脊髓損傷后微管穩(wěn)課件

脊髓損傷后微管穩(wěn)定減少瘢痕并引起軸突再生

MicrotubuleStabilizationReducesScarringandCausesAxonRegenerationAfterSpinalCordInjuryFaridaHellal,AndresHurtado,J?rgRuschel,KevinC.Flynn,ClaudiaJ.Laskowski,MartinaUmlauf,LukasC.Kapitein,DinaraStrikis,VanceLemmon,JohnBixby,CasperC.Hoogenraad,FrankBradkeAxonalGrowthandRegenerationGroup,MaxPlanckInstituteofNeurobiology,Germany.InternationalCenterforSpinalCordInjury,HugoW.MoserResearchInstituteatKennedyKrieger,DepartmentofNeurology,JohnsHopkinsUniversity,USA.DepartmentofNeuroscience,ErasmusMedicalCenter,Netherlands.CellBiology,FacultyofScience,UtrechtUniversity,Netherlands.TheMiamiProjecttoCureParalysis,UniversityofMiamiMillerSchoolofMedicine,USA.Science，18February2011概述肥厚性瘢痕和軸突實(shí)際生長(zhǎng)潛能缺乏是脊髓損傷修復(fù)的主要障礙，這些過(guò)程被微管動(dòng)力學(xué)密切調(diào)節(jié)。本文證實(shí)：中等程度的微管穩(wěn)定能通過(guò)多種細(xì)胞內(nèi)機(jī)制減少嚙齒類動(dòng)物脊髓損傷后瘢痕的形成，其中包括抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)通路。它防止硫酸軟骨素蛋白積累并使得損傷部位能夠進(jìn)行g(shù)rowth-competent感覺(jué)神經(jīng)元軸突再生。因而，微管穩(wěn)定減少纖維變性瘢痕形成并增強(qiáng)軸突生長(zhǎng)能力。概述微管動(dòng)力學(xué)在瘢痕形成過(guò)程中起主要調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞增殖、遷移、分化、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞外基質(zhì)分子的分泌。另外，中等微管穩(wěn)定防止中樞神經(jīng)損傷后軸突回縮、軸突尖端腫脹，刺激培養(yǎng)神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)，使他們能克服中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂的生長(zhǎng)抑制作用。我們假定：用Taxol（紫杉醇，批準(zhǔn)的藥物）維持中等微管穩(wěn)定，能通過(guò)減少瘢痕形成和增強(qiáng)內(nèi)在軸突生長(zhǎng)促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生。脊髓損傷后Taxol治療能否減少瘢痕形成？成年大鼠在脊髓胸8節(jié)段背側(cè)半側(cè)切除；紫杉醇對(duì)損傷部位持續(xù)性給藥（髓鞘內(nèi)導(dǎo)管連接到滲透微型泵）。損傷后7天，治療組動(dòng)物損傷部位用纖維化瘢痕（軸突再生的主要障礙）標(biāo)記物進(jìn)行層黏蛋白、纖維連結(jié)蛋白、膠原蛋白IV標(biāo)記(Fig.1,AandB,andfig.S1)。Fig.1TaxoldecreasesscarringinducedbyspinalcordinjuryTaxol降低了脊髓損傷誘導(dǎo)的瘢痕。(A)表示損傷脊髓。(BandC)損傷7天后，大鼠損傷部位中央矢狀切片，空白治療(B)或Taxol治療(C)。(D)Taxol明顯減少了纖維化瘢痕（以占空白對(duì)照的比例表達(dá)）并不影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞密度（損傷28天后）(E)或損傷大小(F)GFAP,glialfibrillaryacidicprotein神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白300μmFigureS1:Taxoldecreasesfibronectin,NG2proteoglycanandcollagenIVaccumulationinducedbyspinalcordinjury紫杉醇減少了脊髓損傷后誘發(fā)的纖連蛋白、NG2蛋白多糖和膠原蛋白IV的聚集。(A)表示脊髓損傷(B-D)損傷后7天，空白治療或紫杉醇治療后的大鼠損傷部位。紫杉醇減少了損傷部位細(xì)胞外基質(zhì)的聚集。通過(guò)fibronectin(B),collagenIV(C)andNG2proteoglycan(D)免疫染色評(píng)價(jià)虛線表示損傷邊緣150μmFigureS3:Taxoldoesnotinduceapoptosisintheinjuredspinalcord紫杉醇并不會(huì)在脊髓損傷后誘發(fā)凋亡(A)表示脊髓損傷部位(B-C)背側(cè)半切損傷3天和7天后，空白或紫杉醇治療小鼠損傷部位TUNEL染色。(TUNEL,terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddeoxyuridinetriphosphatenickendlabeling，脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法)

(D)紫杉醇并不影響脊髓損傷后誘發(fā)的細(xì)胞死亡。150μm穩(wěn)定微管網(wǎng)能否阻礙TGF-β信號(hào)

從而減弱纖維形成？中樞神經(jīng)損傷后纖維化瘢痕中最重要的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)的激活。脊髓損傷后，TGF-β（有利于纖維化）表達(dá)明顯上升，而微管網(wǎng)的完整性是該信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。Smad2,（TGF-β通路的下游效應(yīng)物）通過(guò)傳統(tǒng)的驅(qū)動(dòng)蛋白-1與微管相連。FigureS4:TaxolsequestersSmad2ontomicrotubules紫杉醇隔離Smad2固定到微管上TGF-?1(2ng/ml)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后，用DMSO（二甲亞砜）orTaxol紫杉醇(100nM)治療30分鐘。細(xì)胞進(jìn)行滲透化處理，固定提取細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)時(shí)并用Smad2/3抗體染色。紫杉醇誘導(dǎo)了Smad2/3共聚集到微管上。10μm(GandH)在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，Taxol中和了TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3核轉(zhuǎn)運(yùn)（箭的頭）引起細(xì)胞質(zhì)Smad2/3聚集（箭頭）(I)損傷7天后，Taxol治療干擾了SCI誘導(dǎo)的磷酸化Smad2/3核轉(zhuǎn)運(yùn).BSA,bovineserumalbumin;DAPI,4′,6′-diamidino-2-phenylindole;DMSO,dimethylsulfoxide二甲基亞砜20μm穩(wěn)定微管網(wǎng)能否阻礙TGF-β信號(hào)

從而減弱纖維形成？因而，低劑量的Taxol通過(guò)干擾Smad依賴的TGF-β信號(hào)、減少細(xì)胞外基質(zhì)分泌和細(xì)胞遷移阻止了SCI后纖維化瘢痕形成。Taxol是否在SCI后降低CSPGs？TGF-β信號(hào)也調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)抑制劑硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)。Taxol減少了體外、體內(nèi)腦膜細(xì)胞遷移和粘多糖釋放。(A)Taxol減少了腦膜細(xì)胞TGF-β誘導(dǎo)的纖連蛋白沉淀。(BandC)體外三天，Taxol減少了TGF-β誘導(dǎo)的腦膜細(xì)胞遷移(1and10nM)。箭頭表示初始間隙大小。Actin肌動(dòng)蛋白300μm300μmFigureS5:Taxolpromotesaxonaloutgrowthofprimaryneuronsplatedoninhibitorysubstrates紫杉醇促進(jìn)抑制性底物上初級(jí)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)(A)小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)分別放在層粘連蛋白laminin或硫酸軟骨素糖蛋白CSPGs上(B)紫杉醇增加了laminin和CSPGs上的CGNs突起的生長(zhǎng)。(C)紫杉醇增加了在以下底物上初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)：MAG(myelinassociatedglycoprotein，髓鞘相關(guān)糖蛋白),NogoA,Semaphorin3A（神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元遷移軸突延伸抑制物）orCSPGsTaxol治療損傷部位能否允許在體軸突再生?損傷部位給予Taxol4周；中心損傷后2周(半側(cè)切除)，我們通過(guò)橫斷右側(cè)坐骨神經(jīng)限制腰L4-6DRG神經(jīng)元。觀察背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元的再生反應(yīng)(C)損傷4周后，脊髓矢狀面5-HT抗體染色。Taxol治療后，尾端脊髓富集了5-羥色胺能纖維(C,箭頭).(DandE)背側(cè)半側(cè)切除、挫傷后，每組大鼠尾部到損傷處的5-HT陽(yáng)性纖維計(jì)數(shù)。(F)Taxol治療隨時(shí)間提高了運(yùn)動(dòng)情況.75μmFigureS6:Taxolpromotesformationofgrowthcone-likestructuresatthetipofthe5HT-positiveaxons紫杉醇促進(jìn)5HT-陽(yáng)性軸突尖端生長(zhǎng)錐樣結(jié)構(gòu)的形成損傷后空白或紫杉醇治療4周，5HT陽(yáng)性軸突尖端10μm討論目前引出損傷的脊髓軸突再生的嘗試受到眾多中樞神經(jīng)系統(tǒng)鞘磷脂、瘢痕組織的外源性生長(zhǎng)抑制因子以及它們的不同信號(hào)通路干擾。然而與這些嘗試主要關(guān)注單個(gè)抑制因子的干擾相不同，我們以細(xì)胞骨架（多個(gè)生長(zhǎng)抑制信號(hào)通路匯聚其上）為靶點(diǎn)。另外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突內(nèi)微管分解，而難以為軸突向外生長(zhǎng)提供必要的外向生長(zhǎng)壓力。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)中等微管穩(wěn)定性抵消了多個(gè)阻止軸突再生的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程。因此，Taxol有為SCI提供多靶點(diǎn)治療的潛能。Thanks！TGF-β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β)是屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的TGF-β超家族。促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）如膠原蛋白、纖粘連蛋白的表達(dá)和抑制ECM的降解，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過(guò)程起著重要作用，有利于胚胎發(fā)育和細(xì)胞修復(fù)。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，局部注射TGF-β可以促進(jìn)傷口愈合和典型肉芽組織形成。TaxoldampensTGF-bsignaling(EandF)Taxol改變了微管基礎(chǔ)的物質(zhì)運(yùn)輸。(E)在加入Rapalog下，紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記過(guò)氧化物酶綁定到驅(qū)動(dòng)蛋白-1（KIF5）運(yùn)動(dòng)區(qū)域的疊加的顏色時(shí)間序列。藍(lán)色標(biāo)記最初分布；紅色階梯表示隨時(shí)間分布。(F)封閉90%全部熒光強(qiáng)度KIF5或動(dòng)力蛋白適配器結(jié)合的過(guò)氧化物酶體的時(shí)間痕跡。10μmTaxol抑制TGF-β信號(hào)。(A)Taxol治療增加了損傷位置的全部微管蛋白并減少了酪氨酸微管蛋白。(B)治療損傷區(qū)微管部分的驅(qū)動(dòng)蛋白-1(C)腦和脊髓提取的His-Smad2bindsto驅(qū)動(dòng)蛋白-1。(D)內(nèi)源性Smad2與驅(qū)動(dòng)蛋白-1免疫共沉淀。CTB霍亂毒素B亞單位逆行性標(biāo)記可和神經(jīng)元胞體或突起膜上的特異性受點(diǎn)結(jié)合,進(jìn)而經(jīng)受體介導(dǎo)性內(nèi)吞作用入胞,受體-配體復(fù)合物可逆行從軸突終末轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體及樹(shù)突或順行從胞體至軸突終末。AAV簡(jiǎn)介腺相關(guān)病毒載體是利用天然存在的腺相關(guān)病毒某些特性經(jīng)過(guò)基因工程改造后產(chǎn)生的一種可供人工轉(zhuǎn)基因的載體。腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus，AAV）是簡(jiǎn)單的非致病性單鏈DNA病毒，需要輔助病毒參與生活周期，輔助病毒通常為腺病毒（Ad）或者單純皰疹病毒（HSV）?；蚪M兩端為末端反向重復(fù)序列（ITR），中間基因組編碼兩個(gè)蛋白：Cap和Rep。ITRs對(duì)于病毒的復(fù)制和包裝具有決定性作用。Cap蛋白為病毒衣殼蛋白，Rep蛋白參與病毒的復(fù)制和整合。AAV能感染多種細(xì)胞。Rep蛋白存在時(shí)，病毒基因組很容易整合到人類第19號(hào)染色體的特異位點(diǎn)：AAVS1位點(diǎn)。這是已知的唯一能夠定點(diǎn)整合的哺乳動(dòng)物DNA病毒。

AAV簡(jiǎn)介重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣（分裂和非分裂細(xì)胞）、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應(yīng)用。AAV選擇的條件1.治療基因的長(zhǎng)度不能過(guò)大。AAV的總?cè)萘?.7kb，還要包括AAV自身的ITR，啟動(dòng)區(qū)和RNA加尾信號(hào)；2.基因需要持續(xù)表達(dá)，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3.長(zhǎng)期表達(dá)目的基因，沒(méi)毒副作用；4.不需要目的基因立刻表達(dá)；5.不需要基因高水平表達(dá)；6.AAV載體對(duì)靶細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。AAV病毒的感染細(xì)胞

AAV載體對(duì)于骨骼肌、視網(wǎng)膜、肝細(xì)胞、心臟平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胰島B細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞等具有良好的感染效果，而對(duì)于淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等感染效果較差RNA原位雜