雙向電泳的技術(shù)流程和樣品制備

雙向電泳的

技術(shù)流程和樣品制備史須北京大學人類疾病基因研究中心基因組學與蛋白質(zhì)組學基因組學：蛋白質(zhì)組學：可視為分子生物學的大規(guī)模篩選技術(shù)，目的在于歸類細胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。上述兩種學科的研究內(nèi)容在互補的水平上研究了細胞的分子架構(gòu)，又都在各自的水平上提供了增強對方效應的信息，因此二者存在有很強的且?guī)в邢到y(tǒng)性相互關(guān)系。Applicationsofproteomics

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Proteinidentification/characterization?Protein-proteininteraction?Post-translationalmodifications?Subcellularlocation?Elucidationofpathway?Targetvalidationandtoxicology?Drugdiscovery蛋白質(zhì)組分析的首要要求將來自于全細胞、組織或生物體中所包含的多達幾千種混合蛋白質(zhì)進行分離、檢測和分析。2-DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。生物學問題的提出實驗模型的設計實驗組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實驗的進一步驗證蛋白信息的初步獲得蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定雙向電泳分析中的樣品制備制備原則：應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。可溶性樣品

固體組織樣品

細胞不同樣品的基本處理方法樣品的分級處理通過采用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進行分級處理，可降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。溶解的目標：1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點，相應的表示單個多肽的點的強度會下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進行還原。起載體作用的的兩性電解質(zhì)質(zhì)：即便在變性劑劑和表面活性性劑存在的情情況下，某些些蛋白質(zhì)也需需要在鹽離子子的作用下才才能保持其處處于溶解狀態(tài)態(tài)，否則這些些蛋白質(zhì)在其其處于PI點點時會發(fā)生沉沉淀。Carrierampholytes的作用用在于捕獲樣樣品中的少量量鹽分，從而而保證蛋白質(zhì)質(zhì)的溶解性。。應用時，兩兩性電解質(zhì)的的濃度應小于于0.2％（（w/v)。。濃度過高會會使IEF的的速度降低。。另外，為了了保證實驗的的精確性，在在選擇不同pH范圍的IPG膠條時時，也應使兩兩性電解質(zhì)的的pH值與之之相符合。樣品液的準備備標準液：ReagentAmount8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBPstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytesSeenexttable0.0002%bromophenolblue100ulof0.1%stockddH2OTo50mlIPGpHRangeBio-LyteAmpholyte(stock)rangeBio-LyteAmpholyte(stock)Conc.(w/v)SampleSolutionVolumePer5mlSampleSolutionVolumePer50ml3-103/1040%25l250l4-74/640%12.5l125l5/740%12.5l125l3-63/540%25l250l4/640%12.l125l5-85/840%25l250l7-107/940%12.5l125l8/1020%25l250lSuggestedBio-lyteampholytecompositionforIPGuseReagentAmount7Murea4.1mlof8.5stockor2.1gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock4%CHAPS200mg0.2%carrierampholytesSeetable0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplechaotropicagentsolutionpreparationReagentAmount5Murea2.9mlof8.5stockor1.5gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrierampholytesSeetable40mMTris24.2mg0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplesurfactantsolutionpreparation樣品中中核酸酸的去去除對電泳泳的影影響：：增加樣樣品粘粘度、、與蛋蛋白質(zhì)質(zhì)形成成復合合物后后會出出現(xiàn)假假象遷遷移和和條紋紋。解決方方法：：用適適量純純的不不含蛋蛋白酶酶的核核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶進行行降解解，或或是利利用合合成載載體兩兩性電電解質(zhì)質(zhì)（SCA）同同核酸酸結(jié)合合形成成復合合物的的能力力，再再通過過超速速離心心來去去除復復合物物。亞蛋白白質(zhì)組組樣品品的制制備用超離離心技技術(shù)分分離出出細胞胞器、、質(zhì)膜膜和細細胞核核等成成分，，再用用適當當?shù)牡暗鞍踪|(zhì)質(zhì)溶解解液進進行溶溶解。。其優(yōu)優(yōu)點是是不僅僅大大大減少少樣品品的復復雜性性，而而且可可對分分離的的蛋白白質(zhì)進進行亞亞細胞胞定位位。但但該法法需要要專業(yè)業(yè)儀器器，有有時會會出現(xiàn)現(xiàn)假陽陽性。。順序抽抽提法法：根據(jù)細細胞蛋蛋白溶溶解性性的差差異，，用具具有不不同溶溶解能能力的的蛋白白溶解解液進進行抽抽提的的方法法。第一步步：用用Tris堿溶溶液裂裂解細細胞提提取高高溶解解性蛋蛋白；；第二步步：把把未溶溶解的的pellet用標標準IEF樣品品液溶溶解提提取高高疏水水性蛋蛋白；；第三步步：用用含復復合表表面活活性劑劑的蛋蛋白溶溶解液液，最最后抽抽提前前兩次次抽提提后不不能溶溶解的的膜蛋蛋白約約占整整個樣樣品的的11%（（W/W））。特殊樣樣品的的制備備低豐度度蛋白白的分分離：：盡管增增加上上樣量量和提提高總總蛋白白的溶溶解度度能增增加分分離時時的低低豐度度蛋白白的量量，但但同時時增加加了高高豐度度蛋白白的負負荷，，且造造成蛋蛋白的的疊加加效應應而影影響分分離。?，F(xiàn)常常用預預分級級＋窄窄pH膠的的微制制備技技術(shù)進進行分分離：：即將將總蛋蛋白組組分成成蛋白白質(zhì)組組亞群群，再再用pH梯梯度小小于2個pH單單位的的IPG膠膠進行行窄pH范范圍的的分離離。強堿性性蛋白白質(zhì)（（如核核糖體體））的處處理：：先將將蛋白白預處處理以以富集集，再再用特特殊pH梯梯度的的IPG膠膠條（（如pH3－12、、4-12或10-12）進進行等等電聚聚焦。。其中中窄范范圍堿堿性IPG膠（（如pH10-12）的的挑戰(zhàn)戰(zhàn)是克克服反反向、、陰極極向陽陽極、、電滲滲流和和水平平條紋紋模式式，而而寬范范圍的的堿性性IPG膠膠（如如pH3-12、4-12））等消消除了了窄范范圍膠膠所需需要的的專門門水化化液。。極端分分子量量的蛋蛋白質(zhì)質(zhì)：小于8kD和大大于200kD的蛋蛋白在在常規(guī)規(guī)IPG-2D上不不易看看到，，這可可能是是在Tris/glycine緩緩沖液液中，，樣品品和游游離的的dodelcylsulfateions持持續(xù)積積累濃濃縮，，與小小分子子量的的蛋白白質(zhì)發(fā)發(fā)生對對流混混合，，產(chǎn)生生茸毛毛狀的的或模模糊的的帶，，從而而降低低小蛋蛋白的的分辨辨率；；在膠膠底端端，高高濃度度的十十二磺磺酸使使蛋白白固定定致染染色困困難。。至于于高分分子量量蛋白白少的的原因因可能能是在在變性性條件件下，，蛋白白質(zhì)復復合物物變成成了多多肽，，或者者可能能是大大分子子。一維固固相pH梯梯度等等電聚聚焦（（IEFwithIPG）：：IPG膠的的材料料是Immobilines，為為擁有有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)構(gòu)的8種丙丙烯酰酰胺衍衍生物物系列列，其其中R包含含羧基基或叔叔氨基基團，，它們們構(gòu)成成了分分布在在pH3~10不同同值的的緩沖沖體系系。根根據(jù)公公布的的配方方計算算后，，將適適宜的的IPG試試劑添添加至至混合合物中中用于于凝膠膠聚合合，在在聚合合中緩緩沖基基團通通過乙乙烯鍵鍵共價價聚合合至聚聚丙烯烯酰胺胺骨架架中而而形成成pH梯度度。通通過這這種方方式生生成的的IPG不不會發(fā)發(fā)生電電滲透透作用用，因因而可可以進進行特特別穩(wěn)穩(wěn)定的的IEF分分離達達到真真正的的平衡衡狀態(tài)態(tài)。IPG膠條的重泡泡脹泡脹的實質(zhì)質(zhì)：是讓樣樣品能完全全以可溶性性的形式進進入IPG內(nèi)，從而而能進行接接下來的IEF。不同的加樣樣方法和加加樣量會導導致最終結(jié)結(jié)果的差異異：ProteanIEFcell、、IPGphor等等集成設備備的使用：：20mmol/LDTT墊墊片的使使用：溫度的選擇擇：蛋白載樣量量影響IPG膠條對蛋蛋白載樣量量的因素包包括：待分析的蛋蛋白點的量量應滿足隨隨后的質(zhì)譜譜分析。電泳的目的的：如果只只是得到一一張好的圖圖片，則無無需考慮太太多其它因因素。待研究蛋白白的豐度：：樣品的復雜雜度：復雜雜度較高的的樣品，為為了盡可能能的了解所所包含的每每種蛋白，，需要反復復實驗才能能完成。如如果將待檢檢樣品被富富集以后則則更易分析析。IPG膠條條的pH范范圍：IPG膠條條的蛋白質(zhì)質(zhì)大約載樣樣量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100g/125l200~500ug/125l11cm50~200g/185l250~1000ug/185l17cm100~300g/300l1~3mg/300lIPGIEF中中pH梯度度的的選選擇擇常用用方方法法：：先先寬寬后后窄窄，，先先線線性性后后非非線線性性，，先先短短后后長長，，預預試試驗驗確確定定。。預分分步步收收集集細胞胞漿漿細胞胞核核細胞胞膜膜核糖糖體體及及其其他他特特定定細細胞胞成成份份細胞胞分分泌泌成成份份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第二步第三步用窄pH范圍陣陣列分離離低豐度度或交叉叉覆蓋蛋蛋白陣列那些些亞細胞胞定位位位置的功功能蛋白白質(zhì)亞蛋白質(zhì)質(zhì)組陣列列策略的的框架圖圖3倍3倍聚焦時間間的優(yōu)化化理論上講講，要獲獲得最好好的圖譜譜質(zhì)量和和重復性性所需最最佳時間間是IEF分離離達到穩(wěn)穩(wěn)定態(tài)所所需的時時間。聚焦時間間太短，，會導致致水平和和垂直條條紋的出出現(xiàn)。過度聚焦焦雖然不不會導致致蛋白質(zhì)質(zhì)向陰極極漂移，，但會因因為活性性水轉(zhuǎn)運運而導致致過多水水在IPG膠表表面滲出出（電滲滲）而造造成蛋白白圖譜變變性，在在膠條堿堿性端產(chǎn)產(chǎn)生水平平條紋以以及蛋白白丟失。。最佳時間間的確定定需要根根據(jù)不同同蛋白樣樣品、上上樣量、、pH范范圍和膠膠條長度度通過經(jīng)經(jīng)驗來確確定。IEF的的基本條條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid兩維間的的平衡一維結(jié)束束后可馬馬上進行行二維電電泳，也也可保存存在兩片片塑料膜膜間于－－80°°保存數(shù)數(shù)月。但在二維維電泳前前一定要要進行膠膠條的平平衡，以以便于被被分離的的蛋白質(zhì)質(zhì)與SDS完整整結(jié)合，，從而在在SDS是是電泳能能順利進進行。建議方案案是：用用含2%(m/v)SDS、、1%(m/v)DTT、6mM尿尿素和30%甘甘油的50mMTris（（pH8.8））緩沖液液先平衡衡15min，，再用5%(m/v)碘乙酰酰胺取代代DTT后的上上述緩沖沖液平衡衡15min。。如果用用TBP代替DTT則則只需一一步平衡衡。二維SDS同普通SDS類似似。但一般在在垂直電電泳系統(tǒng)統(tǒng)中無需需濃縮膠膠，因為為在IPG膠條條中蛋白白質(zhì)區(qū)域域已得到到濃縮，，可以認認為非限限制性IEF膠膠（低濃濃度丙烯烯酰胺膠膠）充當當了濃縮縮膠。聚丙烯酰酰胺凝膠膠和轉(zhuǎn)印印到膜上上的蛋白白質(zhì)的檢檢測理想顯色色劑的7S安全（safety））：靈敏（sensitivity）：：簡單（simplicity）：特異性（（specificity））：快速（speed）：：穩(wěn)定（stability））：兼容性（（synergy）：：有機染料料和銀染染考染靈敏敏度為30~100ng，線線性范圍圍是20倍；銀銀染的線線性范圍圍是40倍，靈靈敏度是是考染的的100倍。膠體考馬馬斯亮藍藍染色技技術(shù)可實實現(xiàn)PAGE的的無背景景染色，，其極限限靈敏度度為8~10ng，但但這種染染液會對對蛋白質(zhì)質(zhì)進行修修飾而影影響質(zhì)譜譜分析的的結(jié)果。。胺基黑常常用于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印至聚聚偏二氟氟乙烯（（PVDF）和和/或硝硝酸纖維維素膜上上的蛋白白質(zhì)的染染色。銀染的缺缺點是：：對某些些種類的的蛋白質(zhì)質(zhì)染色效效果差，，對其后后的蛋白白質(zhì)測序序和質(zhì)譜譜分析造造成影響響。這兩種染染色技術(shù)術(shù)都可減減少膠內(nèi)內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)產(chǎn)量。。負染染能專門提提高PAGE膠膠上蛋白白質(zhì)的回回收率，，但不能能用于膜膜上染色色。結(jié)果表現(xiàn)現(xiàn)為膠面面著色而而蛋白質(zhì)質(zhì)點透明明。速度快（（5~15min），，蛋白質(zhì)質(zhì)的生物物活性能能保持：：一旦用用絡合劑劑如EDTA或或Tris/甘甘氨酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移緩沖沖液來絡絡合金屬屬離子就就可進行行提取來來轉(zhuǎn)移蛋蛋白質(zhì)。。它主要適適用于蛋蛋白質(zhì)顯顯色、完完整蛋白白質(zhì)的膠膠上被動動提取以以及質(zhì)譜譜分析。。該技術(shù)主主要包括括金屬鹽鹽染料、、鋅－咪咪唑染料料等的使使用。膠體擴散散染料主要用于于高靈敏敏度檢出出電轉(zhuǎn)印印至硝酸酸纖維素素和PVDF膜膜上的蛋蛋白質(zhì)，，不用于于膠內(nèi)染染色。最好的膠膠體金染染色的靈靈敏度與與PAGE膠內(nèi)內(nèi)的銀染染類似。。這種技術(shù)術(shù)主要包包括印度度墨水染染料、膠膠體金屬屬染料等等。有機熒光光團染料料包括共價價結(jié)合和和非共價價結(jié)合的的熒光團團染料兩兩類。后后者最為為常用，，其典型型代表是是已經(jīng)商商品化的的SYPRORed、Orange、、Ruby等等熒光染染料。這三種染染料可對對SDS膠膠內(nèi)蛋白白質(zhì)進行行一步染染色，約約30~60min完完成，靈靈敏度為為2~10ng。染色色后的凝凝膠用標標準的實實驗室300nm紫外外透射儀儀進行照照像保存存，其線線性范圍圍為3個個數(shù)量級級。這三三種種染染料料的的電電泳泳染染色色結(jié)結(jié)果果與與在在酵酵母母中中通通過過SAGE所所獲獲得得的的基基因因表表達達水水平平的的動動態(tài)態(tài)范范圍圍相相匹匹配配。。在Tris/甘甘氨氨酸酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印印緩緩沖沖液液中中染染色色后后，，蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)可可被被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印印至至膜膜上上并并進進行行免免疫疫染染色色或或Edman測測序序來來鑒鑒定定蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)。。金屬屬螯螯合合染染料料這是是一一類類與與現(xiàn)現(xiàn)代代蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)組組學學研研究究相相兼兼容容的的、、相相對對較較新新的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)顯顯色色試試劑劑，，其其設設計計專專門門與與常常用用微微量量化化學學表表征征過過程程兼兼容容。。它它們們不不包包含含戊戊二二醛醛、、甲甲醛醛或或Tween-20等等，，很很容容易易和和集集成成化化蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)組組學學平平臺臺（（包包括括自自動動化化凝凝膠膠染染色色儀儀、、圖圖像像分分析析工工作作站站、、機機器器人人剪剪切切儀儀器器、、蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)酶酶解解工工作作站站和和質(zhì)質(zhì)譜譜儀儀等等））相相結(jié)結(jié)合合。。其中中SYPRORuby也也是是一一種種基基于于釕釕的的金金屬屬發(fā)發(fā)光光染染料料。。凝膠膠的的圖圖像像處處理理分分析析和和典型型流流程程凝膠膠圖圖像像的的掃掃描描：：圖像像加加工工：：斑點點檢檢測測和和定定量量：：凝膠膠配配比比：：數(shù)據(jù)據(jù)分分析析：：數(shù)據(jù)據(jù)呈呈遞遞和和解解釋釋：：2-DE數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)庫庫的的建建立立：：蛋白白質(zhì)質(zhì)的的膠膠內(nèi)內(nèi)酶酶切切包括括感感興興趣趣蛋蛋白白點點的的挖挖取取、、含含蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)凝凝膠膠的的脫脫色色、、膠膠內(nèi)內(nèi)蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的酶酶切切等等過過程程質(zhì)譜譜技技術(shù)術(shù)進進行行蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)鑒鑒定定的的基基本本流流程程樣品品制制備備與IPG膠膠條條水水化化IPG電電泳泳與上上樣樣緩緩沖沖液液浸浸潤潤SDS轉(zhuǎn)PVDF膜膜膠內(nèi)內(nèi)直直接接染染色色染色色取出出蛋蛋白白點點胰酶酶等等消消化化濃縮縮于于多多孔孔吸吸附附柱柱上上MALDI-MS肽肽指指紋紋圖圖數(shù)據(jù)據(jù)庫庫查查詢詢蛋白白質(zhì)質(zhì)鑒鑒定定已知知反向向HPLC分分離離MALDI-MS，，PSD片片段段分分析析示知知ESI-MS-MS、、微微測測序序?qū)嶒烌灧椒椒ǚㄍ暾暗鞍装踪|(zhì)質(zhì)（（如如凝凝膠膠分分離離或或色色