應(yīng)用微生物學(xué)1課件

應(yīng)用微生物學(xué)AppliedMicrobiology應(yīng)用微生物學(xué)概論微生物的生長微生物的代謝微生物的遺傳與遺傳育種微生物基因工程微生物的基因操作系統(tǒng)微生物酶工程微生物發(fā)酵工程微生物代謝工程概論

基本概念應(yīng)用微生物學(xué)的發(fā)展微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)重要的應(yīng)用微生物微生物的特點(diǎn)資源量大（多樣性豐富）生物量大（生長迅速）可塑性大（便于操作）個(gè)體?。ū阌谶\(yùn)輸、攜帶）完成自然界的物質(zhì)循環(huán)造福人類引起災(zāi)難當(dāng)前人類面臨的問題資源的壓力環(huán)境的挑戰(zhàn)傳染病的新生與復(fù)發(fā)微生物的應(yīng)用部分細(xì)胞基因基因產(chǎn)物（酶、蛋白質(zhì)）代謝產(chǎn)物應(yīng)用微生物學(xué)需解決的問題微生物菌種的獲得和優(yōu)化微生物培養(yǎng)條件的建立和優(yōu)化微生物的應(yīng)用應(yīng)用微生物學(xué)的發(fā)展

微生物學(xué)的發(fā)展是與應(yīng)用緊密聯(lián)系的逐步建立方法認(rèn)識微生物

Leenwenhock(1673)

顯微鏡

Jenner(1798)牛痘

Basteur(1860s)發(fā)酵、低溫滅菌、自然發(fā)生

Koch

(1881)

純培養(yǎng)微生物形成產(chǎn)業(yè)

Fleming(1929)青霉素

Waksman(1944)

鏈霉素現(xiàn)代生物技術(shù)

Cohen(1972)DNA重組重要的應(yīng)用微生物病毒：?-噬菌體細(xì)菌：大腸桿菌(E.coli)

棒桿菌(Corynebacterium)放線菌：鏈霉菌(Streptomyces)酵母菌：釀酒酵母(Saccharomycescerevisia)真菌：曲霉(Aspergillus)微生物細(xì)胞的化學(xué)組成細(xì)胞中幾種主要元素的含量(干重的百分?jǐn)?shù))

細(xì)胞干物質(zhì)中主要組分和含量(%)

元素細(xì)菌酵母菌霉菌C50~5345~5040~63N12~157.5~12.47~10O~20~30~40H~8~7~7細(xì)菌酵母菌霉菌蛋白質(zhì)50~8032~7520~40碳水化合物12~2827~637~10脂類5~202~154~40核酸10~206~81灰分物質(zhì)2~107~105~10微生物生長的條件—物質(zhì)條件水

aw=Pw/Pw0

微生物類群最低aw值細(xì)菌0.91酵母菌0.88霉菌0.80耐干霉菌0.65耐高滲酵母菌0.60溶液aw30%葡萄糖0.961%葡萄糖+40%蔗糖0.96飽和蔗糖0.76飽和NaCl0.78微生物生長的條件—物質(zhì)條件碳源和氮源OHPSKCaMgFeMnCuZnMoCoNiVBClNaSi維生素、氨基酸等微生物的營養(yǎng)類型光能無機(jī)營養(yǎng)型（光能自養(yǎng)型Photolithoautotrophy）光能有機(jī)營養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型Photoorganoheterotrophy）化能無機(jī)營養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型Chemolithoautotrophy）化能有機(jī)營養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型Chemoorganoheterotrophy）微生物生長的條件—環(huán)境條件pH中性（弱酸、堿）、嗜酸、嗜堿溫度最適、生長、耐受氧氣嚴(yán)格（專性）好氧、兼性、耐氧厭氧、嚴(yán)格厭氧壓力滲透壓極端環(huán)境微生物(extremophile)

培養(yǎng)基

提供微生物生長所需物質(zhì)與環(huán)境條件的體系

培養(yǎng)基的組成要素碳源、氮源、提供各種元素的無機(jī)鹽生長因子或含生長因子的物質(zhì)水、固化基（固體培養(yǎng)基）pH、滲透壓（糖、鹽濃度）、滅菌條件培養(yǎng)基的選擇和設(shè)計(jì)原則適用：利于達(dá)到目的利于下游工藝重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)：原料價(jià)格原料用量全工藝綜合平衡安全：環(huán)境影響生物安全培養(yǎng)基的選擇和設(shè)計(jì)是應(yīng)用微生物學(xué)研究的重要內(nèi)容生長動(dòng)力學(xué)增值曲線（Multiplicationcurve）：細(xì)胞數(shù)-時(shí)間生長曲線（growthcurve）：細(xì)胞量-時(shí)間微生物生長的數(shù)學(xué)描述

比生長速度(specificgrowthrate)

=dx/xdt

細(xì)菌0.6-1.2

酵母菌0.3-0.5

放線菌0.1-0.3

真菌0.1-0.3

生物量倍增時(shí)間(biomassdoublingtime)

td=ln2/

增值度(multiplicationdegree)x/xo第二章

微生物的代謝微生物初級代謝微生物次級代謝代謝調(diào)節(jié)

微生物的代謝

微生物細(xì)胞所進(jìn)行的生化反應(yīng)的總和物質(zhì)代謝細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞與環(huán)境間的物質(zhì)轉(zhuǎn)換的過程能量代謝載體信息代謝重要的初級代謝途徑糖酵解途徑糖代謝的共同分解途徑三羧酸循環(huán)將糖最終氧化為二氧化碳和水，并產(chǎn)生大量能量磷酸戊糖途徑產(chǎn)生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多種中間產(chǎn)物ED途徑細(xì)菌代謝葡萄糖產(chǎn)生乙醇的途徑氨基酸合成途徑糖酵解途徑(Embden-Meyerhofpathway)GLC

↓

HXK

ZWFSOLGND←G6P→G15L→P6G→RU5P

↓PGIF6P

PFK↓↑FBP

F16P

↙↘

FBA

GLY←G3P←DHAP→GAP↓TPI

↓

TDHP13G

↓

PGK

←3PG

↓GPM2PG

↓

ENOPEP→↓PYK

PDCADH←PYR→ACA→ETH

葡萄糖經(jīng)酶的催化降解成丙酮酸并伴有ATP生成的過程。在動(dòng)物、植物、微生物細(xì)胞中，這一過程是分解葡萄糖產(chǎn)生能量的共同代謝途徑?！人嵫h(huán)(Krebscycle)PYR→ACoA

MDH↓CIT

MAL

→

OAA→CTT

FUM↑↓↓ACO

FUM

ICI

SDH↓↑OSM↓IDP

SUC

←

SUCC←AKG→LSCKGD

丙酮酸進(jìn)一步氧化脫羧形成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A再經(jīng)過氧化、脫羧，最終產(chǎn)物為二氧化碳和水，并伴有大量能量產(chǎn)生的一系列反應(yīng)過程。

磷酸戊糖途徑氧化（產(chǎn)生NADPH

）

RU5PP6GG15LG6PRKI↙↘RPE非氧化

R5PX5P（分子重排）

TKLTKL

GAP

S7P

E4PTKL

F6PED途徑

存在于某些缺乏完整EMP途徑的微生物中，是微生物特有的,將2-酮-3脫氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解為丙酮酸和3-磷酸甘油醛。

氨基酸合成途徑GLC→3PG→Ser,Gly,Met（3－磷酸甘油酸衍生型）

PPP↓↓R5PPEP→Phe,Try,Trp（芳香族氨基酸）

↓↓

HisPRY→Ala,

Val,Leu（丙酮酸衍生型）

↓

OAA→Asp→ASA→Lys（草酰乙酸衍生型）

↓↓

TCAAsnHS→Thr↓↓AKGMetIle↓Arg←Glu

→Gln（α－酮戊二酸衍生型）

↓

Pro微生物次級代謝

次級代謝是相對于初級代謝的概念，指微生物在一定的生長時(shí)期（一般為穩(wěn)定期）以初級代謝物為前體、合成對微生物生命活動(dòng)沒有明確功能的物質(zhì)的過程。次級代謝（前體聚合、

初級代謝結(jié)構(gòu)修飾、裝配）營養(yǎng)物前體次級代謝物（初級代謝物）次級代謝的生物學(xué)意義

次級代謝的生理意義目前尚無定論，但它肯定對微生物是有意義的，否則這種需要多種酶類協(xié)同參與、并在精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制控制之下的代謝過程是不會(huì)在生物體內(nèi)保存下來的。維持初級代謝的平衡次級代謝產(chǎn)物作為儲藏物質(zhì)的一種形式使菌體在生存競爭中占優(yōu)勢與細(xì)胞分化有關(guān)青霉素

SCH3R-CO-NH-HC—CHC∣B∣A∣CH3OCNCH

∣COOH側(cè)鏈：R-CO-母核：噻唑環(huán)A，β-內(nèi)酰胺環(huán)B幾種青霉素的側(cè)鏈和抗生素效價(jià)比較

青霉素側(cè)鏈R基在試管內(nèi)的抗生素效價(jià)(U/mg)金黃色葡萄球菌枯草桿菌(G)苯甲基青霉素C6H3-CH2-16671667(X)對羥基苯甲基青霉素HO-C6H3-CH2-9001500(F)戊烯基青霉素CH3CH2CH=CHCH3-1500970(FH2)n-戊基青霉素CH3CH2CH2CH2CH2-1670660(K)n-庚基青霉素CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2-2300700青霉素的生物合成代謝調(diào)節(jié)

細(xì)胞為維持正常的生理功能，它的組分、代謝物、能量和電子載體的合成大體上應(yīng)保持恒定。當(dāng)環(huán)境或細(xì)胞自身發(fā)生某種變化時(shí)，可以通過一定的反饋?zhàn)饔脕磉_(dá)到平衡生長，這種反饋?zhàn)饔眉创x調(diào)節(jié)。代謝調(diào)節(jié)與育種

研究微生物的代謝規(guī)律和調(diào)控機(jī)制，除了有理論意義，更重要的是能有目的地改造微生物使它能最大限度地生產(chǎn)人類所需的代謝產(chǎn)品，并為此提供最適合的環(huán)境條件，從而發(fā)展生產(chǎn)，造福人類。從某種意義上講，越是理想的高產(chǎn)菌株，就越偏離它在自然進(jìn)化中建立起來的調(diào)控機(jī)制。許多遺傳育種工作就是為獲得目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成不受或少受代謝調(diào)控的“不正常”菌株。代謝調(diào)節(jié)的位點(diǎn)DNA↓③RNA↓

酶底物①底物

產(chǎn)物（營養(yǎng)物）（或中間物）②①底物進(jìn)入，②酶的活性，③酶的合成代謝調(diào)節(jié)的本質(zhì)：酶的調(diào)節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)：誘導(dǎo)與阻遏—基因水平酶活性的調(diào)節(jié)：反饋抑制—蛋白質(zhì)水平適應(yīng)現(xiàn)象例1，大腸桿菌乳糖代謝：

β–半乳糖苷酶乳糖→半乳糖+葡萄糖

E.coli生長于無乳糖培養(yǎng)基，β–半乳糖苷酶：3分子/細(xì)胞

E.coli生長于含乳糖培養(yǎng)基，β–半乳糖苷酶：3000-5000分子/細(xì)胞例2，大腸桿菌色氨酸代謝：

E.coli生長于無色氨酸培養(yǎng)基，合成色氨酸合成酶，當(dāng)色氨酸濃度增加時(shí)，色氨酸合成酶濃度下降。

細(xì)胞需要某種酶時(shí)才合成，反映出細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)機(jī)理。這種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)可誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生與輔抑物抑制可阻遏酶的產(chǎn)生的現(xiàn)象稱適應(yīng)現(xiàn)象。乳糖：誘導(dǎo)物(inducer)

色氨酸：輔抑物(corepressor)底物與誘導(dǎo)物底物不等于誘導(dǎo)物對β–半乳糖苷酶乳糖IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）苯基半乳糖苷苯基硫代半乳糖苷作底物+-+-作誘導(dǎo)物++--乳糖操縱子iPOZYA調(diào)節(jié)基因i：編碼阻遏蛋白啟動(dòng)子P：有CAP(CAP與cAMP復(fù)合物)和RNA聚合酶兩個(gè)位點(diǎn)操縱基因O：阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)基因LacZ：β–半乳糖苷酶

LacY：β–半乳糖苷透性酶

LacA：β–半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶

協(xié)同誘導(dǎo)和順序誘導(dǎo)協(xié)同誘導(dǎo)

I→a、b、cabc順序誘導(dǎo)

A→B→C→DI→aB→bC→c操縱子(operon)IPOS1S2S3

調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因↓變構(gòu)↑

(+or-)外界信號→調(diào)節(jié)蛋白IorCoR

操縱子：一組功能相關(guān)的基因共同組成的轉(zhuǎn)錄單位，它們結(jié)構(gòu)上緊密聯(lián)系、功能上協(xié)同表達(dá)，接受同一調(diào)控序列的調(diào)控。誘導(dǎo)與阻遏

調(diào)節(jié)

調(diào)節(jié)蛋白活性操縱子結(jié)構(gòu)基因酶合成誘導(dǎo)正↑打開表達(dá)↑誘導(dǎo)負(fù)↓打開表達(dá)↑阻遏正↓關(guān)閉不表達(dá)↓阻遏負(fù)↑關(guān)閉不表達(dá)↓反饋抑制反饋抑制：在合成代謝途徑中，代謝終產(chǎn)物抑制途徑中第一個(gè)酶的作用。

E1E2E3E4ABCDE反饋抑制能對環(huán)境變化做出快速反應(yīng)特點(diǎn)：

1，只有終產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物有反饋抑制

2，受抑制的是途徑中的第一個(gè)酶

3，反饋抑制是可逆的別構(gòu)酶(allostericenzyme)有多亞基和四級結(jié)構(gòu)有結(jié)合底物的活性中心和結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心活性中心和別構(gòu)中心在酶分子的不同部位分支生物合成途徑的調(diào)節(jié)P1ABCP2協(xié)同反饋抑制同功酶反饋抑制累積反饋抑制順序反饋抑制（細(xì)調(diào)）協(xié)同反饋抑制P1ABCP2

合成代謝途徑中的第一個(gè)酶有幾個(gè)變構(gòu)中心，分別可與不同終產(chǎn)物結(jié)合，每一種終產(chǎn)物對第一個(gè)酶都沒有反饋抑制作用，只有當(dāng)幾種終產(chǎn)物同時(shí)過量時(shí)才有反饋抑制作用。同功酶反饋抑制P1ABCP2

合成代謝途徑中的第一個(gè)酶有幾種結(jié)構(gòu)略有不同的同功酶，每一種終產(chǎn)物只對一種同功酶有反饋抑制作用，只有當(dāng)幾種終產(chǎn)物同時(shí)過量時(shí)，才使幾種同功酶同時(shí)被作用而抑制合成反應(yīng)。積累反饋抑制P1ABCP2

每一種終產(chǎn)物對第一個(gè)酶都有一定的反饋抑制作用，他們合在一起達(dá)到最大程度的反饋抑制。順序反饋抑制P1ABCP2

合成代謝途徑中的第一個(gè)酶的效應(yīng)物不直接是終產(chǎn)物而是代謝分支點(diǎn)的中間物，每一種終產(chǎn)物抑制分支后的第一個(gè)酶，使分支點(diǎn)的中間物積累，然后抑制合成代謝途徑的第一個(gè)酶。這一調(diào)節(jié)作用可根據(jù)不同終產(chǎn)物的量分別調(diào)節(jié)，是一種細(xì)調(diào)。在許多分支代謝的調(diào)節(jié)中，細(xì)調(diào)與粗調(diào)往往同時(shí)發(fā)生。第三章

微生物的遺傳與菌種選育微生物的遺傳物質(zhì)基因突變基因重組遺傳育種

微生物的遺傳物質(zhì)核酸(DNARNA)染色體染色體外遺傳物質(zhì)DNA是遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)證明肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化

△

SⅢ→dead，SⅢ→alive，RⅡ→alive

SⅢ△dead→SⅢ→SⅢRⅡ噬菌體感染

T2(DNA-32P,protein-35S)→E.coli→上清T2（35S）↓沉淀E.coli（

32P

）雙螺旋模型遺傳育種基本過程

基因突變、重組、導(dǎo)入、敲除…

篩選

出發(fā)菌株→包含變異株的群體→優(yōu)良變異株→目的株↑↓檢驗(yàn)↑↓檢驗(yàn)產(chǎn)生變異株選擇變異株檢驗(yàn)變異株基因突變大的突變，如染色體的畸變，染色體的數(shù)目與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、斷裂、大片段缺失、移位等，可影響到很多基因的功能。這類突變對細(xì)胞的損傷很大，往往導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

小的突變，只涉及DNA分子中一個(gè)或少數(shù)堿基的改變，又稱為點(diǎn)突變。點(diǎn)突變發(fā)生較多，存活的突變體也較多，因此有時(shí)基因突變就專指點(diǎn)突變。

基因突變的類型基因型置換：GA,CT轉(zhuǎn)換(transition)；G,A

C,T顛換(transversion)

移碼(frameshift)：DNA分子中一對或幾對核苷酸的增加或缺失表型

形態(tài)：造成形態(tài)發(fā)生改變的突變致死：造成個(gè)體死亡或生活力下降（半致死）的突變條件致死：在一定條件下有致死效應(yīng)的突變生化：沒有形態(tài)效應(yīng)的突變，如營養(yǎng)缺陷、抗藥性等翻譯

同義、錯(cuò)義、無義(UAG,UGA,UAA)、終止碼、抑制基因突變的特性稀有性突變率低（可通過理化處理提高突變率）隨機(jī)性獨(dú)立性Kmr10-5,Apr10-6,

KmrApr10-11可逆性回復(fù)突變率也很低穩(wěn)定性突變率：一個(gè)世代或一定時(shí)間內(nèi)發(fā)生突變的概率。幾種微生物每次復(fù)制的突變率

微生物基因組大?。╞p）突變率（堿基）突變率（基因組）噬菌體M136.4×1037.2×10－70.0046噬菌體λ4.9×1047.7×10－80.0038噬菌體T2、T41.7×1052.4×10－80.0040大腸桿菌4.6×1065.4×10－100.0025釀酒酵母1.2×1072.2×10－100.0027粗糙脈胞菌4.2×1077.2×10－110.0030平均

0.0034誘變劑

能引起微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的化學(xué)、物理、生物因子化學(xué)：堿基類似物（5-溴尿嘧啶、羥胺、亞硝酸）烷化劑（亞硝基胍、硫酸二乙酯）物理：短波（紫外線）射線（X-射線、γ射線）生物：噬菌體、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子誘變劑的作用誘變劑誘變作用對DNA的影響誘變能力5-溴尿嘧啶堿基錯(cuò)配轉(zhuǎn)換(ATGC)弱羥胺胞嘧啶脫酰胺轉(zhuǎn)換(GCAT)弱亞硝酸A、C、G脫酰胺轉(zhuǎn)換(ATGC)、缺失中亞硝基胍A、C烷基化轉(zhuǎn)換(GCAT)強(qiáng)硫酸二乙酯A、C烷基化轉(zhuǎn)換(GCAT)強(qiáng)溴化乙啶嵌入堿基對移碼弱紫外線嘧啶二聚轉(zhuǎn)換(GCAT)、巔換、缺失、移碼中γ射線DNA單鏈或雙鏈斷裂結(jié)構(gòu)改變、缺失強(qiáng)轉(zhuǎn)座子堿基取代、斷裂缺失、重復(fù)、插入強(qiáng)基因突變的應(yīng)用誘變育種雖然分子生物學(xué)技術(shù)已普遍用于育種，誘變育種仍是重要而基本的育種方法。誘變育種的基本步驟：

出發(fā)株→誘變劑處理→初篩→復(fù)篩→鑒定一般要進(jìn)行多次，以積累有益突變。誘變譜系：

誘變劑處理1誘變劑處理2出發(fā)株中間株1中間株2→…→目的株

誘變育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)出發(fā)株：性狀、潛力誘變處理：誘變劑選擇、劑量篩選：方法、篩選量High-throughputscreening致死率與誘變效果誘變育種的新技術(shù)

離子注入激光微波超聲太空突變株的篩選初篩：棄去大量無價(jià)值菌株復(fù)篩：選出少數(shù)有價(jià)值菌株方法：直接測定利用可觀察現(xiàn)象營養(yǎng)限制培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基組成型育種β–半乳糖苷酶加誘導(dǎo)酶抑制劑培養(yǎng)基：乳糖+鄰硝基-β-D-巖藻糖苷（誘導(dǎo)型酶抑制劑）只有組成型能利用乳糖交替培養(yǎng)法培養(yǎng)基1：乳糖培養(yǎng)基2：葡萄糖交替培養(yǎng)使組成型優(yōu)勢擴(kuò)大交替培養(yǎng)法組成型誘導(dǎo)型組成型：誘導(dǎo)型1061061:1乳糖106-108106–2x10650:1葡萄糖107-

1092x105-2x10750:1乳糖108-

10102x106-4x1062500:1葡萄糖109-10114x105-4x1072500:1乳糖1010-10124x106-8x106125000:1葡萄糖1011-10138x105-8x107125000:1營養(yǎng)缺陷型育種

營養(yǎng)缺陷型C-ABCB積累

ABCD積累

D

抗反饋抑制育種原理：

產(chǎn)物+酶（結(jié)合于調(diào)節(jié)中心）反饋抑制類似物+酶（結(jié)合于調(diào)節(jié)中心）影響生長抗類似物的變異株類似物與酶的調(diào)節(jié)中心不能結(jié)合產(chǎn)物與酶的調(diào)節(jié)中心不能結(jié)合反饋抑制解除產(chǎn)物能過量積累抗反饋抑制育種舉例蘇氨酸

C.crenatumAS1.5420mg/mlMNNGLR-1458AHVr6mg/ml<1MNNGLRA-96AHVr8mg/ml,Met-3.5MNNGLRA-359AHVr10mg/ml,Met-6.5LRA-359-667.0DESD20-23AHVr20mg/ml,Met-9.0m8513.0

AsaHseThrIleMetAHV(-氨基--羥基戊酸):Thr,Ile結(jié)構(gòu)類似物抗底物類似物育種*海因酶（二氫嘧啶酶）

5-氟尿嘧啶：底物(尿嘧啶)類似物，誘變劑抗底物類似物大量產(chǎn)生分解底物(類似物)的酶培養(yǎng)劑：平板培養(yǎng)劑+5-氟尿嘧啶

UVNTGNTG+5-FUJ43J404BO419M390.2750.7141.344.32IU/ml產(chǎn)物壓力法*L－乳酸

ADH

丙烯醇—

烯醛（對細(xì)胞有毒性）

NTG丙烯醇

AS3.3461HBF－12（從21株中選出）乳酸6896

乙醇164ADH5012基因重組

基因重組是遺傳物質(zhì)大范圍的改變，涉及一個(gè)或多個(gè)基因、部分染色體甚至整個(gè)基因組。有性生殖：與高等生物相同，限于產(chǎn)有性孢子微生物細(xì)胞融合：通過原生質(zhì)體結(jié)合：通過細(xì)胞間接觸轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過噬菌體為媒介轉(zhuǎn)化：游離DNA直接進(jìn)入宿主細(xì)胞感染：病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞細(xì)胞融合育種

溶菌酶

A+B-A+B-PEGA+B+再生

A+B+

溶菌酶

(A-B-)(A-B-)A-B+A-B+親代細(xì)胞原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合子原生質(zhì)體的制備細(xì)胞培養(yǎng)：對數(shù)初期去除細(xì)胞壁：緩沖液滲透壓和酶反應(yīng)條件利用誘變育種可提高突變率原生質(zhì)體融合化學(xué)融合：PEG電融合激光誘導(dǎo)融合融合子的篩選選擇性培養(yǎng)基雙親本的優(yōu)良性狀滅活菌種的保藏菌種保藏方法液體隔絕法冷凍干燥法低溫保藏法菌種保藏中心

ATCC(

AmericanTypeCultureCollection)IFO(InstituteforFermentation,Osaka)CGMCC(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCentre)ACCC(ChinaAgriculturalCultureCollectionCentre)CACC(ChinaAntibioticCultureCollectionCentre)CICC(ChinaIndustrialCultureCollectionCentre)第四章

微生物基因工程基本概念工具酶載體目的基因的獲得DNA體外重組基因的轉(zhuǎn)移工程菌的篩選基因工程基本概念名詞：

geneticengineering,DNArecombination,recombinantDNAtechniques,genemanipulation,genecloning,molecularcloning…基本材料：供體，載體，受體一般過程：基因體外重組→轉(zhuǎn)入受體→分離鑒定載體

工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶ITaqDNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶S1核酸酶堿性磷酸酯酶限制與修飾E.coliCλ.CEOP=1

EOP=1

EOP=1

EOP=10-4λ.KE.coliK限制性內(nèi)切酶

一類專一性很強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶，包括對堿基的專一性和磷酸二酯鍵斷裂方式的專一性。類型發(fā)現(xiàn)時(shí)間作用位點(diǎn)識別位點(diǎn)與作用位點(diǎn)的關(guān)系所需輔助因子Ⅰ1968不完全限定不同Mg2+,ATP…Ⅱ1970限定相同Mg2+Ⅲ1972限定不同Mg2+限制性內(nèi)切酶的命名與作用特點(diǎn)命名：根據(jù)分離到該酶的菌株例：HindⅢHemophilusinfluenza

dⅢ作用特點(diǎn)：

1，識別4~6個(gè)核苷酸序列

2，中心對稱

3，可產(chǎn)生粘性末端或平末端幾種限制性內(nèi)切酶C↓CCGGG37LXmaIT↓CGA65LTaqICCC↓GGG37*SmaI↓GATC37MSau3ACTGCA↓G30MPstI↓GATC37HMboIA↓AGCTT37MHindIII**G↓AATTC37HEcoRIA↓GATCT37MBglIIT↓GATCA60MBclI**G↓GATCC37MBamHI2ndactivitysequenceTemp(℃)saltenzyme限制性內(nèi)切酶的識別序列與產(chǎn)生的末端識別序列與產(chǎn)生的末端都相同識別序列不同，產(chǎn)生的末端相同識別序列相同，產(chǎn)生的末端不同識別序列與產(chǎn)生的末端都不同限制酶的反應(yīng)條件BufferNaClTrisMgSO4DTTL010mM(pH7.4)10mM1mM

M50mM10mM(pH7.4)10mM1mMH100mM50mM(pH7.4)10mM0

*20mMKCl10mM(pH8)10mM1mM第二活性

EcoRI

當(dāng)甘油＞10%(12~20)，Mn2+代替Mg2+,pH8.5時(shí)，識別AATTDNA連接酶3’5’OHPT4:ATP,Mg+2ATPPpiE.coli:NAD,Mg+2EE-AMPEAP

?HPAMP

DNA聚合酶IMW103,0005’-3’聚合酶活性5’-3’外切酶活性3’-5’外切酶活性DNA聚合酶I

經(jīng)枯草桿菌蛋白酶切得Klenow片段MW69,0005’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性TaqDNA聚合酶

耐高溫的DNA聚合酶，從水生棲熱菌(Thermusaquaticus)分離得到。由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreactionPCR)應(yīng)用的不斷擴(kuò)大，TaqDNA聚合酶已成為分子生物學(xué)研究最重要的工具酶之一。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ變性（~94°C）

ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ

ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ退火（~37°C）

5ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ33‘ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ5’延伸（~72°C）

ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ

ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ

用DNA聚合酶Klenow片段延長退火引物，由于在變性溫度下酶失活，每經(jīng)過一輪就需補(bǔ)充酶。1987年耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)PCR使得以實(shí)用。PCR反應(yīng)系統(tǒng)DNA模板引物（20~30bp，內(nèi)部無二級結(jié)構(gòu)）底物（4dNTPs）熱穩(wěn)定的DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶

發(fā)現(xiàn)于感染RNA病毒的動(dòng)物組織，以RNA為模板合成DNA，又稱依賴RNA的DNA聚合酶，常被用來合成cDNA，是獲得真核基因的重要工具酶。S1核酸酶作用于單鏈DNA的核酸酶，來自米曲霉(Aspergillusoryzae)，降解單鏈DNA，不降解雙鏈DNA和DNA-RNA雜合分子，用于制造DNA平末端和去掉cDNA合成時(shí)的發(fā)夾環(huán)。堿性磷酸酯酶除去DNA5’末端的磷酸，以提高重組效率細(xì)菌堿性磷酸酯酶BAP（耐熱）小牛腸道堿性磷酸酯酶CIP（68oC可完全失活）載體能運(yùn)載外源基因，進(jìn)入受體細(xì)胞并在其中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的特殊物質(zhì)?；蛑亟M基因轉(zhuǎn)移基因表達(dá)穩(wěn)定性、分泌、分離純化…

能自我復(fù)制能進(jìn)行基因操作可接納與運(yùn)載外源基因有選擇方法有期望的性狀克隆載體與表達(dá)載體克隆載體：拷貝數(shù)高，利于得到基因表達(dá)載體：表達(dá)量高，利于得到蛋白這兩類載體沒有絕對的區(qū)別。質(zhì)粒(plasmid)一種染色體外遺傳因子，為閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小從10-1~102kb不等，可以自我復(fù)制并且在細(xì)胞分裂時(shí)保持恒定地傳遞給子代細(xì)胞。質(zhì)粒DNA帶有與質(zhì)粒復(fù)制有關(guān)的基因、抗藥性基因以及其他一些基因，這些基因表現(xiàn)為與宿主有關(guān)的性質(zhì)，如轉(zhuǎn)移、穩(wěn)定性、分泌性質(zhì)、特殊的代謝途徑、限制、修飾等?？截悢?shù)：一個(gè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA分子的個(gè)數(shù)，與質(zhì)粒復(fù)制區(qū)的結(jié)構(gòu)有關(guān)。質(zhì)粒的類型復(fù)制類型：嚴(yán)緊型：質(zhì)粒DNA復(fù)制較嚴(yán)格受染色體DNA復(fù)制控制，復(fù)制時(shí)需有新的蛋白質(zhì)合成，一般拷貝數(shù)較少。松弛型：質(zhì)粒DNA復(fù)制不受染色體DNA復(fù)制控制，復(fù)制時(shí)不需要新的蛋白質(zhì)合成，一般拷貝數(shù)較多。接合類型（根據(jù)其引起細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的能力）：接合(conjugative)質(zhì)粒：有Tra基因，一般較大，拷貝數(shù)較少。非接合(non-conjugative)質(zhì)粒：沒有Tra基因。質(zhì)粒的制備培養(yǎng)、收集帶質(zhì)粒的細(xì)胞裂解細(xì)胞（生物、化學(xué)、物理）除去核酸外的其它細(xì)胞成分（苯酚、氯仿）除去染色體DNA、RNA（生物、化學(xué)、物理）濃縮、純化質(zhì)粒載體能在受體系統(tǒng)復(fù)制有盡可能多的限制酶的單一切點(diǎn)有正選擇標(biāo)記分子量較?。截悢?shù)高、轉(zhuǎn)化效率高、操作方便等）能高效表達(dá)外源基因在細(xì)胞分裂時(shí)保持穩(wěn)定外泌性、不可轉(zhuǎn)移性等穿梭(shutle)質(zhì)粒噬菌體噬菌體是以細(xì)菌為宿主的病毒，由遺傳物質(zhì)核酸與蛋白質(zhì)外殼組成，只有在宿主細(xì)胞里才能繁殖。按形狀分類：

蝌蚪狀噬菌體(T4)、球狀噬菌體(?X174)、線狀噬菌體(Ff)按遺傳物質(zhì)分類：

RNA噬菌體(MS2)、單鏈DNA噬菌體(M13)、雙鏈DNA噬菌體(λ)按與宿主的關(guān)系分類：

烈性噬菌體、溫和噬菌體溫和噬菌體可能構(gòu)建為載體溫和噬菌體的生活史

非溶源菌溶源菌溶源化感染復(fù)愈誘導(dǎo)

λ

營養(yǎng)期（菌裂解）噬菌體載體能感染受體細(xì)胞，并能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制在非必須區(qū)內(nèi)有多種限制酶的單切或雙切位點(diǎn)能容納不同大小的外源DNA片斷并包裝成感染性顆粒，重組噬菌體有一定產(chǎn)量能形成噬菌斑，并能通過噬菌斑的形成與表型區(qū)分重組與非重組噬菌體生物學(xué)安全性噬菌體的制備培養(yǎng)寄主菌接種噬菌體固體培養(yǎng)：雙層平板法液體培養(yǎng)：至培養(yǎng)液澄清噬菌體DNA的制備：苯酚反復(fù)抽提（關(guān)鍵是得到高濃度的噬菌體）目的基因的獲得化學(xué)合成酶促合成

cDNA合成

PCR鳥槍法化學(xué)合成基因用化學(xué)法合成目的基因的條件：

1，已知基因的核苷酸序列，或至少要知道該基因產(chǎn)物的氨基酸序列

2，基因必須很小舉例：生長激素釋放抑制因子(somatostatin)10LE.coli

發(fā)酵液

5mgsomatostatin

cDNA合成基因

mRNA5’AAAn3’(模版)dT

5’AAAn3’(合成引物)TTTn5’

逆轉(zhuǎn)錄酶：合成RNA-DNA

堿處理：得單鏈cDNADNA聚合酶：合成帶發(fā)夾環(huán)的雙鏈DNAS1核酸酶：去發(fā)夾環(huán)，得雙鏈DNA

PCR合成基因已知基因序列已知基因保守區(qū)序列反向PCRRT-PCR反向PCR用限制酶R1切出已知序列及其上下游區(qū)（2－3kb），稀釋各片段自我連接成環(huán)用在已知序列內(nèi)只有單切點(diǎn)的限制酶R2再切開用與已知序列5’端互補(bǔ)的引物PCR，原已知序列的兩端已在中間被大量擴(kuò)增限制只能擴(kuò)增緊靠已知序列兩端的序列R1應(yīng)能產(chǎn)生大小合適并包括待擴(kuò)增序列，R2應(yīng)在已知序列內(nèi)只有單切點(diǎn)鳥槍法用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⒑心康幕虻墓w基因組切成不同大小的DNA片段根據(jù)需要收集一定大小的DNA片段，這些片段應(yīng)比目的基因大，其中包括了帶有目的基因的片段將這些DNA片段連接到載體上，得到大量不同的重組DNA，其中包括了帶有目的基因的重組DNA將所有重組DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，得到大量不同的重組子，其中包括了帶有目的基因的重組子從大量重組子中篩選帶有目的基因的重組子。由于鳥槍法克隆的基因不是專一的，因此篩選時(shí)要運(yùn)用一些特殊的方法與技巧鳥槍法供體基因組的切割選擇限制酶與反應(yīng)條件時(shí)應(yīng)考慮：片段大小目的基因的完整性片段的末端識別6核苷酸序列

46=4096識別4核苷酸序列

44=256基因庫建立一定概率的基因庫所需的克隆數(shù)：

N=ln(1-P)/ln(1-f)P：所需的概率

f：克隆的片段與整個(gè)基因組的長度比例：細(xì)菌基因組4000kb，克隆片段4kb，90%概率需2301個(gè)克隆

99%概率需4603個(gè)克隆克隆片段40kb，90%概率需229個(gè)克隆

99%概率需458個(gè)克隆cDNA文庫mRNA的數(shù)量和復(fù)雜程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于基因組DNA

N=ln(1-P)/ln(1-n)P：所需的概率

n：低豐度mRNA與總mRNA之比DNA體外重組易于操作外源DNA片段可回收插入片段與載體啟動(dòng)子閱讀框一致DNA體外重組的方式平末端連接粘性末端連接

載體與外源DNA用同一限制酶酶切載體與外源DNA分別用產(chǎn)生相同粘性末端，但識別序列不同的兩種限制酶酶切，在切載體的限制酶活性存在的條件下連接定向克隆部分補(bǔ)齊法

HindIII→AGCT,BamHI→CTAG

人工接頭法連接效率連接效率：載體與外源DNA連接得到重組DNA在總連接產(chǎn)物中的比例影響連接效率的因素DNA濃度DNA片段長度DNA片段的卷曲度DNA末端的狀態(tài)載體與外源DNA的比例判斷連接效率的兩個(gè)參數(shù)分子內(nèi)粘性末端的有效濃度j=(3/2lb)3/2l:DNA片段長度,b:DNA片段卷曲度全部粘性末端的濃度i=2N0M10-3/mlM:摩爾濃度j=i自連與互連相等，ji互連為主，ji自連為主基因的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化（transformation)：游離DNA直接進(jìn)入細(xì)胞的過程，目前主要有感受態(tài)(competance）和原生質(zhì)體(protoplast)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染(transfection)：游離的噬菌體DNA直接進(jìn)入細(xì)胞的過程，轉(zhuǎn)染率較低，一般采用感染感染(infection)：DNA包裝進(jìn)病毒顆粒后進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：通過噬菌體為媒介在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的過程結(jié)合(conjugation)：通過細(xì)胞間接觸，遺傳物質(zhì)從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的過程物理方法結(jié)合轉(zhuǎn)移的條件細(xì)胞緊密接觸轉(zhuǎn)移(tra)基因：至少包括12個(gè)基因，編碼鞭毛和一些膜結(jié)構(gòu)泳動(dòng)(mob)基因：兩個(gè)區(qū)域（1）編碼泳動(dòng)蛋白（2）結(jié)合泳動(dòng)蛋白形成松散結(jié)合體，使質(zhì)粒分子在這區(qū)域上打開一個(gè)缺口（nic/bom區(qū)）結(jié)合型質(zhì)粒：帶有(tra、mob)的質(zhì)粒(tra+、mob+)結(jié)合轉(zhuǎn)移的材料受體細(xì)胞供體細(xì)胞，含有被轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（包括外源基因及mob區(qū)，無nic/bom區(qū)的質(zhì)粒不能被轉(zhuǎn)移）和助體質(zhì)粒(helper，帶tra+)，helper也可是細(xì)胞助體細(xì)胞(helper，帶tra+)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法

濾膜雜交分別培養(yǎng)細(xì)胞混合菌液，濃縮細(xì)胞混合的濃縮菌液滴于無菌濾膜，鋪于培養(yǎng)基平板培養(yǎng)細(xì)胞，洗下菌液稀釋后置于選擇性平板上培養(yǎng)

菌液雜交分別培養(yǎng)細(xì)胞受體菌涂于培養(yǎng)基平板滴5ul供體菌液于受體菌平板培養(yǎng)細(xì)胞長出菌落后轉(zhuǎn)移到選擇性平板上培養(yǎng)工程菌的篩選初篩：篩出重組子復(fù)篩：篩出帶目的基因的重組子瓊脂糖凝膠電泳lg=lg0-Kr

：泳動(dòng)率，0

：自由泳動(dòng)率，：膠濃度

Kr

：與膠的性質(zhì)、分子大小、構(gòu)象有關(guān)的常數(shù)

oc(openedcircularornickedcircular)DNAL(linear)DNAccc(covalentclosedcircular)DNA

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)用于分析DNA小片斷、RNA、蛋白質(zhì)等凝膠的濃度與聚合蛋白產(chǎn)物分析雙向(2D)電泳分子雜交原位雜交印跡法(blot)SouthernblotNorthernblotWesternblotSouthern-Westernblot原位雜交法印跡法Southernblot：DNA經(jīng)ararose電泳后轉(zhuǎn)移到膜上，再與探針雜交來分析DNA的技術(shù)。由C.E.Southern發(fā)明而得名Northernblot：RNA經(jīng)ararose或PA電泳后轉(zhuǎn)移到膜上，再與探針雜交來分析RNA的技術(shù)Westernblot：蛋白質(zhì)經(jīng)PA電泳后轉(zhuǎn)移到膜上，再通過免疫方法來分析蛋白質(zhì)的技術(shù)Southern-Wester