毛細管電泳技術(shù)在中藥成分分離分析中的應用進展

毛細管電泳技術(shù)在中藥成分分離分析中的應用進展摘要：介紹了毛細管電泳的原理，分離模式，以及它在中藥成分分離分析中的研究動態(tài)和優(yōu)勢。關(guān)鍵詞：毛細管電泳；中藥成分；應用進展ResearchProgressofSeparationAnalysisofCapillaryElectrophoresisontheChineseHerbalConstituentsinTraditionalChineseMedicineAbstract：Thispaperintroducestheprincipleofcapillaryelectrophoresis，separationmode，aswellasitsanalysisofChinesemedicinesdynamicandadvantages.Keywords：Capillaryelectrophoresis；chineseherbalconstituents；researchprogress高效毛細管電泳（HPCE，Highperformancecapillaryelectrophresis)又稱毛細管電泳（CE)，是上世紀80年代后期在分析化學，尤其是生物分析化學領(lǐng)域得到迅速發(fā)展的一種分離分析手段。因其高效、高速、高靈敏度、高自動化以及樣品和試劑耗用量少等特點，被廣泛應用于藥物的研究和分析中。1毛細管電泳技術(shù) 電泳即帶電粒子在電解質(zhì)中，在電場作用下以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象，粒子在單位電場下的電泳速度稱為淌度。淌度與粒子所帶電荷數(shù)及體積大小相關(guān)，因此不同的粒子由于淌度不同從而實現(xiàn)電泳分離。但是傳統(tǒng)電泳技術(shù)無法克服高壓產(chǎn)生的焦耳熱現(xiàn)象，從而限制了高壓的使用，無法提高分離速度和分離效率。毛細管電泳則采用毛細管作為分離通道，毛細管的表面積/體積比大，因而散熱快，可以承受高電場(100-1000V/cm)。1.1分離原理毛細管電泳是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)，其基本結(jié)構(gòu)包括進樣系統(tǒng)、毛細管、檢側(cè)系統(tǒng)、高壓電源、清洗機構(gòu)、溫控系統(tǒng)等。它的原理是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管作為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。CE中的進樣方式有流體力學進樣、電動進樣和柱內(nèi)樣品富集進樣。流體力學進樣是通過在毛細管的入口端施加壓力、在出口端抽真空或抬高入口端(虹吸現(xiàn)象)使毛細管的入口端和出口端的壓力不同來進樣；電動進樣時所用電壓一般為5-10kV，進樣電壓通常要比分離電壓低3-5倍；柱內(nèi)樣品富集是指樣品在分離之前先進行濃縮以達到提高檢測靈敏度的目的。1.2分離模式HPCE結(jié)合經(jīng)典電泳與色譜技術(shù)的工作原理和特點，發(fā)展出了多種分離模式，這些分離模式的原理和特點見表1[1]。表1毛細管電泳的主要分離模式類型原理應用特點毛細管區(qū)帶電泳（CZE）基于溶質(zhì)的電泳淌度不同分離離子化合物，樣品分子大毛細管膠束電動色譜（MECC)基于溶質(zhì)膠束相和水相的不同分配分離離子及中性化合物，樣品分子量小于5000毛細管電色譜（CEC）基于溶質(zhì)與固定相相互作用的不同CE與HPLC的結(jié)合毛細管等速電泳（CITP）基于溶質(zhì)的電泳淌度不同用于預濃縮毛細管等電聚焦（CIEF）基于物質(zhì)的等電點不同測定蛋白質(zhì)的等電點、分離異構(gòu)體毛細管凝膠電泳（CGE）凝膠起“分子篩”作用，基于溶質(zhì)分子大小不同用于蛋白質(zhì)，寡聚核苷酸等大分子的分離2EC在中藥活性成分分離分析中的應用中藥中含有的有效活性成分有其特殊復雜性，首先是中藥品種繁多，不同品種含有的活性成分含量差異大；其次，中藥中有效成分還受產(chǎn)地、栽培方式、生長環(huán)境及采收季節(jié)和環(huán)境等多種因素影響。HPCE具有高效、快速、溶劑消耗小、進樣體積小等特點，能夠同時分離分析中藥所含的多種成分，提高分析效率，解決中藥分析中遇到的基體復雜的問題，因此在中藥活性成分分離分析方面發(fā)揮出了獨特的優(yōu)勢[2，3]，在黃酮類、生物堿類、醌類、有機酸類、三萜類、苷類、多糖類和香豆素類等多種天然化學成分的分離分析中被廣泛應用。2.1黃酮類黃酮類化合物廣泛分布于植物界，并具有較強的生物活性，例如抗菌作用、抑制癌細胞的生長或抗癌作用、解痙攣作用和降低血壓作用等[4]。黃酮類化合物不但在醫(yī)藥上有著廣泛的應用而且在日常生活當中可作為功能食品添加劑、天然氧化劑、天然色素和甜味劑等。由于黃酮類化合物重要的藥用價值和保健作用，對于復雜天然產(chǎn)物中的黃酮類化合物進行分離分析對其進一步的研究工作起著指導作用，同時對于其應用和產(chǎn)品開發(fā)也具有重要的意義[5]。在黃酮類化合物的分離分析中，用得較多的是MECC和CZE2種分離模式[6]。MECC方式可用于分離中性分子；CZE對樣品組分的分離是基于樣品荷質(zhì)比的差異，一些可離子化的成分可采用CZE模式進行分離，許多黃酮類化合物分子內(nèi)具有酚羥基，在一定的pH下可以離解而帶電荷，從而可以用CZE模式進行分離。陳興國等[7]建立了一種簡單快速的分離槲皮素、蕓香苷和綠原酸的反向遷移毛細管膠束電動色譜(RF-MECC)新方法。Liu等[8]以MECC分離了黃芩中的黃芩苷、黃芩素、漢黃芬素、漢黃芬素-7-葡搪普酸、木蝴蝶素A和木蝴蝶素A-7-O-葡糖苷酸。Morin等[9]研究了糖基不同的槲皮素糖苷的CZE分離，還比較了香葉木素、香葉木苷、香葉木素-7-O-葡萄糖醛酸、橙皮苷、蒙花苷、異野漆樹苷等的CZE和MECC分離。孫蓮等[10]采用高效毛細管電泳法（HPCE），分離測定了新疆不同地區(qū)、不同采集期、不同品種的桑葉中的黃酮類成分蘆丁、槲皮素的含量。MarekUrbanek[11]用毛細管等速電泳（CITP）經(jīng)在柱樣品前處理分離測定了藤黃科植物連翹葉和花中的五種黃酮類化合物。2.2生物堿生物堿一般指存在于生物體內(nèi)的堿性含氮化合物，多數(shù)具有復雜的含氮雜環(huán)，有光學活性和顯著的生理效應[12]。生物堿具有抗腫瘤作用的同時，對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有一定的刺激作用，且還具有一定的抗菌、抗瘧作用[13]。許多生物堿類已被提取分離，并用作臨床治療藥物。楊武德等[14]采用高效毛細管電泳法（HPCE）測定十大功勞屬部分植物不同部位生物堿含量，發(fā)現(xiàn)不同品種、不同部位的植物中的鹽酸小檗堿的含量均有較大差異。李偉等[15]利用毛細管區(qū)帶電泳法（CZE）分離和測定了金銀花中莨菪烷類生物堿，并進行了定量分析。朱金花等[16]采用膠束電動色譜(MECC)中大體積進樣法分離測定蓮子心中的蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿，多種生物堿分離結(jié)果良好。2.3醌類醌類主要分為苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌四種類型，在中藥中以蒽醌及其衍生物尤為重要。醌類化合物的作用很廣泛，致瀉、止血、抗菌、抗病毒、解痙、利膽、利尿、鎮(zhèn)咳、平喘等作用[17]。ShangXY等[18]用環(huán)糊精修飾的毛細管膠束電動色譜法(CD-MECC)分離測定了大黃屬植物中五種蒽醌類活性成分的含量。鄭文捷等[19]用高效毛細管電泳法（HPCE）分離測定決明子及決明子茶中大黃素、蘆薈大黃素含量。大黃素、蘆薈大黃素在4-120μg/mL、10-200μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好，大黃素和蘆薈大黃素平均回收率分別為98.6%和102.9%。宗玉英等[20]建立了用膠束電動毛細管色譜法(MECC)分離和測定幾種大黃中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸的方法。2.4有機酸類有機酸類化合物的含量常被作為中草藥質(zhì)量評價的指標。該類化合物具有多方面的藥理作用，其中抗氧化、抗炎癥反應、降血壓的藥理作用對心血管病的防治具有極重要的臨床應用價值[21，22]。有機酸類化合物的結(jié)構(gòu)中多含有羥基、羧酸基等，解離后易帶上負電荷，采用膠束電動毛細管色譜法（MECC）模式中可以取得同毛細管區(qū)帶電泳法（CZE）—致的分離效果，但分離時間更短，分析迅速[23]。沈紅梅等[24]采用毛細管等速電泳(CITP)成功分離了烏梅中的檸檬酸和蘋果酸，并對不同采收期烏梅中檸檬酸和蘋果酸的含量進行了動態(tài)分析。范國榮等[25]選擇毛細管區(qū)帶電泳法（CZE）分離模式，以肉桂酸為內(nèi)標分離測定四倍體板藍根藥材中抗內(nèi)毒素活性成分5種有機酸成分的含量，并與二倍體板藍根相比較，以考察四倍體板藍根藥材的優(yōu)良品質(zhì)。陳纘光等[26]采用反向HPCE中反向CZE分離測定了當歸中阿魏酸的含量。2.5三萜類多數(shù)三萜類化合物是一類基本母核30個C原子組成的萜類化合物，在自然界分布也很廣。三萜類化合物具有廣泛的生理活性，其具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇、殺軟體動物、抗生育等活性[27]。梁生旺等[28]利用膠束電動毛細管色譜法（MECC）建立有效的分離分析中藥三七中三萜類成分的方法，實現(xiàn)了三七中三萜類成分的分離，且具有靈敏度高、快速、易于重現(xiàn)且所用試劑價格低廉的優(yōu)點。2.6苷類苷類廣泛存在生物體中，生物體中的游離苷元是很少的，作為有效成分的往往是這些游離苷元和一個或多個糖相連所組成的苷。這類苷具有非常廣泛的生物活性。丁紅梅等[29]建立了毛細管區(qū)帶電泳（CZE）分離測定中藥側(cè)柏葉中槲皮苷的新方法，該方法簡便、準確，為此類藥物的質(zhì)量控制提供了一種快速的檢測方法。黃寶美等[30]建立了毛細管電泳-安培檢測法(CE-AD)測定蘆薈苷的含量，方法檢出限低，靈敏度高，為擴大蘆薈資源的應用提供了可靠的科學依據(jù)。ZhangY[31]等人以MECC模式成功分離了牧草紅三葉中大豆苷元、鷹嘴豆芽素A等四種異黃酮。2.7多糖類多糖是由10個以上的單糖分子通過苷鍵聚合而成，分子量較大，一般由幾百個甚至幾百萬個單糖分子組成，已失去一般單糖分子的性質(zhì)，一般無甜味，也無還原性。植物多糖包括纖維素、淀粉、粘液質(zhì)、果聚糖、樹膠等；動物多糖包括肝素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、甲殼素等。馬曉麗等[32]首次采用柱前衍生化方法，用毛細管電泳法（CE）研究大蒜多糖的單糖組成，以期為大蒜資源的開發(fā)和利用提供基礎依據(jù)。梁加貝等[33]采用高效毛細管電泳法（HPCE）測定靈芝多糖中單糖的組成。其將靈芝多糖水解后，經(jīng)PMP衍生化，采用高效毛細管電泳分析，結(jié)果顯示：靈芝多糖中含葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖的摩爾比為4.5∶2.8∶1.3∶3.6。2.8香豆素類香豆素類是一類具有苯并α-吡喃酮母核的天然產(chǎn)物的總稱。其在中藥中廣泛存在，也具有多種生物活性，如茵陳中的濱蒿內(nèi)酯具有解痙、利膽的作用，蛇床子中的蛇床子素可用于殺蟲止癢等。劉蔓等[34]膠束毛細管電動色譜法（MECC)離測定北沙參中花椒毒素、補骨脂素、異茴芹內(nèi)酯、東莨菪內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯5種香豆素類成分。3展望毛細管電泳法用于分析中藥中的成分具有分離模式多適合中藥中多種化學成分的分離，且其操作簡單耗時短，易于清洗，能夠有效節(jié)約中藥成分分析的成本和周期，所以現(xiàn)在在中藥質(zhì)量控制和標準指紋圖譜的建立中起了非常重要的作用。此外，還可以采用CE-MS或CE-MS/MS聯(lián)機方式，將CE的高分離效率和MS的定性優(yōu)勢結(jié)合起來，建立藥材和復方藥物的指紋圖譜和多種成分的多指標。目前各商品儀器經(jīng)不斷改進和完善，加上自動進樣器的普遍使用，使以上缺點不斷的得到克服，可以預見，HPCE必將給天然產(chǎn)物的分離工作帶來極大的方便，使天然產(chǎn)物的分離技術(shù)得到更大的發(fā)展。參考文獻[1]安婭，張笑一.毛細管電泳分析化妝品中天然活性物的研究進展[J].寧夏農(nóng)林科技，2011，52（2）：78-81.[2]吳娟芳，陳令新，羅國安，等.毛細管電泳技術(shù)在藥物分析中的應用研究進展[J].藥學學報，2006，41(5)：385-389.[3]SuntornsukL.Capillaryelectrophoresisofphytochemicalsubstances[J].PharmBiomedAnal，2002，27：679-683.[4]趙曉莉，岳紅.黃酮類化合物分析方法概述[J].鹽湖研究，2005，13（2）：34-39.[5]張玉，孫磊，黎桂輝，等.毛細管電泳技術(shù)在天然黃酮類物質(zhì)測定中的應用評述[J]，2010，21(4)：102.[6]李玉紅，聶萬達，劉明言.高效毛細管電泳在中藥中的應用進展[J].2006，37增刊：（353）.[7]陳興國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