毒理學(xué)實驗課件

毒理學(xué)實驗實驗一

實驗動物的一般操作技術(shù)一、目的二、內(nèi)容（一）實驗動物的選擇1、物種的選擇：嚙齒類、非嚙齒類基本原則：代謝、生化、毒理學(xué)特征與人最接近的自然壽命不太長的易于飼養(yǎng)和實驗操作的經(jīng)濟(jì)且易于獲得的3、微生物學(xué)和寄生蟲控制的選擇Ⅰ級：普通動物，開放系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅱ級：清潔動物，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅲ級：SPF動動，屏障/隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅳ級：無菌動物，隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)4、個體選擇性別：年齡：急性、慢性以體重估計：組內(nèi)、組間差異生理狀態(tài)：雌--未產(chǎn)未孕，避免妊娠、激素影響健康狀況：健康動物健康動物辨認(rèn)：健康動物辨認(rèn)：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動迅速、反應(yīng)靈活，食欲及營養(yǎng)狀況良好。(1)眼：明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無分泌物。(2)耳，耳道無分泌物溢出，耳殼無膿瘡。(3)鼻：無噴嚏，無漿性粘液分泌物。(4)皮膚：無創(chuàng)傷、無膿瘡、疥癬、濕疹。(5)頸部：要求頸項端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不應(yīng)選作實驗動物。(6)消化道：無嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門附近被毛潔凈。(7)神經(jīng)系統(tǒng)：無震顫、麻痹。若動物(大鼠、小鼠)出現(xiàn)圓圈動作或提尾倒置呈圓圈擺應(yīng)放棄該動物。(8)四肢及尾：四肢、趾及尾無紅腫及潰瘍。（二）動物性別鑒定(1)大鼠、小鼠：主要依肛門與生殖孔間的距離區(qū)分，間距大者為雄性，小者為雌性。成年雄鼠臥位可見到辜丸，雌性在腹部可見乳頭。(2)豚鼠；用一只于抓住豚鼠頸部，另一只手扒開靠生殖器孔的皮膚，雄性動物在圓孔中露出性器官的突起，雌性動物則顯示三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個乳頭。(2)大鼠：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中。（四）實驗動物稱重、編號、標(biāo)記染色法：苦味酸、品紅耳緣孔口標(biāo)記：項圈（五）動物隨機分組：隨機數(shù)字表經(jīng)呼吸道染毒靜式吸入動式吸入氣管內(nèi)注入經(jīng)皮膚染毒斑貼法（家兔）被毛的去除：剪毛、拔毛、脫毛浸尾法（大、小鼠）注射染毒：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、皮內(nèi)注射（七）生物標(biāo)本采集1.血液采集：大、小鼠鼠尾采血法眼眶靜脈叢采血法腹主動脈或股動(靜)脈采血法斷頭采血法家兔耳緣靜脈采血法心臟采血法實驗動物安全采血量動物品種最大安全采血量(ml)最小致死采血量(ml)小鼠0.10.3大鼠1.02.0豚鼠5.010.0家兔10.040.02.尿液、糞便收集：代謝籠（八）動物處死脊椎脫臼法斷頭法急性大失血法擊打法麻醉致死法麻醉后急性放血法空氣栓塞法化學(xué)藥物致死法開放性氣胸法實驗二

急性經(jīng)口毒性試驗一、目的掌握LD50計算方法和急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)熟悉經(jīng)口灌胃技術(shù)了解急性毒性試驗的設(shè)計原則LD50計算方法改良寇氏法：計算簡便，準(zhǔn)確率高，常用霍恩法序貫法Bliss法改良寇氏法要求每組動物數(shù)相等各劑量組組距呈等比級數(shù)死亡呈正態(tài)分布最低劑量組死亡<20%最高劑量組死亡>80%死亡不倒置三、材料與試劑動物：昆明種小白鼠器材：試劑：敵敵畏，苦味酸四、步驟動物選擇劑量設(shè)計：5-8個劑量（一般不設(shè)對照組）最高、高、中、低、最低5個劑量,中劑量組：100mg/kg，組距1.4動物稱重、編號、標(biāo)記受試物配制灌胃：1ml/100g體重觀察：急性毒性試驗原始記錄計算公式m=Xk-i(∑p-0.5)m：lgLD50i:相鄰兩劑量組對數(shù)值的差Xk：最大劑量的對數(shù)值P：死亡率q:存活率n：每組動物數(shù)∑p=各劑量組死亡率總和五、評價：毒性分級、毒性特征六、討論：實驗二

皮膚刺激性/腐蝕性試驗（豚鼠）試驗?zāi)康拇_定化學(xué)物對哺乳動物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度，為制定防護(hù)化學(xué)物對皮膚的刺激保護(hù)措施提供依據(jù)。皮膚刺激性(DermalIrritation)：皮膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。皮膚腐蝕性(DermalCorrosion)：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。試驗的基本原則將受試物一次(或多次)涂敷于受試動物的皮膚上，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察動物皮膚局部刺激作用的程度并進(jìn)行評分。采用自身對照，以評價受試物對皮膚的刺激作用。急性皮膚刺激性試驗觀察期限應(yīng)足以評價該作用的可逆性或不可逆性。強酸或強堿物質(zhì)如pH≤2或pH≥11.5，由于可預(yù)見其腐蝕特性，不必做本試驗；若已知受試樣品有很強的經(jīng)皮吸收毒性（LD50≤200mg/kgbw）的物質(zhì)不必進(jìn)行本試驗；試驗方法1、受試樣品液態(tài)受試樣品采用原液或人類實際應(yīng)用濃度固體受試樣品經(jīng)研磨，過100目篩后用水或適當(dāng)?shù)馁x形劑（如凡士林、阿拉伯樹膠、乙醇和水、羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙三醇、植物油和礦物油等）按一定比例調(diào)制，以保證與皮膚充分接觸。2、實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。至少需要4只健康成年動物（雄性和/或雌性均可）。每只動物相鄰的未處理的皮膚可作為對照。每只單籠飼養(yǎng)，試驗前動物要在實驗室中適應(yīng)3d。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水3、劑量設(shè)計受試樣品0.5ml(g)，均勻涂布于受試部位。如受試樣品難以獲得，或易產(chǎn)生全身毒性等原因，用量可適當(dāng)減少。但為了試驗的一致性，測試面積應(yīng)力求相等。4、試驗步驟1）試驗前準(zhǔn)備試驗前24h，將實驗動物脊柱兩側(cè)毛剪去或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各3cm×3cm。24h后，選擇皮膚健康完整無損的動物進(jìn)行試驗。不應(yīng)在長有濃密島狀毛的部位進(jìn)行受試樣品試驗。2）染毒受試樣品0.5ml(g)直接涂布在皮膚上，用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對照。采用封閉試驗，敷用時間為4h。對化妝品產(chǎn)品而言，可根據(jù)人的實際使用和產(chǎn)品類型，延長或縮短敷用時間。對用后沖洗的化妝品產(chǎn)品，僅采用2h敷用試驗。試驗結(jié)束后用溫水或無刺激性溶劑清除殘留受試物。如懷疑受試樣品可能引起嚴(yán)重刺激或腐蝕作用，可采用分段試驗，將三個涂布受試樣品的紗布塊同時或先后敷貼于一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min、60min和4h取下一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時間點出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗。3）觀察期限觀察時間的確定應(yīng)足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過程，一般不超過14d。于清除受試樣品后的1、24、48、72h分別觀察給予受試樣品部位的皮膚反應(yīng)，按表1進(jìn)行皮膚反應(yīng)評分，以受試動物積分的平均值進(jìn)行綜合評價，根據(jù)24、48和72h各觀察時點最高積分均值，按表2判定皮膚刺激強度。5、試驗報告試驗報告應(yīng)以表格形式總結(jié)，包括如下內(nèi)容：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量。必要時說明pH值實驗動物種屬、品系、性別、體重和來源(合格證號和級別)實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境：飼料來源、室溫、相對濕度、動物房合格證號每個動物在每一觀察時點的皮膚刺激反應(yīng)積分具體描述除刺激性以外的其它毒性作用結(jié)論8試驗結(jié)果的解釋急性皮膚刺激試驗結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔和豚鼠在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。若用其它品系動物進(jìn)行試驗時也得到類似結(jié)果，則會增加從動物外推到人的可靠性。試驗中使用封閉式接觸是一種超常的實驗室條件下的試驗，在人類實際接觸化學(xué)品過程中很少存在這種接觸方式。附：多次皮膚刺激性試驗步驟1試驗前將實驗動物背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去毛范圍各為2cm×3cm，涂抹面積2.5cm×2.5cm。2取受試物約0.5mL(g)涂抹在一側(cè)皮膚上，當(dāng)受試物使用無刺激性溶劑配制時，另一側(cè)涂溶劑作為對照，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14d。從第二天開始，每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水或無刺激性溶劑清除殘留受試物。一小時后觀察結(jié)果，按表1評分，對照區(qū)和試驗區(qū)同樣處理。結(jié)果評價：按下列公式計算每天每只動物平均積分，以表2判定皮膚刺激強度。DDV：LD50：50～80mg/kg(大鼠經(jīng)口)；75-107，113mg/kg(大鼠經(jīng)皮)；LC50：15mg/(大鼠吸入，4h)二甲苯：LD50：5000mg/kg（大鼠經(jīng)口）；LC50：1947mg/m3（大鼠吸入）;輕微粘膜刺激。引起皮膚發(fā)紅。家兔經(jīng)皮：500mg/24h，中度刺激甲醛：急性毒性：LD50800mg/kg（大鼠經(jīng)口），2700mg/kg（兔經(jīng)皮）；LC50590mg/m3（大鼠吸入）；人吸入60～120mg/m3，發(fā)生支氣管炎、肺部嚴(yán)重?fù)p害；人吸入12～24mg/m3，，鼻、咽粘膜嚴(yán)重灼務(wù)、流淚、咳嗽；人經(jīng)口10～20ml，致死。實驗三

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗一、目的：掌握小鼠骨髓PCE微核測定方法二、原理染色體斷裂染色體完整性紡錘絲受影響染色體分離改變有核細(xì)胞：難與核的分葉鑒別紅細(xì)胞：最后一次分裂后將主核排出（PCE）PCE24小時NCE（大多微核排出）三、材料、試劑試劑：受試物、陽性物、小牛血清、染液等動物器材四、步驟動物選擇：雌雄各半劑量選擇：陰性、陽性對照，3-5個劑量組高、中、低劑量組：

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