炎癥狀態(tài)對CYP2B6活性和表達的影響及機制研究,人體生理學(xué)論文

炎癥狀態(tài)對CYP2B6活性和表達的影響及機制研究,人體生理學(xué)論文肝臟細胞色素P450〔cytochromeP450，CYP450〕氧化酶又稱混合功能氧化酶和單加氧酶，廣泛存在于動物、植物、微生物的各種組織中，是負責(zé)大多數(shù)臨床藥物、環(huán)境致癌物、外源毒物及內(nèi)源活性物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的主要酶系統(tǒng)，具有重要的藥理、生理及病理學(xué)意義。CYP450是一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的基因超家族，由不同的基因家族和亞家族組成，華而不實與藥物代謝關(guān)系最為密切的主要有CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1及CYP3A4等。本文綜述了炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)對CYP2B6活性改變及其作用機制的研究進展。1、CYP2B6的功能特性CYP2B6是人類CYP2B亞家族的重要成員，廣泛分布于人體肝臟、腎臟、肺、小腸、子宮內(nèi)膜、支氣管肺泡巨噬細胞等處，介入多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的合成和代謝。CYP2B6蛋白質(zhì)由491個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為58268。很長一段時期內(nèi)，人們低估了CYP2B6在藥物代謝中的重要作用。近年來，隨著它的一系列特異性和靈敏度都很高的抗體被制備出來，以及大量底物的發(fā)現(xiàn)，人們逐步認識到它在CYP家族中扮演著特別重要的角色。諸多學(xué)者開場關(guān)注CYP2B6并進行了很多相關(guān)研究。CYP2B6介導(dǎo)了大約8%臨床藥物的代謝，華而不實包括如抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺、他莫昔芬，抗HIV感染的非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑依法韋侖，抗抑郁藥安非他酮、丙咪嗪，常用麻醉藥氯胺酮、異丙酚等，常用的濫用藥物如尼古丁和4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮也是CYP2B6的底物。除此之外，CYP2B6還介入了很多毒物〔如農(nóng)藥〕的代謝，是重要的外源性毒物代謝酶之一。因而，穩(wěn)定的CYP2B6活性是保障藥物治療安全有效的重要前提。CYP2B6是一個受遺傳、環(huán)境、種族和病理狀況等影響較大的P450酶，其在基因及蛋白水平表示出上顯示出較大的個體差異，導(dǎo)致其對很多臨床藥物的代謝發(fā)生較大改變，甚至出現(xiàn)一系列毒副作用。不同的病理狀況能夠影響CYP2B6的活性和蛋白表示出，華而不實感染和炎癥對CYP2B6的影響得到了較為深切進入的研究。2、炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)與相關(guān)性疾病炎癥是人類疾病中最常見的病理狀態(tài)。越來越多的研究表示清楚，炎癥并不是一種單一的病理狀態(tài)，多種疾病的發(fā)生和發(fā)展都伴有機體的炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)。例如感染、腫瘤、本身免疫缺陷、2型糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化以及組織損傷等很多刺激都能誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致體內(nèi)炎性細胞因子的升高。Liu等報道，超過50%的胃癌患者體內(nèi)炎性細胞因子IL-1表示出增加，Zhao等研究表示清楚，皮膚癌小鼠模型中角質(zhì)化細胞內(nèi)IL-1表示出加強。臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示艾滋病患者伴有體內(nèi)IL-1、IL-2、IL-6等細胞因子的顯著升高。Leinonen等證明，2型糖尿病患者的CRP、IL-6等炎性因子水平較正常對照組明顯升高，后證實2型糖尿病的發(fā)生伴隨著體內(nèi)多種炎性因子的過量表示出。除此之外，文獻報道急性冠狀動脈綜合征〔ACS〕患者血中炎性因子的增高與血管內(nèi)皮脫落構(gòu)成循環(huán)內(nèi)皮細胞高度相關(guān)。關(guān)于動脈粥樣硬化〔AS〕的發(fā)病機制曾有脂質(zhì)浸潤學(xué)講、血小板聚集和血栓構(gòu)成學(xué)講等，但當前也以為，AS從發(fā)生、發(fā)展到轉(zhuǎn)歸的全經(jīng)過就是一個慢性炎癥經(jīng)過，諸多炎癥細胞和炎性介質(zhì)介入華而不實。3、炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)對CYP2B6活性和表示出的影響炎癥是機體最常見的一種病理狀態(tài)。因而科研工作者們相繼從轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平開展了大量炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)對CYP450的調(diào)節(jié)研究。20世紀80年代以來，美國Emory大學(xué)EdwardT.Morgan教授和他的科研團隊致力于研究感染和炎癥反響對CYP450的影響。其研究結(jié)果顯示，感染和炎癥條件下，人、大鼠和小鼠肝臟、腎臟和腦組織的細胞色素P450酶表示出和活性改變顯著。例如給小鼠腹腔注射脂多糖〔LPS〕，LPS能夠通過細胞的外表受體激活巨噬細胞，分泌大量促炎性細胞因子，繼而對多種CYP450亞型呈現(xiàn)抑制作用。給大鼠分別腹腔注射IL-6和TNF后，CYP2C11、CYP2E1和CYP3A2的mRNA表示出均下降。分別以人原代肝細胞和大鼠原代肝細胞等為實驗對象，用促炎性細胞因子IL-1和IL-6、TNF和細胞進行共孵育，發(fā)現(xiàn)1A2、2A5、2B1、2B6、2B9、2B10、2C11、2C29、2E1、3A2、3A4、3A11和4A10等CYP的蛋白表示出量或活性都顯著降低，華而不實尤以對CYP2B6的影響非常顯著，提示炎癥能使經(jīng)CYP2B6途徑藥物如環(huán)磷酰胺、依法韋侖和安非他酮等的體內(nèi)代謝率顯著下降，消除半衰期延長，導(dǎo)致體內(nèi)藥物蓄積而發(fā)生嚴重不良反響。4、炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)對CYP2B6活性影響的機制研究研究者對炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)下CYP450活性改變的機制也進行了一系列研究，以往的研究更多地關(guān)注炎性細胞因子對CYP450的mRNA表示出等轉(zhuǎn)錄水平的影響，后來大量實驗結(jié)果證實，炎性細胞因子在對CYP450mRNA表示出無影響的情況下，仍然能夠降低肝藥酶活性，提示轉(zhuǎn)錄后修飾在這里經(jīng)過中也扮演了重要的角色。4.1NO在炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)對CYP2B6活性改變中的作用NO是一種不穩(wěn)定的生物自由基，其生物活性最早發(fā)現(xiàn)于1980年，美國科學(xué)家Furchgott和Zawadzki在一項研究中發(fā)現(xiàn)了一種小分子物質(zhì)，具有使血管平滑肌松弛的作用，被命名為血管內(nèi)皮細胞舒張因子〔EDRF〕，后被確以為是NO。NO由體內(nèi)一氧化氮合酶〔NOS〕催化，以L-精氨酸和分子氧為底物合成。NOS包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶〔nNOS〕、內(nèi)皮型一氧化氮合酶〔eNOS〕以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶〔iNOS〕三種亞型，感染和炎癥主要增加iNOS的表示出。CYP2B6在大鼠肝細胞主要以CYP2B1形式存在，與人肝細胞CYP2B6的基因有76%的類似。筆者近年來系統(tǒng)研究了炎性細胞因子IL-1對大鼠CYP2B1的下調(diào)作用及其機制。實驗結(jié)果證實，IL-1與大鼠原代肝細胞共孵育，可顯著誘導(dǎo)iNOS的蛋白表示出，增加NO的生成，并進而使CYP2B1蛋白質(zhì)半胱氨酸的巰基亞硝基化，易于被泛素-蛋白酶體辨別而快速降解，提示NO和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在炎癥對CYP2B6的影響中起到了至關(guān)重要的作用，從轉(zhuǎn)錄后蛋白降解的水平闡述了IL-1抑制CYP2B1的機制。4.2蛋白質(zhì)修飾在炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)對CYP2B6活性改變中的作用1992年，Stamler等發(fā)現(xiàn)NO和活性氮〔RNS〕能夠作用于蛋白質(zhì)半胱氨酸的巰基〔Cys-SH〕，生成S-亞硝基化基團〔Cys-SNO〕，引起蛋白質(zhì)的活性與功能的改變，并初次提出了蛋白質(zhì)巰基的S-亞硝基化修飾概念。Minamiyama等研究發(fā)現(xiàn)，使用NO供體NOC7或過氧化亞硝酸鹽〔ONOO-〕和肝微粒體共孵育，能夠引起CYP450活性降低及游離巰基的減少。Roberts等也發(fā)現(xiàn)IL-1能夠使腎小球膜細胞中產(chǎn)生ONOO-，繼而使CYP8A1和CYP2B1的活性下降，研究者猜想是由于ONOO-使CYP8A1和CYP2B1酪氨酸殘基硝基化，降低了酶的催化活性。要深切進入說明NO對蛋白質(zhì)的亞硝基化修飾作用，需要有高靈敏度和特異性的檢測方式方法。2001年，美國藥理學(xué)家Jaffrey和Snyder等建立了一種生物素轉(zhuǎn)化的方式方法〔Biotinswitch〕來進行S-亞硝基化蛋白的檢測。該方式方法經(jīng)過不斷的改良和完善，當前已得到國際公認。Benhar等成功利用該方式方法測定了人淋巴細胞中半胱天冬酶-3蛋白的亞硝基化修飾，并發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)和線粒體中的硫氧還蛋白〔thioredoxins，Trx〕能夠降低去亞硝基化的經(jīng)過。除了亞硝基化外，NO和RNS還能夠?qū)Π腚装彼岬膸€基進行次磺酸化〔Cys-SOH〕等氧化修飾。研究顯示，RNS能夠使酪氨酸羥化酶的半胱氨酸次磺酸化，導(dǎo)致酶的活性下降。GSNO能夠?qū)M織蛋白酶K的半胱氨酸進行次磺酸化修飾而改變酶的活性。2008年，美國密歇根大學(xué)Reddie教授等利用新合成的特異性探針化合物DAz-1，建立了一種新的次磺酸化蛋白檢測方式方法，為研究蛋白質(zhì)的氧化修飾機制開拓了廣闊的前景。2008年，Lee等用NO供體GNSO與大鼠肝微粒體體外共孵育，采用Biotinswitch法檢測到經(jīng)S-亞硝基化修飾的CYP2B1，并發(fā)現(xiàn)泛素化CYP2B1蛋白明顯增加，表示清楚NO能夠?qū)YP2B1蛋白進行亞硝基化修飾，并促進其和泛素連接；實驗還發(fā)現(xiàn)另一NO供體NOC18和HeLa細胞共孵育，能夠引起CYP2B1蛋白量下降，蛋白酶體〔proteasome〕抑制劑MG132能夠明顯抑制這一經(jīng)過，但溶酶體酶抑制劑和Ca2+依靠性蛋白酶抑制劑對CYP2B1蛋白的降解無影響，講明NO作用下CYP2B1的降解通過泛素-蛋白酶體途徑進行。4.3泛素-蛋白酶體通路在炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)對CYP2B6活性改變中的作用泛素-蛋白酶體通路〔Ub-proteasomesystem，UPS〕是除溶酶體途徑、Ca2+依靠性蛋白酶途徑之外的另一種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑，這一發(fā)現(xiàn)獲得了2004年諾貝爾化學(xué)獎。該通路由泛素、蛋白酶體以及一系列相關(guān)的泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3組成。泛素是一種小分子球蛋白，能作為標簽結(jié)合到其他蛋白質(zhì)上，蛋白質(zhì)被亞硝基化或者次磺酸化修飾后易被泛素連接酶E3辨別，使之成為蛋白酶體水解的底物。蛋白酶體是具有多亞基和多相催化活性的蛋白酶復(fù)合體，是催化泛素與底物蛋白偶聯(lián)體降解的關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)著細胞內(nèi)蛋白的水平和功能。筆者近年研究發(fā)現(xiàn)，單純使用外源性NO供體藥物NOC18同樣能夠使大鼠原代肝細胞CYP2B1蛋白表示出量下降，但降解經(jīng)過比IL-1所致的CYP2B1蛋白量下降緩慢。有文獻報道IL-1能夠誘導(dǎo)燒傷大鼠趾長伸肌中免疫蛋白酶體的蛋白水解活性和表示出。由此我們揣測，IL-1可能通過直接加強大鼠原代肝細胞蛋白酶體的活性或表示出，加速了CYP2B1的蛋白降解。近期，我們利用特異性熒光多肽底物初步測定了IL-1對大鼠原代肝細胞蛋白酶體活性的影響，實驗結(jié)果顯示，IL-1能提高蛋白酶體的糜蛋白樣〔chymotrypsin-like，CT-L〕活性。另外，IL-1能夠誘導(dǎo)蛋白酶體重要的蛋白水解亞單位LMP2的表示出，進而從蛋白酶體途徑揭示了炎性細胞因子降低CYP2B1活性的機制。5、瞻望CYP2B6是人類CYP2B亞家族的重要成員，近年來發(fā)現(xiàn)，盡管CYP2B6只占CYP450的3%~5%，但它卻介導(dǎo)了很多臨床藥物的代謝。和其他CYP450一樣，CYP2B6的活性和表示出，除了受基因多態(tài)性控制外，特殊的病理狀態(tài)，如感染和炎癥也會對其產(chǎn)生顯著的影響，導(dǎo)致其對很多臨床藥物如抗腫瘤藥、抗HIV感染的非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和抗抑郁藥等的代謝發(fā)生重大改變。因而，研究炎癥對CYP2B6活性的影響，對臨床合理、安全使用CYP2B6底物藥物具有非常重要的意義。當前很多研究證實，炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)能夠從轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)水平顯著降低CYP2B6的活性，這一改變機制牽涉NO生成、蛋白質(zhì)修飾等多種因素。進一步高度關(guān)注和持續(xù)研究炎異常感覺和狀態(tài)態(tài)對CYP2B6活性的作用及機制，將為臨床病理狀態(tài)下CYP2B6底物藥物的正確使用提供有價值的理論和實驗根據(jù)。以下為參考文獻：[1]MiksysS,LermanC,ShieldsPG,etal.Smoking,alcoholismandgeneticpolymorphismsalterCYP2B6levelsinhumanbrain.Neuropharmacology,2003,45(1):122-132.[2]WangJC,ZhouHH.ThedevelopmentofCYP2B6--animportantmemberinCYPsuperfamily.MedRecapitulate,2008,14(4):483-486.(inChinese)王晉朝,周宏灝.細胞色素P450重要成員CYP2B6研究進展.醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(4):483-486.[3]XuC,XuSY,HuHH,etal.EstablishmentofinvitroevaluationmodelforCYP2B6inductionanditsapplicationtoscreeninducersamongTCMs.ActaPharmSinica,2020,48(1):119-124.(inChinese)徐聰,徐思云,胡海紅,等.CYP2B6體外誘導(dǎo)活性評價模型的建立及其在中藥活性成分挑選的應(yīng)用.藥學(xué)學(xué)報,2020,48(1):119-124.[4]AitkenAE,RichardsonTA,MorganET.Regulationofdrug-metabolizingenzymesandtransportersininflammation.AnnuRevPharmacolToxicol,2006,46:123-149.[5]HodgsonE,RoseRL.TheimportanceofcytochromeP4502B6inthehumanmetabolismofenvironmentalchemicals.PharmacolTher,2007,113(2):420-428.[6]MorganET.Regulationofcytochromep450byinflammatorymediators:whyandhow?DrugMetabDispos,2001,29(3):207-212.[7]WangH,TompkinsLM.CYP2B6:newinsightsintoahistoricallyoverlookedcytochromeP450isozyme.CurrDrugMetab,2008,9(7):598-610.[8]LiuSF,HaddadEB,AdcockI,etal.InduciblenitricoxidesynthaseaftersensitizationandallergenchallengeofBrownNorwayratlung.BrJPharmacol,1997,121(7):1241-1246.[9]ZhaoQ,SimpsonLG,DriscollKE,etal.Chemokineregulationofozone-inducedneutrophilandmonocyteinflammation.AmJPhysiol,1998,274(1Pt1):L39-L46.[10]LeinonenE,Hurt-CamejoE,WiklundO,etal.Insulinresistanceandadipositycorrelatewithacute-phasereactionandsolublecelladhesionmoleculesintype2diabetes.Atherosclerosis,2003,166(2):3872-3941.[11]HuFB,MeigsJB,LiTY,etal.Inflammatorymarkersandriskofdevelopingtype2diabetesinwomen.Diabetes,2004,53(3):6932-7001.[12]SprangerJ,KrokeA,M?hligM,etal.Inflammatorycytokinesandtherisktodeveloptype2diabetes:resultsoftheprospectivepopulation-basedEuropeanProspectiveInvestigationintoCancerandNutrition(EPIC)-PotsdamStudy.Diabetes,2003,52(3):8122-8171.[13]Engstr?mG,LindP,HedbladB,etal.Effectsofcholesterolandinflammation-sensitiveplasmaproteinsonincidenceofmyocardialinfarctionandstrokeinmen.Circulation,2002,105(22):2632-2637.[14]HanssonGK.Inflammation,atheroclerosis,andcoronaryarterydisease.NEnglJMed,2005,352(16):1685-1695.[15]AitkenAE,MorganET.Gene-specificeffectsofinflammatorycytokinesoncytochromeP4502C,2B6and3A4mRNAlevelsinhumanhepatocytes.DrugMetabDispos,2007,35(9):1687-1693.[16]MorganET,GoralskiKB,Piquette-MillerM,etal.Regulationofdrug-metabolizingenzymesandtransportersininfection,inflammationandcancer.DrugMetabDispos,2008,36(2):205-216.[17]LeeCM,PohlJ,MorganET.DualmechanismsofCYP3Aproteinregulationbyproinflammatorycytokinestimulationinprimaryhepatocytecultures.DrugMetabDispos,2018,37(4):865-872.[18]NyagodeBA,LeeCM,MorganET.ModulationofhepaticcytochromeP450sbyCitrobacterrodentiuminfectionininterleukin-6-andinterferon-{gamma}-nullmice.JPharmacolExpTher,2018,335(2):480-488.[19]KinlochRD,LeeCM,vanRooijenN,etal.Selectiverolefortumornecrosisfactor-,butnotinterleukin-1orKupffercells,indown-regulationofCYP3A11andCYP3A25inliversofmiceinfectedwithanoninvasiveintestinalpathogen.BiochemPharmacol,2018,82(3):312-321.[20]FurchgottRF,ZawadzkiJV.Theobligatoryroleofendothelialcellsintherelaxationofarterialsmoothmusclebyacetylcholine.Nature,1980,288(5789):373-376.[21]MorganET,SunHY,KimKB,etal.Reactivenitrogenspecies(RNS)intheregulationofcytochromeP450proteolysis:NOhidingplaceforRNS-modifiedP450s//InternationalSocietyfortheStudyofXenobiotics,Atlanta,USA,2018.[22]SunHY,LeeCM,TripathiS,etal.Nitricoxide-dependentCYP2B1degradationispotentiatedbyacytokine-regulatedpathwayandutilizestheimmunoproteasomesubunitLMP2.BiochemJ,2020,445(3):377-382.[23]StamlerJS,SimonDI,OsborneJA,etal.S-nitrosytationofproteinswithnitrieoxide:synthesisandcharacterizationofbiologicallyactivecompounds.ProcNatlAcadSciUSA,1992,89(1):444-448.[24]StamlerJS.Redoxsignaling:nitrosylationandrelatedtargetinteraetionsofnitricoxide.Cell,1994,78(6):931-936.[25]MinamiyamaY,TakemuraS,ImaokaS,etal.IrreversibleinhibitionofcytochromeP450bynitricoxide.JPharmacolExpTher,1997,283(3):1479-1485.[26]RobertsES,LinHI,CrowleyJR,etal.Peroxynitrite-mediatednitrationoftyrosineandinactivationofthecatalyticactivityofcytochromeP4502B1.ChemResToxicol,1998,11(9):1067-1074.[27]JaffreySR,SnyderSH.ThebiotinswitchmethodforthedetectionofS-nitrosylatedproteins.SciSTKE,2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