不同地區(qū)板藍(lán)根蛋白SDS―PAGE分析

不同地區(qū)板藍(lán)根蛋白SDS分析摘要：目的采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)技術(shù)鑒別不同地區(qū)板藍(lán)根，為板藍(lán)根藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法采用SDS技術(shù)，建立黑龍江和河北地區(qū)板藍(lán)根蛋白圖譜。結(jié)果黑龍江板藍(lán)根蛋白約含13條亞基，主要為10.5kD、23.0kD、24.9kD、44.1kD4種亞基，河北板藍(lán)根蛋白約含12條亞基，主要為55.6kD、45.9kD、34.3kD、18.9kD、12.4kD、10.5kD6種亞基。結(jié)論SDS技術(shù)可以用于鑒別不同地區(qū)的板藍(lán)根。關(guān)鍵詞：板藍(lán)根；鑒別；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.024中圖分類號(hào)：R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1005-5304(2015)07-0086-03AnalysisonIsatidisRadixProteininDifferentAreasbySDSYANGXin,WANGQiu-hong,WANGYue,GUOHui,XINGNa,KUANGHai-xue(KeyLaboratoryofBasicandAppilicationResearchofChineseMedicine,MinistryofEducation;HeilongjiangKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicinePharmacodynamicMaterialBases;HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)Abstract:ObjectiveToidentifyIsatidisRadixindifferentareasbySDS;ToprovidethebasisfortheidentificationandqualityevaluationofIsatidisRadix.MethodsByusingSDStechnology,theproteinprofilesofIsatidisRadixinHeilongjiangandHebeiregionswereestablished.ResultsIsatidisRadixproteininHeilongjiangcontainedabout13proteinsubunits,andthemajorsubunitswere10.5kD,23.0kD,24.9kD,and44.1kD.IsatidisRadixproteininHebeicontainedabout12subunits,andthemajorsubunitswere55.6kD,45.9kD,34.3kD,18.9kD,12.4kD,and10.5kD.ConclusionSDStechnologycanbeusedasoneofthereferencestoidentifyIsatidisRadixindifferentareas.Keywords:IsatidisRadix;identify;SDS《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，正品板藍(lán)根為十字花科植物法藍(lán)IsatisindigoticaFort.的干燥根[1],主要功效為涼血消腫、清熱解毒，研究表明具有抗內(nèi)毒素的作用[2-3]o由于板藍(lán)根用途非常廣泛，產(chǎn)量與市場(chǎng)的供求矛盾使其鑒別和質(zhì)量受到高度關(guān)注。目前中藥成分研究主要集中在生物堿、多糖等方面，而對(duì)蛋白質(zhì)等大分子的研究較少。本試驗(yàn)對(duì)不同地區(qū)的板藍(lán)根蛋白質(zhì)分子進(jìn)行指紋圖譜研究，以提供不同地區(qū)板藍(lán)根藥材的更多信息，為其質(zhì)量控制及進(jìn)一步研究提供參蒼O1儀器與試藥UV-1700紫外分光光度計(jì)，日本島津；電泳儀和電泳自動(dòng)成像儀，美國(guó)BIO-RAD生化科技有限公司；電通訊作者：匡海學(xué)，E-mail:hxkuang56@163.com子天平，上海人和科學(xué)儀器有限公司；MIKRO220R離心機(jī)，德國(guó)Hettich。板藍(lán)根樣本采自黑龍江和河北地區(qū)，每個(gè)地區(qū)隨機(jī)采集10個(gè)樣本，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，用硅膠干燥，室溫保存。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）試劑，BIO-RAD生化科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。2方法2.1蛋白提取采用植物蛋白提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)CW2033）進(jìn)行蛋白提取，所提蛋白可直接進(jìn)行蛋白電泳分析。①取0.1g板藍(lán)根，用液氮研磨成細(xì)末，轉(zhuǎn)入離心管中。②取990以L蛋白抽提試劑，在進(jìn)行蛋白抽提前2?3min加入10以L蛋白酶抑制劑。③加入配好的組織蛋白抽提試劑。④冰上孵育20?30min。⑤10000Xg離心20min。⑥收集上清，-80C保存?zhèn)溆谩?.2蛋白定量檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制采用二唾咻甲酸（bicin-choninicacid,BCA）蛋白定量法[4-5]o紫外分光光度儀開(kāi)機(jī)預(yù)熱20min。取7只滅菌后的試管（編號(hào)1?7）,按表1對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白（BSA）和待測(cè)蛋白樣品各100以L分別加入做好標(biāo)記的試管1?7中，每個(gè)樣本做3個(gè)平行反應(yīng)。向每個(gè)試管中各加入2mLBCA工作液，充分混勻，室溫孵育2ho將各管冷卻至室溫。用分光光度計(jì)在562nm處測(cè)定樣品及BSA的吸光值，分別讀取1?7號(hào)管的光密度。以蛋白濃度（以g/以L）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白含量。表1標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋管號(hào)BSA（以g）0.9%氯化鈉溶液（以g）稀釋后BSA（以g/以L）1000220020012002000.52002000.252002000.1252002000.0625702000.3十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白完整性采用雙垂直板SDS進(jìn)行分析［6-8］。分離膠濃度10%,濃縮膠濃度5%,凝膠厚度為1mm,考馬斯亮藍(lán)快速染色（G250）方法進(jìn)行凝膠染色，染色后的凝膠用BIO-RAD掃描儀進(jìn)行掃描，重復(fù)3次，并采用ImageLab4.0.1軟件進(jìn)行圖像分析。3結(jié)果3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線為了提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，減少不必要的誤差，將1?7號(hào)試管在562nm比色測(cè)定3次，求平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。表2比色測(cè)定結(jié)果管號(hào)濃度（以g/以L）吸光值000.06250.02240.12500.05070.25000.11530.50000.20761.00000.42262.00000.7957.2板藍(lán)根的蛋白含量將10個(gè)隨機(jī)樣品提取的蛋白進(jìn)行混合，采用BCA蛋白定量方法測(cè)得河北和黑龍江地區(qū)板藍(lán)根蛋白含量分別為1.594、2.613以g/以L。3.3蛋白的完整性分析TOC\o"1-5"\h\z黑龍江和河北地區(qū)板藍(lán)根蛋白亞基分布見(jiàn)圖1、圖2。染色后板藍(lán)根蛋白質(zhì)條帶清晰，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，條帶顏色越深說(shuō)明蛋白含量越高，顏色越淺說(shuō)明蛋白含量越低。從板藍(lán)根蛋白SDS圖及其亞基分布譜圖可以看由，黑龍江板藍(lán)根所含亞基數(shù)約為13條，亞基的分子質(zhì)量范圍為10.5?174kD,其中，黑龍江板藍(lán)根蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為174kD,最小為10.5kD,亞基7、9、10、13含量最高。河北板藍(lán)根所含亞基數(shù)約為12條，亞基分子質(zhì)量范圍為10.5?173.3kD,其中，河北板藍(lán)根蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為173.3kD,最小的為10.5kD,亞基5、6、7、10、11、12含量最高。蛋白泳道和條帶分析見(jiàn)表3?表6?？梢?jiàn)，不同地區(qū)板藍(lán)根蛋白SDS分離效果良好，分辨率高、條帶清晰、數(shù)量較多，蛋白條帶具有多態(tài)性，2個(gè)地區(qū)的板藍(lán)根有相似條帶，也有特征條帶。圖1黑龍江地區(qū)板藍(lán)根蛋白電泳圖譜圖2河北地區(qū)板藍(lán)根蛋白電泳圖譜表3黑龍江地區(qū)板藍(lán)根標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道和條帶分析條帶編號(hào)分子量（kD）相對(duì)前沿體積（lnt）條帶百分比（％）泳道百分比（％）175.00.0232202236421.616.6130.00.11334915043.42.695.0083.770.00.22751340095.03.962.00.3025500290.37352081785.13.942.00.44660012575.94.529.00.53163051696.24.722.00.71576930747.55.814.00.89258765705.84.410.50.9832981319129.222.5表4黑龍江地區(qū)板藍(lán)根蛋白泳道和條帶分析條帶編號(hào)分子量（kD）相對(duì)前沿體積（lnt）條帶百分比（％）泳道百分比（%）174.00.0252416053524.718.1131.00.113137550.2062318870.20.266.50.2592306810.20.263.70.2853342630.30.356.10.33810370261.10.844.10.42881500148.36.1827.20.5746677220.70.523.00.68740297824.13.015.20.859150560.8943705100.40.310.50.9785337494754.540.0表5河北地區(qū)板藍(lán)根標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道和條帶分析條帶編號(hào)分子量（kD）相對(duì)前沿體積（lnt）條帶百分比（％）泳道百分比（%）175.00.01842193904.44.0130.00.10840619434.23.9395.0095.470.00.22669824157.36.662.00.30378920218.27.551.00.3726400260.4477513450.53073272507.67.022.00.71889257369.38.514.00.89281370798.57.710.50.9792874470330.027.4表6河北地區(qū)板藍(lán)根蛋白泳道和條帶分析條帶編號(hào)分子量（kD）相對(duì)前沿體積（lnt）條帶百分比（％）泳道百分比（%）79.50.1981645600.30.266.10.26231695205.23.962.60.2969069600.34129632004.83.745.90.41329652004.43.334.30.49321940803.62.726.20.59912597602.11.623.60.6717106401.20.918.90.77733386400.930821016013.4902996552048.937.04小結(jié)本研究采用雙垂直板SDS技術(shù)對(duì)不同地區(qū)板藍(lán)根進(jìn)行研究和分析，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、樣品量少、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)可以通過(guò)比較蛋白圖譜，根據(jù)蛋白圖譜上的蛋白條帶數(shù)量、分子量大小、條帶顏色深淺等對(duì)不同地區(qū)、不同品種的藥材進(jìn)行鑒別和質(zhì)量研究。黑龍江地區(qū)板藍(lán)根是移栽品種，不同地域土壤酸堿度對(duì)植物種植和生長(zhǎng)及土壤肥力都有一定影響。本試驗(yàn)為板藍(lán)根藥材種植、質(zhì)量評(píng)價(jià)，以及進(jìn)一步深入研究提供了依據(jù)。參考文獻(xiàn)：[1]曾令杰，楊東升，陳松光，等.板藍(lán)根顆粒的指紋圖譜質(zhì)量控制研究[J].中成藥，2004,26(2):87-89.[2]劉海軍.板藍(lán)根的研究進(jìn)展[J].獸醫(yī)研究，2010,25(7):54-55.[3]王曉丹，李慧慶.板藍(lán)根藥理作用研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2010,23(4):241-242.QinH,GuoY,ZhangC,etal.Theexpressionofneuroglobininastrocytoma[J].BrainTumorPathol,2012,29(1):10.BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitiesofmicrogramofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dy