阿霉素耐藥的乳腺癌MCF-7Adm細(xì)胞系的建立及其耐藥特性

阿霉素耐藥的乳腺癌MCF-7/Adm細(xì)胞系的建立及其耐藥特性鄭婷婷（1987-）女，山西大同人，碩士研究生，主要從事抗腫瘤天然藥物方面的研究摘要：建立腫瘤耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤細(xì)胞的重要手段之一，也是探討腫瘤多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)。該論文采用大劑量間歇誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞，建立MCF-7/Adm耐藥模型；MTT法檢測(cè)耐藥倍數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞和MCF-7/Adm細(xì)胞中阿霉素的積累量；real-timePCR檢測(cè)MCF-7/Adm細(xì)胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞存活的IC50值分別為0.535μg/mL和173.275μg/mL，耐藥倍數(shù)為324；MCF-7細(xì)胞中的阿霉素積累量較MCF-7/Adm明顯高；MCF-7/Adm細(xì)胞中mRNA水平ABCB1基因表達(dá)明顯上調(diào)，ABCG2和ABCC1基因表達(dá)下調(diào)。本文成功獲得對(duì)阿霉素耐藥的人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/Adm，為進(jìn)一步研究乳腺癌多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)提供有利工具，并且對(duì)乳腺癌化療藥物的篩選具有一定的意義。關(guān)鍵詞：阿霉素；乳腺癌；耐藥；ABCB1中圖分類號(hào)：R737.9文獻(xiàn)識(shí)別碼：A0引言乳腺癌是女性多發(fā)的惡性腫瘤之一，對(duì)婦女的身心健康造成嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)每年新增患者約200萬(wàn)人，死亡率呈逐年上升趨勢(shì)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>黃哲宙</Author><Year>2021</Year><RecNum>211</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[1,2]</style></DisplayText><record><rec-number>211</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">211</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>黃哲宙</author><author>陳萬(wàn)青</author><author>吳春曉</author><author>鄭榮壽</author><author>陳建國(guó)</author><author>楊念念</author><author>王寧</author><author>張思維</author><author>鄭瑩</author></authors></contributors><titles><title>中國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病和死亡現(xiàn)況——全國(guó)32個(gè)腫瘤登記點(diǎn)2021—2021年資料分析報(bào)告</title><secondary-title>腫瘤</secondary-title></titles><periodical><full-title>腫瘤</full-title></periodical><pages>435-439</pages><volume>32</volume><number>6</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>王希龍</Author><Year>2021</Year><RecNum>212</RecNum><record><rec-number>212</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">212</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>王希龍</author><author>邱文秀</author><author>賈中明</author><author>韓勇</author><author>張國(guó)強(qiáng)</author><author>董新軍</author></authors></contributors><titles><title>乳腺癌的診斷現(xiàn)狀及最新進(jìn)展</title><secondary-title>中國(guó)綜合臨床</secondary-title></titles><periodical><full-title>中國(guó)綜合臨床</full-title></periodical><pages>787-788</pages><volume>28</volume><number>8</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"黃哲宙,2021#211"1,HYPERLINK\o"王希龍,2021#212"2]。目前，乳腺癌的治療中，化療占有十分重要的地位，尤其是對(duì)于癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散的患者，化療是主要的治療方法。然而隨著化療藥物使用時(shí)間的增長(zhǎng)，化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺死作用逐漸減小，同時(shí)也會(huì)表現(xiàn)出對(duì)不同結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的藥物產(chǎn)生交叉耐受性，這種現(xiàn)象稱為多要耐藥性（multidrugresistance，MDR）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2021</Year><RecNum>14</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>14</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">14</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,F.S.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofObstetricsandGynecology,ShowChwanMemorialHospital,Changhua,Taiwan.fsliufsliu@.tw</auth-address><titles><title>Mechanismsofchemotherapeuticdrugresistanceincancertherapy--aquickreview</title><secondary-title>TaiwanJObstetGynecol</secondary-title></titles><periodical><full-title>TaiwanJObstetGynecol</full-title></periodical><pages>239-44</pages><volume>48</volume><number>3</number><edition>2021/10/03</edition><keywords><keyword>AntineoplasticAgents/therapeuticuse</keyword><keyword>DrugResistance,Multiple</keyword><keyword>DrugResistance,Neoplasm</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Neoplasms/drugtherapy</keyword><keyword>StemCells/drugeffects</keyword></keywords><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Sep</date></pub-dates></dates><isbn>1875-6263(Electronic) 1028-4559(Linking)</isbn><accession-num>19797012</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/s1028-4559(09)60296-5</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Liu,2021#14"3]。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥是化療成功的主要障礙，對(duì)腫瘤的治療極為不利，也是困擾著腫瘤學(xué)家和癌癥患者的一個(gè)重大問(wèn)題。MDR發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，但目前ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（theATP-BindingCassetteTransporters）被認(rèn)為是導(dǎo)致MDR的主要機(jī)制之一，其在腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生中的主要作用是將化療藥物由腫瘤細(xì)胞內(nèi)泵至細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Schinkel</Author><Year>2021</Year><RecNum>27</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>27</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">27</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Schinkel,AlfredH</author><author>Jonker,JohanW</author></authors></contributors><titles><title>MammaliandrugeffluxtransportersoftheATPbindingcassette(ABC)family:anoverview</title><secondary-title>Advanceddrugdeliveryreviews</secondary-title></titles><periodical><full-title>Advanceddrugdeliveryreviews</full-title></periodical><dates><year>2021</year></dates><isbn>0169-409X</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Schinkel,2021#27"4]，其中與臨床腫瘤治療關(guān)系最密切的是ABCB1、ABCC1、ABCG2。建立耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤細(xì)胞的重要手段，對(duì)腫瘤的治療具有十分重要的意義，是探討惡性腫瘤多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的基礎(chǔ)。本研究采用大劑量間歇誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞，建立阿霉素耐藥的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，并檢測(cè)耐藥模型較親本株的耐藥倍數(shù)，細(xì)胞內(nèi)藥物的積累量等參數(shù)，以及多藥耐藥的標(biāo)志基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的表達(dá)變化，為深入研究腫瘤耐藥及多藥耐藥逆轉(zhuǎn)提供理想的模型和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1細(xì)胞株、藥物與主要試劑人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所，1640培養(yǎng)液購(gòu)于康寧公司，胎牛血清購(gòu)于Thermo公司，0.25%胰酶購(gòu)于碧云天公司，四甲基偶氮唑鹽（(3-(4，5-dimethylthiazol)-2，5-diphenylte-2H-tetrazoliumbromide，MTT)、二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）購(gòu)于sigma公司，阿霉素（Adriamycin，ADR）購(gòu)于生工生物公司。1.2MCF-7細(xì)胞株的培養(yǎng)用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)液在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化，3~5d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.3耐藥人乳腺癌細(xì)胞模型MCF-7/Adm的建立采用大劑量間歇誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Zhou</Author><Year>2021</Year><RecNum>28</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>28</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">28</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Zhou,Yuan</author><author>Ling,Xian-Long</author><author>Li,Shi-Wei</author><author>Li,Xin-Qiang</author><author>Yan,Bin</author></authors></contributors><titles><title>Establishmentofahumanhepatomamultidrugresistantcelllineinvitro</title><secondary-title>Worldjournalofgastroenterology:WJG</secondary-title></titles><periodical><full-title>Worldjournalofgastroenterology:WJG</full-title></periodical><pages>2291</pages><volume>16</volume><number>18</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Zhou,2021#28"5]。=1\*GB3①取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞按8×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加190μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h后，加入終濃度為0.02、0.1、0.5、2.5、12.5(μg/mL)的阿霉素10μL/孔，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48h；加入5mg/mL的MTT10μL繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入DMSO150μL搖床上搖10min，測(cè)定各孔的OD570值，計(jì)算阿霉素對(duì)MCF-7/細(xì)胞增殖的抑制率及IC50。其計(jì)算公式為：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值）]×100%。=2\*GB3②取MCF-7細(xì)胞接種于6㎝培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入終濃度為0.6μg/mL的阿霉素，作用12h，棄含藥培養(yǎng)液換不含阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)代，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好以后，按上述方法重復(fù)，直至細(xì)胞能維持在0.6μg/mL阿霉素濃度下長(zhǎng)期培養(yǎng)即成為耐藥人乳腺癌細(xì)胞模型MCF-7/Adm。1.3MTT法檢測(cè)MCF-7/Adm細(xì)胞系的耐藥指數(shù)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，按每孔8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加190μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的ADR，其終濃度分別為0、1、5、25、125、250（μg/mL），每孔總體積200μL；設(shè)對(duì)照孔為不加藥物的；調(diào)零孔為不加細(xì)胞的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，各孔加入MTT（5mg/mL）10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入DMSO150μL搖床上搖10min，測(cè)定各孔OD570值，計(jì)算阿霉素對(duì)MCF-7/Adm細(xì)胞增殖的抑制率及IC50值、耐藥指數(shù)。其計(jì)算公式為：耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。1.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物的積累量取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞、MCF-7/Adm細(xì)胞，分別以1×105個(gè)細(xì)胞接種于6㎝培養(yǎng)皿中，加RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液中加入阿霉素至終濃度為5μg/mL，培養(yǎng)24h后，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，在重懸與冷PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，反射波長(zhǎng)575nm）。1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MCF-7/Adm細(xì)胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞、MCF-7/Adm細(xì)胞，分別以1×105個(gè)細(xì)胞接種于6㎝培養(yǎng)皿中，加RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)72h后，收集細(xì)胞。Trizol法提取總RNA，檢測(cè)其濃度和純度。經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄分別得到其cDNA，用于Real-timePCR擴(kuò)增。引物如表1所示，PCR體系的總體積為20μL，其中包括ddH206.4μL，上下游引物分別0.8μL，已稀釋的cDNA2μL，SYRB10μL，置于實(shí)時(shí)定量PCR儀設(shè)置反應(yīng)程序并進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)置反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃10min，95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)后收集熒光。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。表1基因的引物序列及其擴(kuò)增產(chǎn)物大小基因Real-timeqPCR引物序列產(chǎn)物大?。╞p）GAPDHF：AGAAGGTCGGAGTCAACGGA227R：CTACTGGAAGATGGTGATGGGAABCG2F：TTCGCCGTCTCAACGCCATCC190R：GCCGCAGTGCCCATCACAACAABCC1F：AATGGCGGAGTTCCTGCTTAC218R：TTGATGCGGTGCTGTTGTGGABCB1F：GGAATGCGACAGGAGATAGG245R：AAGTGGTTTGCCCAGACAGC1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)、方差分析，資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2結(jié)果2.1大劑量間歇誘導(dǎo)出MCF-7/Adm細(xì)胞通過(guò)終濃度為0.6μg/mL的阿霉素反復(fù)間歇誘導(dǎo)，歷時(shí)8個(gè)月成功誘導(dǎo)出MCF-7/Adm細(xì)胞。凍存復(fù)蘇后細(xì)胞仍能穩(wěn)定生長(zhǎng)、增殖。如圖1，與野生型MCF-7細(xì)胞比較，耐藥細(xì)胞株MCF-7/Adm的形態(tài)發(fā)生明顯變化，邊緣不再呈尖角梭型，相對(duì)比較圓滑。野生型MCF-7細(xì)胞之間接觸比較緊密，而耐藥細(xì)胞株MCF-7/Adm之間間隙比較大，排列比較松散。在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞株MCF-7/Adm消化時(shí)間較野生型稍長(zhǎng)。A：誘導(dǎo)前的MCF-7細(xì)胞B：誘導(dǎo)成功的MCF-7/Adm細(xì)胞圖1MCF-7細(xì)胞及MCF-7/Adm細(xì)胞的形態(tài)觀察（×200）2.2ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞毒性作用及耐藥指數(shù)的檢測(cè)不同濃度的ADM作用于MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞48h后，如圖2所示，ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞的抑制率都隨著ADM濃度的升高而增大，但ADM對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用明顯比MCF-7/Adm的強(qiáng)，0.02μg/mL的ADM已經(jīng)對(duì)MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，但ADM濃度增加為50倍即1μg/mL時(shí)，對(duì)MCF-7/Adm幾乎沒(méi)有抑制作用。與MCF-7細(xì)胞相比，MCF-7/Adm細(xì)胞對(duì)ADM有明顯的耐藥性（表2），MCF-7/Adm細(xì)胞的耐藥指數(shù)RI為324倍(P<0.01)。圖2阿霉素對(duì)MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞增殖抑制作用（48h）表2MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性藥物IC50值（μg/mL）耐藥指數(shù)MCF-7細(xì)胞MCF-7/ADM細(xì)胞阿霉素（ADM）0.535±0.01173.275±1.323242.3MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)阿霉素藥物蓄積量的測(cè)定用終濃度為5μg/mL的ADM處理MCF-7細(xì)胞和MCF-7/Adm細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度，結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞內(nèi)ADM的熒光強(qiáng)度明顯比MCF-7/Adm高，分別為98.6%和51.4%。說(shuō)明MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)的阿霉素蓄積量明顯低于MCF-7細(xì)胞，進(jìn)一步說(shuō)明MCF-7/Adm細(xì)胞較MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性。A：誘導(dǎo)前的MCF-7細(xì)胞B：誘導(dǎo)成功的MCF-7/Adm細(xì)胞圖3MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度2.4Real-timePCR檢測(cè)MCF-7/Adm細(xì)胞中多藥耐藥的標(biāo)志基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表達(dá)Real-timePCR結(jié)果顯示，與敏感細(xì)胞株MCF-7相比，MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)ABCG2、ABCB1和ABCC1基因的表達(dá)有明顯差異，其中ABCG2和ABCC1在耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平下調(diào)，而ABCB1在耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)。圖4MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表達(dá)3討論目前腫瘤的多藥耐藥性仍被視為化療中的最大障礙。各種腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性的機(jī)制，都可能成為今后化療的靶點(diǎn)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>韓宜男</Author><Year>2021</Year><RecNum>24</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>24</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">24</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>韓宜男</author><author>錢江</author></authors></contributors><titles><title>腫瘤干細(xì)胞及其耐藥性機(jī)制研究</title><secondary-title>中國(guó)眼耳鼻喉科雜志</secondary-title></titles><periodical><full-title>中國(guó)眼耳鼻喉科雜志</full-title></periodical><pages>123-125</pages><volume>12</volume><number>2</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"韓宜男,2021#24"6]。因此，深入研究腫瘤細(xì)胞耐藥性機(jī)制的產(chǎn)生，尋找關(guān)鍵的靶點(diǎn)，進(jìn)而針對(duì)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的藥物，為降低癌癥死亡率和提高治愈率增加希望ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Saraswathy</Author><Year>2021</Year><RecNum>53</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[7]</style></DisplayText><record><rec-number>53</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">53</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Saraswathy,M.</author><author>Gong,S.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiomedicalEngineeringandWisconsinInstitutesforDiscovery,UniversityofWisconsin-Madison,WI53715,USA.</auth-address><titles><title>Differentstrategiestoovercomemultidrugresistanceincancer</title><secondary-title>BiotechnolAdv</secondary-title></titles><periodical><full-title>BiotechnolAdv</full-title></periodical><edition>2021/06/27</edition><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Jun22</date></pub-dates></dates><isbn>1873-1899(Electronic) 0734-9750(Linking)</isbn><accession-num>23800690</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/23800690</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>S0734-9750(13)00110-9[pii] 10.1016/j.biotechadv.2021.06.004</electronic-resource-num><language>Eng</language></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Saraswathy,2021#53"7]。腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立是研究MDR發(fā)生機(jī)制和逆轉(zhuǎn)策略的重要手段。可以說(shuō)，目前已知的MDR機(jī)制幾乎都首先在耐藥細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，而后在臨床病人中得到證實(shí)的ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Watson</Author><Year>2021</Year><RecNum>15</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[8]</style></DisplayText><record><rec-number>15</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">15</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Watson,M.B.</author><author>Lind,M.J.</author><author>Cawkwell,L.</author></authors></contributors><auth-address>CancerBiologyProteomicsGroup,PostgraduateMedicalInstituteoftheUniversityofHull,Hull,UK.</auth-address><titles><title>Establishmentofin-vitromodelsofchemotherapyresistance</title><secondary-title>AnticancerDrugs</secondary-title></titles><periodical><full-title>AnticancerDrugs</full-title></periodical><pages>749-54</pages><volume>18</volume><number>7</number><edition>2021/06/22</edition><keywords><keyword>AntineoplasticAgents/administration&dosage/pharmacokinetics/pharmacology</keyword><keyword>CellCultureTechniques/methods</keyword><keyword>CellLine,Tumor</keyword><keyword>DrugResistance,Neoplasm</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Models,Biological</keyword><keyword>Neoplasms/drugtherapy/physiopathology</keyword><keyword>Phenotype</keyword><keyword>ReproducibilityofResults</keyword></keywords><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Aug</date></pub-dates></dates><isbn>0959-4973(Print) 0959-4973(Linking)</isbn><accession-num>17581296</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1097/CAD.0b013e3280a02f43</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Watson,2021#15"8]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者們用藥物遞增誘導(dǎo)法建立了多種耐藥腫瘤細(xì)胞株，以深入研究腫瘤耐藥的機(jī)制。體外建立耐藥細(xì)胞株作為研究腫瘤細(xì)胞MDR機(jī)制的重要工具至今已有20多年的歷史，已產(chǎn)生多種誘導(dǎo)耐藥，建立耐藥細(xì)胞系的方法ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[HYPERLINK\o"Zhou,2021#28"5,HYPERLINK\o"Watson,2021#15"8,HYPERLINK\o"Li,2021#29"9]。阿霉素（adriamycin，ADM）是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的抗腫瘤藥物，抗瘤譜較廣，主要適用于急性白血病，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等都有一定療效ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>CH</Author><Year>2021</Year><RecNum>32</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[10]</style></DisplayText><record><rec-number>32</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">32</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LinR</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，ShiN個(gè)L，WangCH</style></author></authors></contributors><titles><title>Invitrostudyofanti-cancerdrugdoxorubicininPLGA-basedmicroparticles</title><secondary-title>Biomaterials</secondary-title></titles><periodical><full-title>Biomaterials</full-title></periodical><pages>4476-4485</pages><volume>26</volume><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"CH,2021#32"10]。它是一種蒽環(huán)類抗生素，主要是通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞核固定在拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα-DNA復(fù)合體上，影響細(xì)胞增值，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有一定的殺傷作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Myers</Author><Year>1977</Year><RecNum>33</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[11]</style></DisplayText><record><rec-number>33</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">33</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Myers,CharlesE</author><author>McGuire,WilliamP</author><author>Liss,RobertH</author><author>Ifrim,Ina</author><author>Grotzinger,Karen</author><author>Young,RobertC</author></authors></contributors><titles><title>Adriamycin:theroleoflipidperoxidationincardiactoxicityandtumorresponse</title><secondary-title>Science</secondary-title></titles><periodical><full-title>Science</full-title></periodical><pages>165-167</pages><volume>197</volume><number>4299</number><dates><year>1977</year></dates><isbn>0036-8075</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Myers,1977#33"11]。研究表明，腫瘤化療過(guò)程中長(zhǎng)期使用阿霉素會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，而且已經(jīng)有很多阿霉素耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功的例子，所以本課題用阿霉素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7，建立可靠的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性模型。本研究采用大劑量間歇誘導(dǎo)法與臨床周期性化療相似，更好地模擬臨床上化療后患者出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象，它對(duì)腫瘤多藥耐藥性的研究更有意義。經(jīng)過(guò)此方法成功誘導(dǎo)得到MCF-7/Adm耐藥株，其耐藥指數(shù)為324。其細(xì)胞形態(tài)較野生型MCF-7細(xì)胞發(fā)生明顯變化，而且在培養(yǎng)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)耐藥株生長(zhǎng)也相對(duì)緩慢，胰酶消化時(shí)間也較野生型稍長(zhǎng)。MTT結(jié)果提示兩株細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性存在著顯著的差異（P<0.01）。0.02μg/mL的ADM已經(jīng)對(duì)MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，但ADM濃度增加為50倍即1μg/mL時(shí)，對(duì)MCF-7/Adm幾乎沒(méi)有抑制作用，提示MCF-7/Adm細(xì)胞對(duì)ADM產(chǎn)生了顯著的耐藥性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示耐藥株內(nèi)阿霉素濃度明顯降低，這進(jìn)一步說(shuō)明耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功。Real-timePCR結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞內(nèi)ABCB1基因表達(dá)上調(diào)，而ABCC1基因和ABCG2基因表達(dá)下調(diào)。初步推斷其產(chǎn)生耐藥性與ABCB1基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)，ABCB1導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥主要是將化療藥物由腫瘤細(xì)胞內(nèi)泵至細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[HYPERLINK\o"Kapoor,2021#36"12]。至于另外兩種耐藥相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)的原因尚不清楚，尚需進(jìn)一步研究?？紤]到腫瘤多藥耐藥的分子機(jī)制非常復(fù)雜，是基因突變、相關(guān)蛋白的表達(dá)、各種酶介導(dǎo)、干細(xì)胞靶點(diǎn)表達(dá)缺失等多因素，多步驟綜合作用的結(jié)果ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Holohan</Author><Year>2021</Year><RecNum>101</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[13]</style></DisplayText><record><rec-number>101</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">101</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Holohan,Caitriona</author><author>VanSchaeybroeck,Sandra</author><author>Longley,DanielB</author><author>Johnston,PatrickG</author></authors></contributors><titles><title>Cancerdrugresistance:anevolvingparadigm</title><secondary-title>NatureReviewsCancer</secondary-title></titles><periodical><full-title>NatureReviewsCancer</full-title></periodical><pages>714-726</pages><volume>13</volume><number>10</number><dates><year>2021</year></dates><isbn>1474-175X</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Holohan,2021#101"13]，需進(jìn)一步深入研究?？傊?，本研究成功建立了一種人乳腺癌耐阿霉素的細(xì)胞株MCF-7/Adm，為進(jìn)一步研究乳腺癌多藥耐藥性的機(jī)制及耐藥性逆轉(zhuǎn)的藥物提供有利工具，并且對(duì)抗乳腺癌化療藥物的篩選具有重要的意義。參考文獻(xiàn)ADDINEN.REFLIST[1]黃哲宙,陳萬(wàn)青,吳春曉,等.中國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病和死亡現(xiàn)況—全國(guó)32個(gè)腫瘤登記點(diǎn)2021—2021年資料分析報(bào)告[J].腫瘤,2021,32(6):435-439.[2]王希龍,邱文秀,賈中明,等.乳腺癌的診斷現(xiàn)狀及最新進(jìn)展[J].中國(guó)綜合臨床,2021,28(8):787-788.[3]LiuFS.Mechanismsofchemotherapeuticdrugresistanceincancertherapy--aquickreview[J].TaiwanJObstetGynecol,2021,48(3):239-244.[4]SchinkelAH,JonkerJW.Mammaliandrugeffluxtransportersoftheatpbindingcassette(abc)family:Anoverview[J].AdvancedDrugDeliveryReviews,2021,64(22):138-155.[5]ZhouY,LingXL,LiSW,elat.Establishmentofahumanhepatomamultidrugresistantcelllineinvitro[J].WorldJournalofGastroenterology,2021,16(18):2291-2297.[6]韓宜男,錢江.腫瘤干細(xì)胞及其耐藥性機(jī)制研究[J].中國(guó)眼耳鼻喉科雜志,2021,12(2):123-125.[7]SaraswathyM,GongS.Differentstrategiestoovercomemultidrugresistanceincancer[J].BiotechnolAdv,2021,31(8):1873-1899.[8]WatsonMB,LindMJ,CawkwellL.Establishmentofin-vitromodelsofchemotherapyresistance[J].AnticancerDrugs,2021,18(7):749-754.[9]LiL,LuanY,WangG,elat.Developmentandcharacterizationoffivecellmodelsforchemoresistancestudiesofhumanovariancarcinoma[J].InternationalJournalofMolecularMedicine,2021,14(2):257.[10]linR,ShiNL,WangCH.Invitrostudyofanti-cancerdrugdoxorubicininplga-basedmicroparticles[J].Biomaterials,2021,26(21):4476-4485.[11]MyersCE,McGuireWP,LissRH,elat.Adriamycin:Theroleoflipidperoxidationincardiactoxicityandtumorresponse[J].Science,1977,197(4299):165-167.[12]Kapoor,Khyati,HongMaySim,elat.MultidrugResistanceinCancer:ATaleofABCDrugTransporters[M].NewYork:Springer,2021:1-34.[13]HolohanC,VanSchaeybroeckS,LongleyDB,elat.Cancerdrugresistance:Anevolvingparadigm[J].NatureReviewsCancer,2021,13(10):714-726.Establishmentofaadriamycin-inducedmultidrugresistancecelllineMCF-7/AdmZhengtingting,Panshuhua,Zhengxusheng,Wudengwei,Xuchuanlian(CollegeofLifeScience,ZhejiangSci-TechUniversity,Hangzhou,310018)Abstract:Establishmentofmultidrug-resistantcelllinesisanimportantmethodofcancerresearch,itisalsofoundationofthestudyofMDRmechanismandreversing.Thispapperusingintermittentadministrationofhigh-doseADMtoinduceMCF-7cellgetMCF-7/Admcellmodel.ThemultidrugresistanceofMCF-7/AdmwasdetectedbyMTTassay,theaccumulationofadriamycinwasdetectedbyflowcytomerty,andtheexpressionofABCB1、ABCC1andABCG2wereexaminedbyreal-timePCRinthisstudy.TheresultshowIC50ofMCF-7andMCF-7/AdmtoADMwas0.535and173.275μg/mLrespectively,theaccumulationofADMinMCF-7wasalsomorethanMCF-7/Adm;theexpressionsofABCB1wasup-regulated,howevertheexpressionofABCC1andABCG2weredown-regulated.adriamycin-resistantcelllineMCF-7/Admisestablishedsuccessfully,whichprovideahelpfultoolformechanismandreverseofbreastcancerMDRdeeply.Itisalsosignificanttochooseeffectiveanticanerdrug.Keywords:adriamycin;breasttumor;drugresistance;ABCB1

咖啡店創(chuàng)業(yè)計(jì)劃書第一部分：背景在中國(guó)，人們?cè)絹?lái)越愛(ài)喝咖啡。隨之而來(lái)的咖啡文化充滿生活的每個(gè)時(shí)刻。無(wú)論在家里、還是在辦公室或各種社交場(chǎng)合，人們都在品著咖啡?？Х戎饾u與時(shí)尚、現(xiàn)代生活聯(lián)系在一齊。遍布各地的咖啡屋成為人們交談、聽音樂(lè)、休息的好地方，咖啡豐富著我們的生活，也縮短了你我之間的距離，咖啡逐漸發(fā)展為一種文化。隨著咖啡這一有著悠久歷史飲品的廣為人知，咖啡正在被越來(lái)越多的中國(guó)人所理解。第二部分：項(xiàng)目介紹第三部分：創(chuàng)業(yè)優(yōu)勢(shì)目前大學(xué)校園的這片市場(chǎng)還是空白，競(jìng)爭(zhēng)壓力小。而且前期投資也不是很高，此刻國(guó)家鼓勵(lì)大學(xué)生畢業(yè)后自主創(chuàng)業(yè)，有一系列的優(yōu)惠政策以及貸款支持。再者大學(xué)生往往對(duì)未來(lái)充滿期望，他們有著年輕的血液、蓬勃的朝氣，以及初生牛犢不怕虎的精神，而這些都是一個(gè)創(chuàng)業(yè)者就應(yīng)具備的素質(zhì)。大學(xué)生在學(xué)校里學(xué)到了很多理論性的東西，有著較高層次的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)代大學(xué)生有創(chuàng)新精神，有對(duì)傳統(tǒng)觀念和傳統(tǒng)行業(yè)挑戰(zhàn)的信心和欲望，而這種創(chuàng)新精神也往往造就了大學(xué)生創(chuàng)業(yè)的動(dòng)力源泉，成為成功創(chuàng)業(yè)的精神基礎(chǔ)。大學(xué)生創(chuàng)業(yè)的最大好處在于能提高自己的潛力、增長(zhǎng)經(jīng)驗(yàn)，以及學(xué)以致用;最大的誘人之處是透過(guò)成功創(chuàng)業(yè)，能夠?qū)崿F(xiàn)自己的理想，證明自己的價(jià)值。第四部分：預(yù)算1、咖啡店店面費(fèi)用咖啡店店面是租賃建筑物。與建筑物業(yè)主經(jīng)過(guò)協(xié)商，以合同形式達(dá)成房屋租賃協(xié)議。協(xié)議資料包括房屋地址、面積、結(jié)構(gòu)、使用年限、租賃費(fèi)用、支付費(fèi)用方法等。租賃的優(yōu)點(diǎn)是投資少、回收期限短。預(yù)算10-15平米店面，啟動(dòng)費(fèi)用大約在9-12萬(wàn)元。2、裝修設(shè)計(jì)費(fèi)用咖啡店的滿座率、桌面的周轉(zhuǎn)率以及氣候、節(jié)日等因素對(duì)收益影響較大。咖啡館的消費(fèi)卻相對(duì)較高，主要針對(duì)的也是學(xué)生人群，咖啡店布局、格調(diào)及采用何種材料和咖啡店效果圖、平面圖、施工圖的設(shè)計(jì)費(fèi)用，大約6000元左右3、裝修、裝飾費(fèi)用具體費(fèi)用包括以下幾種。(1)外墻裝飾費(fèi)用。包括招牌、墻面、裝飾費(fèi)用。(2)店內(nèi)裝修費(fèi)用。包括天花板、油漆、裝飾費(fèi)用，木工、等費(fèi)用。(3)其他裝修材料的費(fèi)用。玻璃、地板、燈具、人工費(fèi)用也應(yīng)計(jì)算在內(nèi)。整體預(yù)算按標(biāo)準(zhǔn)裝修費(fèi)用為360元/平米，裝修費(fèi)用共360*15=5400元。4、設(shè)備設(shè)施購(gòu)買費(fèi)用具體設(shè)備主要有以下種類。(1)沙發(fā)、桌、椅、貨架。共計(jì)2250元(2)音響系統(tǒng)。共計(jì)450(3)吧臺(tái)所用的烹飪?cè)O(shè)備、儲(chǔ)存設(shè)備、洗滌設(shè)備、加工保溫設(shè)備。共計(jì)600(4)產(chǎn)品制造使用所需的吧臺(tái)、咖啡杯、沖茶器、各種小碟等。共計(jì)300凈水機(jī)，采用美的品牌，這種凈水器每一天能生產(chǎn)12l純凈水，每一天銷售咖啡及其他飲料100至200杯，價(jià)格大約在人民幣1200元上下?？Х葯C(jī)，咖啡機(jī)選取的是電控半自動(dòng)咖啡機(jī)，咖啡機(jī)的報(bào)價(jià)此刻就應(yīng)在人民幣350元左右，加上另外的附件也不會(huì)超過(guò)120