微量凱氏定氮法的催化劑課件

6.蛋白質(zhì)及氨基酸的測(cè)定6.1概述6.2凱氏定氮法6.3氨基酸氮的測(cè)定6.蛋白質(zhì)及氨基酸的測(cè)定6.1概述6.1概述（1）食品中的蛋白質(zhì)含量及測(cè)定意義（2）蛋白質(zhì)系數(shù)（3）蛋白質(zhì)測(cè)定方法6.1概述食品中的蛋白質(zhì)含量牛肉豬肉兔肉雞肉

209.52120大豆米面粉菠菜蘋(píng)果

408.5102.4

0.4食品中的蛋白質(zhì)含量牛肉豬肉兔肉

測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開(kāi)發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過(guò)程控制均具有極重要的意義。

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N,在某些蛋白質(zhì)中還含有

微量的s、P、Cu、Fe、I等元素，但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。蛋白質(zhì)的測(cè)定意義蛋白質(zhì)的測(cè)定意義

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。

不同種類(lèi)食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。（2）蛋白質(zhì)系數(shù)

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種(3)蛋白質(zhì)含量測(cè)定最常用的方法

凱氏定氮法是通過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)用凱氏定氮法通過(guò)測(cè)總氮量來(lái)確定蛋白質(zhì)含量，包含了核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白質(zhì)含氮化合物，所以這樣的測(cè)定結(jié)果稱為粗蛋白。凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。此法可應(yīng)用于各類(lèi)食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定(3)蛋白質(zhì)含量測(cè)定最常用的方法

凱氏定氮法是通過(guò)測(cè)出樣學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)

掌握常量、微量凱氏定氮法的操作技能，及氨基酸態(tài)氮的檢驗(yàn)方法和技術(shù)。

熟悉凱氏定氮裝置的組件和安裝、使用知識(shí)了解凱氏定氮法原理和方法，氨基酸和氨基酸態(tài)氮的測(cè)定原理；學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)掌握常量、微量凱氏定氮法的操作技能，及氨基酸6.2凱氏定氮法

凱氏定氮法：常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法

微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。目前通用以硫酸銅作為常量、半微量、微量凱氏定氮法的催化劑。在凱氏法改良中主要的問(wèn)題是，氮化合物中氮的完全氨化問(wèn)題及縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操作的問(wèn)題即分解試樣所用的催化劑，得到改進(jìn)。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦。6.2凱氏定氮法

凱氏定氮法：常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的

6.2.1

原理

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。凱氏定氮法

1、通過(guò)學(xué)習(xí)覬氏定氮法的原理，我們可知道操作分為哪幾個(gè)大的步驟？2、加入硫酸鉀、硫酸銅的作用是什么？

6.2.1

原理凱氏定氮法

1、通過(guò)學(xué)習(xí)覬氏定氮法的原

①消化反應(yīng)方程式如下：

2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4

＝(NH4)2SO4

＋6CO2

＋12SO2

＋16H2O

濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。

濃硫酸又具有氧化性,將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO4

①消化反應(yīng)方程式如下：

2NH2(CH)2CO

在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下：

加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反應(yīng)方程式如下：②蒸餾

③吸收與滴定2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O

2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

在消化完全的樣品(4)測(cè)定方法①.常量凱氏定氮法(4)測(cè)定方法①.常量凱氏定氮法改進(jìn)后的消化裝置改進(jìn)后的消化裝置：樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。

1.

樣品消化觀察與思考：1、樣品中加入濃硫酸后，溶液的顏色立即發(fā)生什么變化？2、消化過(guò)程中是否有大量的泡沖到瓶頸，原因是什么？3、如何判斷消化的終點(diǎn)？②

微量凱氏定氮法1.

樣品消化觀察與思考：②

微量凱氏定氮法

按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。

在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。思考：1、為什么在蒸汽發(fā)生瓶中要加入指示劑甲基橙和硫酸？加入數(shù)粒玻璃珠的作用是什么？2.蒸餾按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣

取下接受瓶，以0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。3.滴定

3.滴定(5)結(jié)果計(jì)算

式中W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

V0—滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

V1—滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

V2—蒸餾時(shí)吸取樣品稀釋液體積，mL；

C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；

0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；

F—蛋白質(zhì)系數(shù)；

m—樣品質(zhì)量，g。(5)結(jié)果計(jì)算

6.2.2樣品的分解條件（1）K2SO4或Na2SO4

：提高溶液的沸點(diǎn)（2）催化劑：

CuSO4、

氧化汞、汞、硒粉都是良好的催化劑，但后三種有劇毒；

（3）氧化劑：過(guò)氧化氫6.2.2樣品的分解條件（1）K2SO4或Na2SO4硫酸鉀的作用

加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸鉀作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度其反應(yīng)式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

一般純硫酸的沸點(diǎn)在340攝氏度左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到4000C以上，原因主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大

，故沸點(diǎn)升高。但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O硫酸鉀的作用加入硫酸鉀可以提高溶液的硫酸銅的作用①催化劑C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。②可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)③下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。硫酸銅的作用①催化劑C+2CuSO4=Cu2SO4+SO（1）

所用試劑應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。加指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性。（2）

若樣品含脂肪或糖較多時(shí)，應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫

應(yīng)加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑，防止其溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。（3）

若樣品消化液不易澄清透明，可加入300g/L2~3ml過(guò)氧化氫后再加熱。6.2.3注意事項(xiàng)6.2.3注意事項(xiàng)（4）

硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。硫酸銅也是蒸餾時(shí)樣品液堿化的指示劑，若所加堿量不足，分解液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，需再增加氫氧化鈉用量。（5）

若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g，可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化時(shí)間一般約4小時(shí)左右即可，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起氨的損失。一般消化至透明后繼續(xù)30分鐘即可.（4）

硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。硫酸銅也是蒸餾時(shí)（7）

蒸餾過(guò)程應(yīng)注意接頭處無(wú)松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開(kāi)液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開(kāi)，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（8）

硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40°C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。（9）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。（7）

蒸餾過(guò)程應(yīng)注意接頭處無(wú)松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

雙指示劑甲醛滴定法：原理、試劑、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算、說(shuō)明電位滴定法：原理、試劑、儀器、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算6.3氨基酸氮的測(cè)定氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法：原理、試劑、測(cè)定6.3.1雙指示劑甲醛滴定法(1)原理

氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定-COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。反應(yīng)式（有三種不同的推論）如下：RCHH3NCCORCCOHOHNH2+HCHORCCOOHHNCH2+NaOHRCHCOOHNHCH2OH或RCHCOOHN(CH2OH)2或RCHCOONaNCH2或RCHNHCOOHCHO6.3.1雙指示劑甲醛滴定法RCHH3NCCORCCOHO(2)操作方法

移取含氨基酸約20～30mg的樣品溶液2份，分別置于250ml錐形瓶中，各加50ml蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅置試劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，用0.1ml/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別紀(jì)錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。

用中性紅作指示劑，先測(cè)定其它游離酸的含量；再用百里酚酞作指示劑測(cè)定氨基酸和游離酸的總含量。(2)操作方法(3)說(shuō)明及注意事項(xiàng)

①此法適用于測(cè)定食品中的游離氨基酸。②固體樣品應(yīng)先粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，測(cè)定萃取液，液體試樣可直接測(cè)定。萃取在50℃水浴中進(jìn)行0.5h。③若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色，或用電位滴定法測(cè)定。④與本法類(lèi)似的還有單指示劑(百里酚酞)甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和—COOH時(shí)的pH值為8.5～9.5，但分析結(jié)果稍偏低。(3)說(shuō)明及注意事項(xiàng)式中

c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1——用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;V2——用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;m——測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol

(4)結(jié)果計(jì)算

氨基酸態(tài)氮

（%）式中(4)結(jié)果計(jì)算氨基酸態(tài)氮

（%）6.3.2電位滴定法(1)原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。(2)儀器

酸度計(jì)（附磁力攪攔器）；6.3.2電位滴定法式中：C-----氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L：

G------鄰苯二甲酸氫鉀的重量，g；

V-----氫氧化鈉溶液用量，mLV0----空白試驗(yàn)氫氧化鈉溶液用量，mL；

204.2—鄰苯二甲酸氫鉀的分子量。（3）按下式計(jì)算NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的量濃度C=G(V-V0)ⅹ10-3ⅹ204.2式中：C-----氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L：（試驗(yàn)步驟①吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液（5mL醬油），置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0mL燒杯中，加60mL水，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2（記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，可計(jì)算總酸含量）。②加入10.0mL甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)。③同時(shí)取80mL水，先用0.05mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，做試劑空白試驗(yàn)。微量凱氏定氮法的催化劑課件（5）結(jié)果計(jì)算①數(shù)據(jù)記錄加甲醛前耗NaOH量/mL加甲醛后耗NaOH量/mLNaOH標(biāo)準(zhǔn)液濃度/mol.L-1樣品滴定123平均空白滴定123平均（5）結(jié)果計(jì)算①數(shù)據(jù)記錄加甲醛前耗NaOH量/mL加甲醛后耗②計(jì)算

（V1-V2）×c×0.014氨基酸態(tài)氮%=————————————×100m×20/100V1---醬油稀釋液在加入甲醛后滴定至pH8.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mLV2---空白滴定在加入甲醛后滴定至pH8.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mLc---NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/Lm---吸取的醬油的質(zhì)量，g（密度=1.15g/mL）0.014---氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol②計(jì)算6.蛋白質(zhì)及氨基酸的測(cè)定6.1概述6.2凱氏定氮法6.3氨基酸氮的測(cè)定6.蛋白質(zhì)及氨基酸的測(cè)定6.1概述6.1概述（1）食品中的蛋白質(zhì)含量及測(cè)定意義（2）蛋白質(zhì)系數(shù)（3）蛋白質(zhì)測(cè)定方法6.1概述食品中的蛋白質(zhì)含量牛肉豬肉兔肉雞肉

209.52120大豆米面粉菠菜蘋(píng)果

408.5102.4

0.4食品中的蛋白質(zhì)含量牛肉豬肉兔肉

測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開(kāi)發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過(guò)程控制均具有極重要的意義。

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N,在某些蛋白質(zhì)中還含有

微量的s、P、Cu、Fe、I等元素，但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。蛋白質(zhì)的測(cè)定意義蛋白質(zhì)的測(cè)定意義

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。

不同種類(lèi)食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。（2）蛋白質(zhì)系數(shù)

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種(3)蛋白質(zhì)含量測(cè)定最常用的方法

凱氏定氮法是通過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)用凱氏定氮法通過(guò)測(cè)總氮量來(lái)確定蛋白質(zhì)含量，包含了核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白質(zhì)含氮化合物，所以這樣的測(cè)定結(jié)果稱為粗蛋白。凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。此法可應(yīng)用于各類(lèi)食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定(3)蛋白質(zhì)含量測(cè)定最常用的方法

凱氏定氮法是通過(guò)測(cè)出樣學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)

掌握常量、微量凱氏定氮法的操作技能，及氨基酸態(tài)氮的檢驗(yàn)方法和技術(shù)。

熟悉凱氏定氮裝置的組件和安裝、使用知識(shí)了解凱氏定氮法原理和方法，氨基酸和氨基酸態(tài)氮的測(cè)定原理；學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)掌握常量、微量凱氏定氮法的操作技能，及氨基酸6.2凱氏定氮法

凱氏定氮法：常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法

微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。目前通用以硫酸銅作為常量、半微量、微量凱氏定氮法的催化劑。在凱氏法改良中主要的問(wèn)題是，氮化合物中氮的完全氨化問(wèn)題及縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操作的問(wèn)題即分解試樣所用的催化劑，得到改進(jìn)。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦。6.2凱氏定氮法

凱氏定氮法：常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的

6.2.1

原理

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。凱氏定氮法

1、通過(guò)學(xué)習(xí)覬氏定氮法的原理，我們可知道操作分為哪幾個(gè)大的步驟？2、加入硫酸鉀、硫酸銅的作用是什么？

6.2.1

原理凱氏定氮法

1、通過(guò)學(xué)習(xí)覬氏定氮法的原

①消化反應(yīng)方程式如下：

2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4

＝(NH4)2SO4

＋6CO2

＋12SO2

＋16H2O

濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。

濃硫酸又具有氧化性,將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO4

①消化反應(yīng)方程式如下：

2NH2(CH)2CO

在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下：

加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反應(yīng)方程式如下：②蒸餾

③吸收與滴定2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O

2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

在消化完全的樣品(4)測(cè)定方法①.常量凱氏定氮法(4)測(cè)定方法①.常量凱氏定氮法改進(jìn)后的消化裝置改進(jìn)后的消化裝置：樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。

1.

樣品消化觀察與思考：1、樣品中加入濃硫酸后，溶液的顏色立即發(fā)生什么變化？2、消化過(guò)程中是否有大量的泡沖到瓶頸，原因是什么？3、如何判斷消化的終點(diǎn)？②

微量凱氏定氮法1.

樣品消化觀察與思考：②

微量凱氏定氮法

按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。

在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。思考：1、為什么在蒸汽發(fā)生瓶中要加入指示劑甲基橙和硫酸？加入數(shù)粒玻璃珠的作用是什么？2.蒸餾按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣

取下接受瓶，以0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。3.滴定

3.滴定(5)結(jié)果計(jì)算

式中W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

V0—滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

V1—滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

V2—蒸餾時(shí)吸取樣品稀釋液體積，mL；

C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；

0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；

F—蛋白質(zhì)系數(shù)；

m—樣品質(zhì)量，g。(5)結(jié)果計(jì)算

6.2.2樣品的分解條件（1）K2SO4或Na2SO4

：提高溶液的沸點(diǎn)（2）催化劑：

CuSO4、

氧化汞、汞、硒粉都是良好的催化劑，但后三種有劇毒；

（3）氧化劑：過(guò)氧化氫6.2.2樣品的分解條件（1）K2SO4或Na2SO4硫酸鉀的作用

加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸鉀作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度其反應(yīng)式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

一般純硫酸的沸點(diǎn)在340攝氏度左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到4000C以上，原因主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大

，故沸點(diǎn)升高。但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O硫酸鉀的作用加入硫酸鉀可以提高溶液的硫酸銅的作用①催化劑C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。②可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)③下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。硫酸銅的作用①催化劑C+2CuSO4=Cu2SO4+SO（1）

所用試劑應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。加指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性。（2）

若樣品含脂肪或糖較多時(shí)，應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫

應(yīng)加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑，防止其溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。（3）

若樣品消化液不易澄清透明，可加入300g/L2~3ml過(guò)氧化氫后再加熱。6.2.3注意事項(xiàng)6.2.3注意事項(xiàng)（4）

硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。硫酸銅也是蒸餾時(shí)樣品液堿化的指示劑，若所加堿量不足，分解液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，需再增加氫氧化鈉用量。（5）

若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g，可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化時(shí)間一般約4小時(shí)左右即可，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起氨的損失。一般消化至透明后繼續(xù)30分鐘即可.（4）

硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。硫酸銅也是蒸餾時(shí)（7）

蒸餾過(guò)程應(yīng)注意接頭處無(wú)松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開(kāi)液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開(kāi)，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（8）

硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40°C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。（9）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。（7）

蒸餾過(guò)程應(yīng)注意接頭處無(wú)松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

雙指示劑甲醛滴定法：原理、試劑、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算、說(shuō)明電位滴定法：原理、試劑、儀器、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算6.3氨基酸氮的測(cè)定氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法：原理、試劑、測(cè)定6.3.1雙指示劑甲醛滴定法(1)原理

氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定-COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。反應(yīng)式（有三種不同的推論）如下：RCHH3NCCORCCOHOHNH2+HCHORCCOOHHNCH2+NaOHRCHCOOHNHCH2OH或RCHCOOHN(CH2OH)2或RCHCOONaNCH2或RCHNHCOOHCHO6.3.1雙指示劑甲醛滴定法RCHH3NCCORCCOHO(2)操作方法

移取含氨基酸約20～30mg的樣品溶液2份，分別置于250ml錐形瓶中，各加50ml蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅置試劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，用0.1ml/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別紀(jì)錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。

用中性紅作指示劑，先測(cè)定其它游離酸的含量；再用百里酚酞作指示劑測(cè)定氨基酸和游離酸的總含量。(2)操作方法(3)說(shuō)明及注意事項(xiàng)

①此法適用于測(cè)定食品中的游離氨基酸。②固體樣品應(yīng)先粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，測(cè)定萃取液，液體試樣可直接測(cè)定。萃取在50℃水浴中進(jìn)行0.5h。③若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色，或用電位滴定法測(cè)定。④與本法類(lèi)似的還有單指示劑(百里酚酞)甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和—COOH時(shí)的pH值為8.5～9.5，但分析結(jié)果稍偏低。(3)說(shuō)明及注意事項(xiàng)式中

c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;