微生物作業(yè)指導書

微生物作業(yè)指導書微生物作業(yè)指導書微生物作業(yè)指導書xxx公司微生物作業(yè)指導書文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度XHRXHR/JCZL-02-011-2014西安宏興乳業(yè)有限公司 微生物檢驗作業(yè)指導書編制：審核：批準：受控狀態(tài)：發(fā)放號：20142014-02-28實施西安宏興乳業(yè)有限公西安宏興乳業(yè)有限公司發(fā)布2014-02-25發(fā)布2014-02-25發(fā)布 目錄目錄目錄·························································1§1菌落總數(shù)···················································2§2大腸菌群的測定·············································7§3沙門氏菌檢驗··············································10§4金黃色葡萄球菌檢驗········································15§5阪崎腸桿菌的檢驗··········································18 西安宏興乳業(yè)有限公司菌落總數(shù)測定菌落總數(shù)測定1.術語和定義菌落總數(shù)(aerobicplatecount)食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。2.設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：2.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。2.2冰箱：2℃～5℃。2.3烘箱。2.4天平：感量為0.1g。2.5均質器。2.6無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.7無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。2.8無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。2.9菌落計數(shù)器。2.10試管，18*180，20*200。3.培養(yǎng)基和試劑3.1平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。3.2無菌生理鹽水，0.85%。4.檢驗程序菌落總數(shù)的檢驗程序見下圖：↓↓↓↓↓5.操作步驟5.1.樣品的稀釋5.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000r/min～10000r/min均質1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。5.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。5.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。5.1.4按以上操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。5.1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。5.1.6及時將15mL～20mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。5.2培養(yǎng)5.2.1待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36±1℃℃培養(yǎng)48h±2h。5.2.2如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉平板，按5.2.1條件進行培養(yǎng)。5.3菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits，CFU）表示。5.3.1選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。5.3.2其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。5.3.3當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。6.結果與報告6.1菌落總數(shù)的計算方法6.1.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結果。6.1.2若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內時，按公式（1）計算：N=(1)式中：式中：N——樣品中菌落數(shù)；∑C——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。示例：稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）菌落數(shù)（CFU）232，24433，35N==24727上述數(shù)據(jù)按7.2.2數(shù)字修約后，表示為25000或2.5×104。6.1.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。6.1.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。6.1.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。6.1.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。6.2菌落總數(shù)的報告6.2.1菌落數(shù)小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。6.2.2菌落數(shù)大于或等于100CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約。后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。6.2.3若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。6.2.4若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。6.2.5稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。6.2.5稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。7.備注本方法參考國標GB4789.2-2010。大腸菌群的測定（平板計數(shù)法）1.術語和定義大腸菌群的測定（平板計數(shù)法）1.術語和定義1.1大腸菌群coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。1.2最可能數(shù)mostprobablenumber，MPN基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。2.設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：2.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。2.2冰箱：2℃～5℃。2.3烘箱。2.4天平：感量0.1g。2.5均質器。2.6無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.7無菌錐形瓶：容量500mL。2.8無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。2.9菌落計數(shù)器。3.培養(yǎng)基和試劑3.1結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）。3.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯。3.3無菌生理鹽水,0.85%。4.檢驗程序大腸菌群平板計數(shù)法的檢驗程序見下圖:↓36℃±1℃↓18-24h↓36℃±1℃↓24-48h5.操作步驟5.1樣品的稀釋5.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內8000r/min～10000r/min均質1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。5.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。5.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。5.1.4根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。5.2平板計數(shù)5.2.1選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。5.2.2及時將15mL～20mL冷至46同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。5.2.2及時將15mL～20mL冷至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。5.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。5.4證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。5.5大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。6.備注本方法參考國標GB4789.3-2010。沙門氏菌檢驗沙門氏菌檢驗1.設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：1.1冰箱：2℃～5℃。1.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，42℃±1℃。1.3均質器。1.4振蕩器。1.5電子天平：感量0.1g。1.6無菌錐形瓶:容量500mL，250mL。1.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。1.8無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.9無菌試管：3mm×50mm、10mm×75mm。1.10全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。2.培養(yǎng)基和試劑2.1緩沖蛋白胨水（BPW）。2.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液。2.3亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液。2.4亞硫酸鉍（BS）瓊脂。2.5HE瓊脂。2.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂。2.7沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基。2.8三糖鐵（TSI）瓊脂。2.9賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基。2.10生化鑒定試劑盒。3.培養(yǎng)基和試劑3.1緩沖蛋白胨水（bufferpeptonewater，BPW）：制法：稱取20g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.2±0.2，121℃高壓滅菌15min后取出。3.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：制法：稱取93.5g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.2±0.2，121℃高壓滅菌20min后取出。臨用前按每100mL加入P-72碘液一支和P-730.1%煌綠一支，混勻后分裝。3.3亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液：制法：稱取23g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.0±0.2，加熱煮沸滅菌，不要過度加熱，定量分裝備用。3.4亞硫酸鉍（BS）瓊脂：制法：稱取49.6g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.5±0.1，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55℃左右，搖勻，傾注平板備用。臨用前一天配制。3.5HE瓊脂：制法：稱取75.5g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.5±0.2，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55℃左右，傾注平板備用。3.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：制法：稱取58.9g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.4±0.2，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55℃左右，傾注平板備用。不要過度加熱.3.7沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基：制法：稱取34.9g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.6±0.2，加熱煮沸滅菌，冷卻至55℃左右，搖勻后鋪制成平板備用。3.8三糖鐵（TSI）瓊脂：制法：稱取63.4g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.4±0.2，分裝（每4mL左右為一管），115℃高壓滅菌15min后取出，制成高層斜面?zhèn)溆谩?.9賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基：制法：稱取1.9g于100mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至6.8±0.2，分裝（每個小離心管裝0.5mL），115℃高壓滅菌10min后備用。3.10細菌微量生化鑒定管：3.10.1M007-氨基酸脫羧酶對照3.10.2M002-色氨酸肉湯3.10.3M036-尿素酶3.10.4M151-氰化鉀培養(yǎng)基3.10.5M152-氰化鉀培養(yǎng)基對照3.10.5M152-氰化鉀培養(yǎng)基對照3.10.6M016-β-半乳糖苷（ONPG）3.11沙門氏菌屬診斷血清A-F4操作步驟4.1前增菌4.1.1固體和液體：稱取25g（mL）樣品放入盛有225mLBPW的均質袋中，用手緩緩地搖動至充分溶解，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。4.1.2物體表面：將檢樣混勻后，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。4.2增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉種于10mLTTB內，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時，另取1mL，轉種于10mLSC內，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。4.3分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表1。表1沙門氏菌屬在不同命選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。HE瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。XLD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基菌落呈紫紅色或紫色。4.4生化鑒定4.4.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基驗培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基。同時，挑取可疑菌落接種于色氨酸（供做靛基質試驗）、尿素瓊脂、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基、氰化鉀培養(yǎng)基對照和ONPG。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h，按表2、3判定結果。表2結果判定表試驗項目陰性結果陽性結果說明三糖鐵黃色或紅色有黑色物質產(chǎn)生穿刺不可穿透瓊脂至管底部。賴氨酸脫羧酶對照黃色對照黃色接種完可疑菌落后滴加3-4滴滅菌液體石蠟覆蓋液面。試驗黃色試驗紫色色氨酸黃色玫瑰紅色培養(yǎng)后滴加2-3滴靛基質試劑，即刻觀察結果。尿素酶黃色或橙色玫瑰紅色或紅色氰化鉀對照生長對照生長接種完可疑菌落后滴加3-4滴滅菌液體石蠟覆蓋液面。試驗不生長試驗生長ONPG不變色黃色培養(yǎng)1-3h觀察結果，如為陰性繼續(xù)培養(yǎng)至24h.表3沙門氏菌屬生化反應初步鑒定表反應序號硫化氫靛基質pH7.2尿素氰化鉀賴氨酸脫羧酶A1+———+A2++——+A3————＋/－注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性4.4.2.1反應序號A1：典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。表4沙門氏菌屬生化反應初步鑒定表pH7.2尿素氰化鉀賴氨酸脫羧酶判定結果———甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學鑒定結果）—++沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）+—+沙門氏菌個別變體（要求血清學鑒定結果）注：＋表示陽性；＋表示陰性4.4.2.24.4.2.2反應序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質陽性變體兩項試驗結果均為陽性，但需要結合血清學鑒定結果進行判定。4.4.2.3反應序號A3：ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫羧酶陽性；甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。4.5血清學鑒定在清潔玻片上滴1滴血清，然后挑取1環(huán)待測菌與血清混勻，輕輕搖動玻片，1分鐘內肉眼判斷結果，試驗應以生理鹽水溶液作為陰性對照。于1分鐘內呈明顯凝集者為陽性，呈渾濁者為陰性。結果與報告綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果，報告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。注意事項6.1一般干粉培養(yǎng)基應密封保存于陰涼干燥處，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基制備好的平板于2～8℃避光保存，其他配制好的藥品無特殊要求可直接保存于冰箱中。6.2TTB增菌液應現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液均勿需高壓滅菌。6.3劃線接種時應采用三區(qū)法劃線，并且接種針和接種環(huán)都必須滅菌徹底（連續(xù)灼燒三次）。前增菌以后的工作需在生物安全中進行。6.4在實驗過程中若有菌液不慎灑出先用75%酒精棉球擦拭干凈，實驗完后用3%甲酚皂溶液擦拭消毒。并應定期對無菌室進行清洗消毒。6.5所有安瓿瓶無需加蓋。對賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶對照培養(yǎng)基、氰化鉀培養(yǎng)基和氰化鉀對照培養(yǎng)基在接種完菌落后需加液體石蠟2-3滴封口。6.6已經(jīng)開袋的均質袋應保存于無菌室內，并盡快使用，避免污染。6.7將已挑取菌落平板保存于2～5℃的冰箱內，至少保留24h以備必要時復查。6.8廢棄的培養(yǎng)液和培養(yǎng)基需經(jīng)高壓滅菌鍋121℃滅菌30min后再廢棄或清洗。7.備注本方法參考國標GB4789.4-2010。金黃色葡萄球菌的測定金黃色葡萄球菌的測定1設備和材料：除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：1.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。1.2冰箱：2℃～5℃。1.3恒溫水浴鍋：37℃～65℃。1.4天平：感量0.1g。1.5無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）。1.6無菌均質袋：尺寸180×320×0.091.7無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.8精密pH試紙。2培養(yǎng)基和試劑：下面所用培養(yǎng)基，如需調整pH值，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調2.17.5%氯化鈉肉湯：制法：稱取7.5%氯化鈉肉湯90g于1L蒸餾水中，調pH值為7.4±0.2，121℃高壓滅菌15min后，冷卻后放入冰箱備用。2.2血瓊脂平板2.3Baird-Parker瓊脂平板：制法：稱取63.0g于1L蒸餾水中，加熱煮佛至完全溶解，調pH值為7.0±0.2，121℃高壓滅菌15min后，冷至50℃時，每95ml加入1支亞碲酸鉀卵黃增菌液，混勻后傾注平板后放入冰箱備用。2.4腦心浸出液肉湯（BHI）：制法：稱取24.5g于1L蒸餾水中，加熱煮佛至完全溶解，調pH值為7.4±0.2，分裝試管，每管5ml，121℃高壓滅菌15min備用。2.5CM304凍干兔血漿：用途：用于金黃色葡萄球菌的血漿凝固酶試驗。用法：每支安瓿瓶中加入0.5ml滅菌生理鹽水，至完全溶解；然后，挑取可疑菌落溶入混勻或（加入0.3ml菌懸液混勻后），置36℃±1℃培養(yǎng)，在6h內定時觀察結果。2.6革蘭氏染色液2.7無菌生理鹽水：。制法：稱取8.5制法：稱取8.5g氯化鈉溶于1000ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌30min。3操作步驟3.1樣品的處理：3.1.1樣品：稱取25g樣品置盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質袋內，混合均勻。3.2增菌和分離培養(yǎng)：3.2.1將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)18h—24h。3.2.2將上述培養(yǎng)物，在生物安全柜內分別用三區(qū)法劃線接種到Baird-Parker平板和血平板上，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h—24h，Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h—24h或45h—48h。（使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。）3.3菌落形態(tài)：金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm—3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑去上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。4鑒定：4.1染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5m～1m。4.1.1染色流程：初染→媒染→脫色→復染→鏡檢。①取一干凈的載玻片，滴一滴蒸餾水，再向蒸餾水中挑取一環(huán)可疑菌落，涂抹均勻，將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；②初染：用結晶紫染色1min—2min后用蒸餾水沖洗至洗出液為無色再將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；③媒染：用碘液媒染約1min后用蒸餾水洗干凈再將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；④脫色：用95％乙醇脫色20s—30s后用蒸餾水洗干凈再將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；⑤⑤復染：用沙黃復染約2min左右后用蒸餾水洗干凈再將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；⑥鏡檢：最后在顯微鏡下用油鏡觀察，判斷菌體染色反應性。4.2血漿凝固酶試驗：挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上接種到5mLBHI中，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取凍干兔血漿1支加入0.5mL滅菌生理鹽水，充分溶解，再加入BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL搖勻，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結果。5結果與報告：5.1結果判定：符合4.3，5.1和5.2，可判定為金黃色葡萄球菌。5.2結果報告：在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。6注意事項：6.1一般干粉培養(yǎng)基應密封保存于陰涼干燥處，Baird-Parker傾到好的平板應在48h內使用。其他配制好的藥品無特殊要求可直接保存于冰箱中。6.2買來的血平板需放到冰箱中2℃—8℃避光冷藏存放。6.3劃線接種時，接種環(huán)燒紅為滅菌徹底。前增菌以后的工作需在生物安全柜中進行。6.4在實驗過程中若有菌液不慎灑出先用75%酒精棉球擦拭干凈，實驗完后用3%甲酚皂溶液擦拭消毒。并應定期對無菌室進行清洗消毒。6.5已經(jīng)開袋的均質袋應保存于無菌室內，并盡快使用，避免污染。6.6將已挑取菌落平板保存于2～5℃的冰箱內，至少保留24h以備必要時復查。6.6廢棄的培養(yǎng)液和培養(yǎng)基需經(jīng)高壓滅菌鍋121℃滅菌30min后再廢棄或清洗。6.7脫色是革蘭染色操作的關鍵環(huán)節(jié)，以免脫色不完全造成假陽性；脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時間一般為20s—30s。7.備注本方法參考國標GB4789.10-2010。阪崎腸桿菌的測定阪崎腸桿菌的測定1設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：1.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，44℃±0.5℃，25℃±1℃，30℃±1℃。1.2冰箱：2℃～5℃。1.3恒溫水浴箱：44℃±0.5℃。1.4天平：感量0.1g。1.5無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。1.6無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.7無菌錐形瓶：容量100mL、1000mL。1.8無菌均質袋：尺寸180×320×0.091.9精密pH試紙。1.10接種環(huán)。1.11礦物油（液體石蠟）。1.12無菌吸管。1.13氧化酶測定試劑盒。1.14API20E試條。2培養(yǎng)基和試劑2.1緩沖蛋白胨水（bufferpeptonewater，BPW）：制法：稱取20g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.2±0.2，121℃高壓滅菌15min后取出。2.2改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm）：制法：稱取64.6g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至6.8±0.2，121℃高壓滅菌15min后取出。臨用前每100mL基礎無菌加入P-08B萬古霉素1支，共配制3個100mL。2.3阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基：制法：稱取45.33g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.3±0.2（25℃），121℃高壓滅菌3min后取出，冷卻至50℃鋪制平板備用。2.42.4胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticasesoyagar，TSA）：制法：稱取38g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節(jié)PH至7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min后取出，冷卻至50℃鋪制平板備用。2.5API20E試條2.60.85%氯化鈉培養(yǎng)基：制法：稱取8.5g于1L蒸餾水中，121℃高壓滅菌30min.2.7無菌蒸餾水3操作步驟3.1前增菌3.1.1固體和液體：取三個檢樣各100g（mL）加入已預熱至44℃裝有900mL緩沖蛋白胨水的均質袋中，用手緩緩地搖動至充分溶解，36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。3.1.2物體表面：將檢樣混勻后，于36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。3.2增菌3.2.1固體和液體：移取10mL轉種于100mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。3.2.2物體表面：移取1mL轉種于10mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。3.3分離3.3.1輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，各取增菌培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。3.3.2挑取1個～5個可疑菌落（藍綠色），劃線接種于TSA平板上。25℃±1℃培養(yǎng)18-24h用于氧化酶試驗的測定，培養(yǎng)48h±4h用于生化鑒定中其他試驗的測定。3.4鑒定3.4.1氧化酶試驗（OX）：拿住安瓿瓶中間，輕按將安瓿瓶壓破，準確加1滴試劑到空白紙片上（如稱量紙），用無菌塑料吸管挑取TSA平板上黃色可疑菌落與紙片的試劑中，觀察結果，結果根據(jù)以下結果判讀表判讀。3.4.2API20E試條的接種：自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落與5mL0.85%氯化鈉培養(yǎng)基中制成菌懸液備用。在API20E培養(yǎng)盤中加入約5mL無菌蒸餾水與盤的蜂窩小凹中，造造成一個濕室。將試條置于盤中用無菌吸管加入菌懸液，其中：CIT、VP和GEL小管菌液需充滿管部和杯部，其它管僅充滿管部；在試驗ADH、LDC、ODC、H2S、URE小杯內加入礦物油以形成厭氧環(huán)境。蓋上培養(yǎng)盒，于36℃±2℃孵育18