梢鸺?xì)動(dòng)脈擴(kuò)張、細(xì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞收縮，導(dǎo)致血管通透性升高。對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞有趨化作用。5-羥色胺：由血小板釋放，與血管通透性升高有關(guān)。2，花生四烯酸代謝產(chǎn)物：（前列腺素、白三烯）1，血管活性胺（組胺和5-羥色胺）101炎癥過(guò)程中花生四烯酸的代謝膜磷脂花生四烯酸5-HPETEPGG2血小板活化因子PAFPGH2PGI2PGF2PGE2TXA2白三烯A4（LTA4）LTB4LTC4，LTD4，LTE4痛敏感血管擴(kuò)張，血小板解聚收縮支氣管致痙原血管舒張、痛敏感、致熱血小板聚集、血管收縮趨化作用血管收縮、支氣管收縮、血管通透性增加環(huán)氧酶5-脂氧酶血管舒張、通透性增加、支氣管收縮、趨化作用PGD2磷脂酶A2炎癥過(guò)程中花生四烯酸的代謝膜磷脂花生四烯酸5-HPETEPG1023，白細(xì)胞產(chǎn)物：活性氧代謝產(chǎn)物：氧化應(yīng)激：是1990年美國(guó)提出的一種病生理概念，是指機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境有害刺激的條件下，體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）所引起的細(xì)胞和組織的生理和病理反應(yīng)。ROS有超氧陰離子（O2-）、羥自由基（OH-）和過(guò)氧化氫（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO-）等等。由于它們可以直接或間接氧化或損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，可誘發(fā)基因的突變、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過(guò)氧化，被認(rèn)為是人體衰老和各種重要疾病如腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病（老年癡呆）、糖尿病等等最主要的危險(xiǎn)因子。除殺傷細(xì)菌外，還可釋放到細(xì)胞外引起多種細(xì)胞因子表達(dá)增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)1，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管通透性增加，2，滅活抗蛋白酶，導(dǎo)致蛋白酶活性增加，可破壞組織結(jié)構(gòu)成分3，損傷紅細(xì)胞和其他實(shí)質(zhì)細(xì)胞中性粒細(xì)胞溶酶體成分：中性粒細(xì)胞的死亡、吞噬泡形成過(guò)程中的外溢及出胞作用，溶酶體成分可外釋，介導(dǎo)急性炎癥。3，白細(xì)胞產(chǎn)物：1034，細(xì)胞因子：主要由激活的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。見(jiàn)后5，血小板活化因子（PAF）：激活血小板，引起血小板粘附、聚集、釋放組胺、5-HT，還能活化單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性、促進(jìn)白細(xì)胞聚焦和粘著以及趨化作用。此外還具有影響全身血流動(dòng)力學(xué)的功能。嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均能釋放PAF，PAF一方面可直接作用于靶細(xì)胞，還可刺激細(xì)胞合成其他炎癥介質(zhì)，特別是PG和白三烯的合成。6，神經(jīng)肽：例如P物質(zhì)，可直接和間接刺激肥大細(xì)胞脫顆粒，通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8以及巨噬細(xì)胞蛋白-1β，引起血管擴(kuò)張和通透性增加；血管活性腸肽（VIP）可抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和改變其顆粒內(nèi)容物，抑制前炎癥因子IL-6、IL-12、TNF-α和iNOS的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥的作用；降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）有較強(qiáng)的舒張真皮微血管作用，又能刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞活化，使其分泌趨化因子IL-8，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的粘附作用。4，細(xì)胞因子：1047，一氧化氮NO：生理狀況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞有少量NO產(chǎn)生，可松弛血管平滑肌，引起血管擴(kuò)張。炎癥和損傷，如缺血-再灌注損傷時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致NO生成減少；而單核巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等在LPS、TNF-α、IL-1、IFN作用下，產(chǎn)生大量NO。作用：一方面，NO可通過(guò)增加局部血流，促進(jìn)血漿的滲出和水腫的形成，引起細(xì)胞毒作用和組織損傷；另一方面，NO還具有抗炎作用，可減少血小板的聚集和粘附、抑制肥大細(xì)胞誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、減少急性炎癥灶內(nèi)的白細(xì)胞聚集，而阻斷NO的產(chǎn)生則可促進(jìn)白細(xì)胞的滾動(dòng)和粘著；NO有個(gè)不成對(duì)電子，可與白細(xì)胞的活性氧代謝產(chǎn)物結(jié)合，形成過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO-）和NO2等，通過(guò)破壞微生物的DNA、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)而殺滅之。7，一氧化氮NO：105體液中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)：補(bǔ)體系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)補(bǔ)體系統(tǒng)：C3和C5的激活最重要，C3a和C5a是重要的炎癥介質(zhì)，從以下三方面影響炎癥：1，C3a和C5a通過(guò)肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞增加血管通透性，引起血管擴(kuò)張；C5a還能激活花生四烯酸代謝的脂氧酶途徑，使中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎癥介質(zhì)；2，C5a是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化因子，通過(guò)激活中性粒細(xì)胞增加整合素的表達(dá)，引起中性粒細(xì)胞粘著于血管內(nèi)皮細(xì)胞；3，C3b結(jié)合于細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)具有調(diào)理素作用，可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬活性。體液中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)：補(bǔ)體系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)和纖維蛋白106激肽系統(tǒng)：血漿中的激肽原在激肽釋放酶作用下裂解生成具有活性的緩激肽，緩激肽可引起細(xì)動(dòng)脈擴(kuò)張、內(nèi)皮細(xì)胞收縮、細(xì)靜脈通透性增加，還可使血管以外的平滑肌收縮以及在炎癥局部產(chǎn)生疼痛。緩激肽作用十分短暫，很快被血漿和組織中的激肽酶滅活，其作用主要局限在血管通透性增加的早期。激肽釋放酶本身也具有趨化性，能直接使C5轉(zhuǎn)化為C5a。凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)：凝血酶在使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的過(guò)程中釋放纖維蛋白多肽，凝血酶可促使白細(xì)胞粘著和成纖維細(xì)胞增生，纖維蛋白多肽可使血管通透性增高，同時(shí)具有白細(xì)胞趨化作用。纖維蛋白溶解系統(tǒng)可通過(guò)激肽系統(tǒng)引起炎癥的血管變化。由內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和其他組織產(chǎn)生的纖維蛋白溶解原激活因子，能使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白溶酶，表現(xiàn)出炎癥活性：?jiǎn)?dòng)緩激肽的生成過(guò)程、裂解C3生成C3a、降解纖維蛋白產(chǎn)生裂解產(chǎn)物，使血管通透性增加。激肽系統(tǒng)：107炎癥介質(zhì)的特點(diǎn)特點(diǎn)：炎性介質(zhì)來(lái)自白細(xì)胞和血漿，前者以顆粒形式儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)，需要時(shí)或在致炎因子作用下合成并釋放；后者以前體形式存在于血漿中，經(jīng)蛋白水解酶裂解才能被激活。多數(shù)炎性介質(zhì)通過(guò)與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮生物活性，少數(shù)本身具有酶活性。炎性介質(zhì)可使靶細(xì)胞產(chǎn)生第二級(jí)炎性介質(zhì)，后者的作用可以與原介質(zhì)相同或相似，也可以截然相反。一種炎性介質(zhì)可作用于一種或多種靶細(xì)胞，其產(chǎn)生的效果取決于細(xì)胞和組織的類(lèi)型。炎性介質(zhì)一旦被激活或由細(xì)胞釋放，存在的時(shí)間很短。大多數(shù)炎性介質(zhì)具有潛在的致?lián)p傷能力。炎癥介質(zhì)的特點(diǎn)特點(diǎn)：108主要炎癥介質(zhì)的作用功能主要炎癥介質(zhì)種類(lèi)血管擴(kuò)張組胺、緩激肽、前列腺素、NO血管通透性增高組胺、緩激肽、C3a、C5a、LTC4、LTD4、LTE4、PAF、活性氧代謝產(chǎn)物、P物質(zhì)趨化作用LTB4、C5a、細(xì)菌產(chǎn)物、中性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、IL-8、TNF發(fā)熱IL-1、IL-6、TNF、PG疼痛PGE2、緩激肽組織損傷氧代謝產(chǎn)物、溶酶體酶、NO主要炎癥介質(zhì)的作用功能主要炎癥介質(zhì)種類(lèi)血管擴(kuò)張組胺、緩激肽、109抗炎免疫中藥的作用機(jī)制

興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的釋放作用于細(xì)胞因子調(diào)節(jié)一氧化氮水平調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激/抗氧化平衡調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)基因轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的調(diào)控作用抗炎免疫中藥的作用機(jī)制興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進(jìn)腎上腺皮1101，興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的釋