抗生素類藥物的分析

關于抗生素類藥物的分析第一頁，共七十三頁，2022年，8月28日第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素代表藥物

Aminoglycosids第二頁，共七十三頁，2022年，8月28日一、化學結構與性質鏈霉胍+鏈霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺1.鏈霉素

第三頁，共七十三頁，2022年，8月28日2.巴龍霉素

巴龍胺+巴龍二糖胺巴龍胺(苷元)巴龍二糖胺(糖)第四頁，共七十三頁，2022年，8月28日3.慶大霉素

絳紅糖胺+2-脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3

慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

慶大霉素C1aR、R1、R2=H

慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H主要成分第五頁，共七十三頁，2022年，8月28日奈替米星（netilmicin）脫氧鏈霉胺（氨基糖）絳紅糖胺（氨基糖）加洛糖胺第六頁，共七十三頁，2022年，8月28日★理化性質結構相似理化性質相似1.溶解度與堿性堿性:堿性中心鏈霉素3個慶大霉素5個多與硫酸成鹽溶解性:水溶性多羥基化合物易溶于水，不溶于乙醇、氯仿。2個強堿性胍基（PKa=11.5）1個甲胺基（PKa=7.7）第七頁，共七十三頁，2022年，8月28日2.旋光性結構中氨基糖的手性碳原子.慶大霉素、巴龍霉素等均有旋光性。硫酸慶大霉素硫酸巴龍霉素硫酸卡那霉素50mg/ml水溶液第八頁，共七十三頁，2022年，8月28日結合較弱結合較強3.苷的水解與穩(wěn)定性第九頁，共七十三頁，2022年，8月28日鏈霉素——pH5～7.5時穩(wěn)定過酸過堿則水解。慶大霉素、奈替米星——對光、熱空氣均穩(wěn)定。水溶液pH2～12時穩(wěn)定。4.紫外吸收慶大霉素、奈替米星等無UV吸收第十頁，共七十三頁，2022年，8月28日★★(二)鑒別試驗1.茚三酮反應ChP：硫酸慶大霉素、硫酸核糖霉素氨基糖苷結構具有羥基胺類和α—氨基酸的性質△+第十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日2.Molisch試驗

五碳糖和六碳糖的特征反應五碳糖氨基糖苷化合物六碳糖氨基糖苷化合物H+濃H2SO4/HClα-萘酚/蒽酮紅紫色或藍紫色硫酸核糖霉素

0.1%蒽酮/濃H2SO4藍色→藍綠色第十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日紅紫色羥甲基糠醛(含六碳糖結構氨基糖苷類酸性水解產(chǎn)物)藍紫色第十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日坂口反應麥芽酚反應N-甲基葡萄糖胺反應★★鏈霉素水解產(chǎn)物反應第十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日N—甲基葡萄糖胺反應(Elson—Morgan反應)乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+櫻桃紅色

第十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日(縮合)第十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日紅色對二甲氨基苯甲醛H+第十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日例硫酸新霉素Ch.P（2010）

【鑒別】（1）取本品約10mg，加水1ml溶解后，加鹽酸溶液（9→100）2ml，在水浴中加熱10分鐘，加8%氫氧化鈉溶液2ml與2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加熱5分鐘，冷卻后，加對二甲氨基苯甲醛試液1ml，即顯櫻桃紅色。第十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日麥芽酚反應——鏈霉糖特有反應分子重排六元環(huán)脫N—甲基葡萄糖胺脫鏈霉胍H+硫酸鐵銨H+

Fe3+分子重排麥芽酚第十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十頁，共七十三頁，2022年，8月28日坂口反應（Sakaguchi反應）鏈霉胍特有反應（或α-萘酚）加入尿素使顏色穩(wěn)定可比色測定硫酸鏈霉素0.5mg，加水4ml溶解后，加氫氧化鈉試液2.5ml與0.1％的8—羥基喹林的乙醇溶液1ml，放冷至約15℃，加次溴酸鈉試液3滴，即顯橙紅色。第二十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日坂口反應+OH-第二十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日硫酸鹽反應H+TLC法——硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素鑒別[色譜條件特點]：吸附劑:硅膠展開劑：氯仿—甲醇—濃氨水顯色劑：茚三酮或碘蒸氣第二十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日HPLC法鑒別BP硫酸慶大霉素據(jù)色譜圖中慶大霉素C1、C2

、C1a、C2a的保留時間鑒別。光譜法鑒別1.IR——ChP鑒別妥布霉素

USP鑒別硫酸慶大霉素。2.UV——BP硫酸慶大霉素飽和結構240—330nm無吸收第二十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日例【鑒別】HPLC法Ch.P（2010）

硫酸依替米星硫酸卡那霉素硫酸小諾霉素硫酸奈替米星硫酸阿米卡星硫酸慶大霉素硫酸西索米星硫酸巴龍霉素妥布霉素第二十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日三、特殊雜質檢查及組分分析（一）鏈霉素雜質鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）活性低來源：反應中間體殘留TLC（對照品法）BP（2000）甘露糖鏈霉素D-甘露糖對照品D-甘露糖水解TLC展開、顯色，比較(﹤3.0%)方法：HPLC法(ChP2010)第二十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日(二)、硫酸奈替米星中的有關物質檢查特殊雜質：西梭米星來源：合成原料殘留方法：TLC對照品法與高低濃度對照法同時控制雜質限量★(三)、慶大霉素C組分的測定C組分比例不一致發(fā)酵菌種不同工藝差別第二十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日對微生物的活性無明顯差異不同的C組分毒副作用和耐藥性不同ChPJPBPUSP規(guī)定控制各組分的相對百分含量方法：柱前衍生化—離子對HPLC法慶大霉素無UV吸收Gentamycin-NH2+

OPA+HSCH2COOHλmax=330nm第二十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物λmax=330nm第二十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日HPLC條件色譜柱：ODS流動相：水—冰醋酸—甲醇(25:5:70)配制的0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液檢測波長:330nm計算:峰面積歸一化法規(guī)定

C120~40%C1a10~30%C2a+C2b+

C240~60%第三十頁，共七十三頁，2022年，8月28日慶大霉素C組分的測定實驗條件的討論1、OPA的作用是什么？2、冰醋酸的作用是什么？3、庚烷磺酸鈉的作用是什么？第三十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日（四）硫酸鹽測定剩余滴定法空白滴定第三十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日四、含量測定1.免疫分析法2.微生物檢定法（各國藥典普遍采用）利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用量反應平行線原理的設計，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。第三十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日3.HPLC法優(yōu)點:高靈敏度、專屬性廣泛應用于抗生素穩(wěn)定性研究及體內分析氨基糖苷類一般無吸收柱前(后)衍生化【含量測定】

Ch.P規(guī)定方法

微生物檢定法

鹽酸大觀霉素，硫酸新霉素，硫酸鏈霉素，硫酸核糖霉素，硫酸奈替米星，硫酸阿米卡星，硫酸慶大霉素，硫酸西索米星，硫酸巴龍霉素，硫酸小諾霉素

HPLC法

硫酸依替米星，硫酸卡那霉素第三十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日生物樣品中氨基糖苷類分析的原則1、OPA、FMOC-Cl、FDNB柱前衍生化反應重要意義：2、樣品預處理：（1）離子對試劑（2）固相萃取柱3、柱前衍生化反應是否完全需要考查第三十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日第四節(jié)四環(huán)素類抗生素結構上具有氫化駢四苯環(huán)，統(tǒng)稱為四環(huán)素族抗生素一、基本結構與化學性質化學結構:四駢苯或萘駢萘的衍生物。取代基不同而構成不同的四環(huán)素.name

R R’R’’

R’’’四環(huán)素 TC

H OH CH3H金霉素 CTC Cl OHCH3H土霉素 OTC

H OH CH3OH脫氧土霉素 DOTCH H CH3OH第三十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日

多西環(huán)素（DOTC）

（doxycycline）（脫氧土霉素）（強力霉素）第三十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日A環(huán)B環(huán)C環(huán)D環(huán)二甲氨基—N(CH3)2酚羥基酰胺基—CONH2酮基與烯醇基共軛雙鍵系統(tǒng)酮基與烯醇基共軛雙鍵系統(tǒng)第三十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日★結構特點與分析方法之間的關系1.共軛雙鍵，剛性結構：具有紫外吸收，可產(chǎn)生熒光，可進行鑒別和含量測定。

2．具有酚羥基、烯醇基：可發(fā)生三氯化鐵反應、可與金屬離子絡合，用于鑒別。

3.具有手性碳原子：具旋光性，用于鑒別。

第三十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日理化性質1.酸堿性與溶解度兩性:酚羥基、烯醇羥基弱酸性二甲胺基弱堿性1.與酸、堿均能成鹽2.強酸或強堿中溶解度↑3.游離組分在水中溶解度很小溶解度:第四十頁，共七十三頁，2022年，8月28日2、含結晶水四環(huán)素：6個結晶水占19.6%土霉素：2個結晶水占7.5%加熱時可失去結晶水,當含水量低于19.6%的四環(huán)素和低于7.5%的土霉素,置于空氣中要吸收水分第四十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日2.旋光性——用于鑒別、定量分析ChP—鹽酸土霉素：-188°～-200°

鹽酸四環(huán)素：-240°～-258°3.UV吸收和熒光共軛雙鍵系統(tǒng)：具有紫外吸收，可產(chǎn)生熒光降解產(chǎn)物的熒光可供鑒別用。土霉素綠色熒光；金霉素藍色熒光；四環(huán)素黃色熒光H+OH-第四十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日4.與金屬離子形成配位化合物酚羥基、烯醇基的性質。Ca2+Mg2+Fe3+Al3+等pH3~7.5強烈熒光第四十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日5.不穩(wěn)定性:水溶液對酸、堿、氧化劑均不穩(wěn)定。1）差向異構化淡黃→黑藍色熒光土霉素、多西環(huán)素不易差向異構化第四十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日A環(huán)上手性C4構型的改變差向四環(huán)素第四十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日（土霉素、多西環(huán)素不易差向異構化）第四十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日多西環(huán)素不發(fā)生（C環(huán)無羥基）第四十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日（2）堿性下降解（熒光）多西環(huán)素不發(fā)生第四十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日～～TCETCATCEATC＜＜差向脫水差向脫水第四十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日★二、鑒別試驗1.濃H2SO4反應2.FeCl3反應酚-OH反應氧化、脫水第五十頁，共七十三頁，2022年，8月28日3.TLC法正相分配薄層色譜——對照品法載體：硅藻土（中性）+EDTA展開劑：乙酸乙酯-氯仿-丙酮(2:2:1)+EDTA顯色：UV：365nm熒光ChP，BP方法克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象4.HPLC法ChP，USP方法保留時間鑒別（pH7）鹽酸土霉素，鹽酸金霉素，鹽酸多西環(huán)素，鹽酸美他環(huán)素第五十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日5.熒光反應：四環(huán)素類在紫外燈下產(chǎn)生熒光，其降解產(chǎn)物也具有熒光，可供鑒別。UV綠色熒光H+UV第五十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日6.UV法溶劑:1mol/L鹽酸-甲醇（1→100）濃度:0.01mg/ml第五十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日三、特殊雜質檢查1.有關物質4-差向四環(huán)素（ETC）<4.0%脫水四環(huán)素（ATC）<0.5%差向脫水四環(huán)素（EATC）<0.5%鹽酸金霉素（CTC）<1.0%引起失效，中毒！降解產(chǎn)物及異構雜質,。可引起惡心、嘔吐、糖尿、蛋白尿及酸中毒，稱為Fanconi癥侯群第五十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日HPLC法（ChP版）加校正因子的自身高低濃度對照法定量以吸收系數(shù)比作為校正因子2.雜質吸收度ETC、ATC等雜質為深色物質含量越高，A雜質越大ChP/BP規(guī)定雜質吸收度限量第五十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日雜質吸收度第五十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日四、含量測定JP比色法ChP、USP——HPLC法（外標法）鹽酸四環(huán)素的含量測定色譜柱：ODS（pH適應值范圍>8）流動相：pH8.3的堿性溶液系統(tǒng)適用性試驗

4-差向脫水四環(huán)素四環(huán)素第五十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日中國藥典規(guī)定用HPLC法測定的四環(huán)素類藥物鹽酸四環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸多西環(huán)素鹽酸美他環(huán)素第五十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日五、高分子雜質的檢查（了解）內源性：藥物自身聚合物來源于生產(chǎn)過程、貯存過程、使用不當外源性：蛋白、多肽、多糖及其與藥物的結合物來源于發(fā)酵過程高分子雜質凝膠色譜法：葡聚糖凝膠SephadexG-10雜質控制方法控制重點!第五十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日1.基本結構青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核參于反應側鏈參于反應頭孢菌素族與母核有關的N型聚合反應側鏈參與反應的L型聚合反應第六十頁，共七十三頁，2022年，8月28日2.特點（1）發(fā)酵中產(chǎn)生的任何蛋白及蛋白碎片均可帶入產(chǎn)品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以結合不同數(shù)目的藥物分子，形成青霉素噻唑多肽類雜質。（2）有不同聚合度和不同機理聚合反應形成的聚合物，聚合物發(fā)生不同程度的降解作用。（3）以異構體存在樣品，同聚和異聚反應可同時發(fā)生。（4）高分子雜質的種類、數(shù)量與生產(chǎn)工藝密切相關（溶媒結晶、噴霧干燥）第六十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日第六十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日1、下列哪個藥物會發(fā)生羥肟酸鐵反應

A.青霉素

B.慶大霉素

C.紅霉素

D.鏈霉素

E.維生素C第六十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日2、中國藥典測定頭孢菌素類藥物的含量時，最多采用的方法是

A.微生物法

B.碘量法

C.汞量法

D.正相高效液相色譜法

E.反相高效液相色譜法第六十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日3、屬于-內酰胺類的抗生素藥物有

A.青霉素

B.紅霉素

C.頭孢菌素

D.慶大霉素

E.四環(huán)素第六十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日4、能和茚三酮發(fā)生呈色反應的物質有

A．鏈霉素

B．慶大霉素

C．土霉素

D．氨基酸

E．苯巴比妥第六十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日6、能發(fā)生重氮化-偶合反應的抗生素類藥物是

A.青霉素

B.慶大霉素

C.芐星青霉素

D.鹽酸四環(huán)素

E.普魯卡因青霉素第六十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日7、四環(huán)素在酸性條件下的降解產(chǎn)物是

A.差向四環(huán)素

B.脫水四環(huán)素

C.異四環(huán)素

D.去甲四環(huán)素

E.去甲氧四環(huán)素第六十八頁，共七