細(xì)胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳課件

細(xì)胞凋亡的DNA

瓊脂糖凝膠電泳細(xì)胞凋亡（apoptosis/programmedcelldeath）細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，一個(gè)由基因控制的主動(dòng)的有序的死亡過(guò)程，凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。生物學(xué)意義：①確保正常發(fā)育生長(zhǎng)：清除多余的細(xì)胞②維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、衰老的細(xì)胞③積極防御功能：對(duì)病毒感染細(xì)胞阻止復(fù)制其中最重要和最具有特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，形成以180~200bp為最小單位的單體或寡聚體片段。凋亡和壞死的區(qū)別壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無(wú)序變化的死亡過(guò)程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過(guò)程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)特征凋亡壞死單細(xì)胞或一小群細(xì)胞相鄰的細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞皺縮和卷積細(xì)胞腫脹核固縮和和碎裂核溶解完整的細(xì)胞膜破壞的細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)保留在凋亡小體細(xì)胞質(zhì)釋放無(wú)炎癥一般都存在炎癥材料1.凋亡細(xì)胞：經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞2.提取DNA：基因組DNA抽提試劑盒（RNA酶、蛋白酶K、懸浮液、裂解液、洗滌液、洗脫液、DNAladder標(biāo)準(zhǔn)品等）3.DNA電泳：1%的瓊脂糖凝膠、點(diǎn)樣緩沖液4.實(shí)驗(yàn)器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、臺(tái)式高速離心機(jī)、65℃水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、紫外透射儀二、提取胸腺細(xì)胞DNA：⑴裂解細(xì)胞階段（使用到的試劑：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液）將細(xì)胞離心后小心倒出液體，離心管中加入100μlL液和20μlA液，充分混勻，置于55℃溫浴20分鐘，其間來(lái)回顛倒離心管3-5次。(3)漂洗階段（使用試劑：600ul漂洗緩沖液×2=W液）倒掉收集管中的廢液，再加入600ulW液，12000rpm離心30秒。重復(fù)上敘步驟，再次加入600ulW液，12000rpm離心30秒。倒掉廢液，再次12000rpm離心30秒。(4)洗脫收獲（使用試劑：50μl洗脫緩沖液=T液）小心取出離心吸附柱（不可沾上W液，因其中含有乙醇，會(huì)使提取DNA變性），將其套入一個(gè)干凈的1.5mleppendorf管中，沿吸附柱的正中間小心加入50μlT液，靜置1分鐘后，于12000rpm離心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因組DNA,取10μl電泳。三、DNA瓊脂糖凝膠電泳：(5)制板:將1%的瓊脂糖凝膠加熱溶化，取20ml倒板,待凝,取梳。置板于電泳槽中，加電泳緩沖液至淹沒(méi)過(guò)膠。(6)加樣：取50uLDNA樣品與10uL點(diǎn)樣緩沖液,混勻,10ul/孔。（DNAmarker直接加樣，5ul/孔）。(7)電泳：點(diǎn)樣孔置負(fù)極，電壓80-100V，電泳至溴酚蘭移出2/3距離時(shí)，關(guān)閉電源。(8)觀察：取出凝膠板，置紫外透射儀上，可見(jiàn)綠色DNA區(qū)帶。注意事項(xiàng)：a步驟2中，加入B液后一定要充分混勻。離心后，小心取出上清，Tips頭不可吸附上白色沉淀（為基因組蛋白）。b漂洗階段（步驟3）一定要離心充分去除漂洗緩沖液，可適當(dāng)將離心時(shí)間延長(zhǎng)。c洗脫緩沖液一定要保證加入到吸附柱中央。地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡1：DNAmarker;2-3：細(xì)胞壞死對(duì)照4-6：細(xì)胞凋亡；7：正常細(xì)胞對(duì)照基因組DNA抽提試劑盒SDS（十二烷基硫酸鈉）：破細(xì)胞膜、核膜，使組織蛋白與DNA分離EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：抑制DNA酶活性，確保目的DNA不再降解ProteinaseK：使染色質(zhì)上蛋白質(zhì)與DNA分離，并進(jìn)一步降解為小肽/氨基酸酚、氯仿：抽提除去蛋白質(zhì)異丙醇：沉淀DNAGoldview：DNA螢光染料，與DNA結(jié)合形成一種光絡(luò)合物，在紫外光下呈綠色螢光TNFreceptor-associateddeathdomain(TRADD)Fas-associateddeathdomainprotein(FADD)cysteine-asparticproteases（caspase）細(xì)胞形態(tài)的改變電鏡檢測(cè)：

可檢測(cè)單個(gè)凋亡細(xì)胞的變化，但細(xì)胞凋亡早期無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化的，需做其他實(shí)驗(yàn)證實(shí)。正常胸腺細(xì)胞凋亡胸腺細(xì)胞凋亡的淋巴細(xì)胞凋亡的淋巴細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬Caspase等凋亡相關(guān)因子檢測(cè)westernblot,immunoprecipitationImmunohistochemistryApoptosisPCRmicroarrayApoptoticoranti-apoptoticregulatorproteinssuchasBax,Bid,andBcl-2canalsobedetectedusingfluorescenceandconfocalmicroscopy檢測(cè)細(xì)胞膜的改變AnnexinV基本原理：正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV作為一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。線粒體的改變線粒體檢測(cè)：激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)1）線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT），