連續(xù)培養(yǎng)的基本原理課件

第六章連續(xù)培養(yǎng)的基本原理第一節(jié)微生物生長(zhǎng)的基本特征微生物的種類（可分為三大類）：Ⅰ、非細(xì)胞型微生物（病毒）；Ⅱ、原核細(xì)胞型微生物，僅有原始細(xì)胞核，如細(xì)菌、放線菌等；Ⅲ、真核細(xì)胞型微生物，霉菌、酵母菌和單細(xì)胞藻類，原生動(dòng)物。

微生物的作用：

微生物是生物反應(yīng)過程的催化劑，催化原料轉(zhuǎn)化為有用的產(chǎn)品；微生物如同一個(gè)微小的容器，原料中的反應(yīng)物透過微生物細(xì)胞周圍的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入微生物體內(nèi)，把反應(yīng)物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，接著這些產(chǎn)物又被釋放出來。

一、生長(zhǎng)現(xiàn)象與繁殖方式

微生物可分為成三大類：Ⅰ、非細(xì)胞型微生物學(xué)（病毒）；Ⅱ、是原核細(xì)胞型微生物，僅有原始細(xì)胞核，如細(xì)菌、放線菌等；Ⅲ、是真核細(xì)胞型微生物，霉菌、酵母菌和單細(xì)胞藻類，原生動(dòng)物。

微生物細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中的變化：

其形態(tài)、組成、活性都處在動(dòng)態(tài)變化過程中，使其經(jīng)歷生長(zhǎng)、繁殖、維持、死亡等階段。并使反應(yīng)系統(tǒng)中的環(huán)境條件也處在動(dòng)態(tài)變化之中。微生物細(xì)胞的基本組成：蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、核酸等。

二、生長(zhǎng)的測(cè)定

微生物生長(zhǎng)的測(cè)定，通常是測(cè)群體的重量或細(xì)胞數(shù)，而不是測(cè)細(xì)胞個(gè)體的重量或大小。生長(zhǎng)測(cè)定的常用理化方法，分為測(cè)定細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞重量?jī)深悺?、計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法濁度計(jì)比濁法測(cè)定稀的細(xì)胞懸液的透光量，間接測(cè)出細(xì)胞數(shù)量的生長(zhǎng)計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)器直接數(shù)出酵母菌或霉菌孢子數(shù)目，以及用細(xì)菌計(jì)數(shù)片直接測(cè)出細(xì)菌數(shù)的生長(zhǎng)2、測(cè)定細(xì)胞重量

細(xì)胞干重稱量法直接測(cè)定單位體積培養(yǎng)物的細(xì)胞干重，由此代表菌體細(xì)胞物質(zhì)總量的生長(zhǎng)細(xì)胞堆積容積測(cè)量法

用錐形刻度管測(cè)量經(jīng)離心的細(xì)胞沉淀物的容積，由此間接表示細(xì)胞重量的生長(zhǎng)細(xì)胞組成分析法測(cè)定一種大分子的細(xì)胞組成(蛋白質(zhì)、RNA、DNA等)，間接地算出細(xì)胞重量的生長(zhǎng)

第二節(jié)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

什么是微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)？微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)是研究微生物生長(zhǎng)過程的速率及其影響速率的各種因素，從而獲得相關(guān)信息。微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)可反映細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化的能力。

一、微生物生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞的生長(zhǎng)過程可以用細(xì)胞濃度的變化來描述和表達(dá)。若取細(xì)胞濃度的對(duì)數(shù)值與細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)應(yīng)作圖，可得到分批培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞濃度變化曲線。二、微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)1、比生長(zhǎng)速率specificgrowthrate若細(xì)胞物質(zhì)或細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)一倍的時(shí)間間隔是常數(shù)，則微生物是以指數(shù)速率增長(zhǎng)，可用數(shù)學(xué)模型來描述。（1）

（2）

式（1）表明，細(xì)胞物質(zhì)隨時(shí)間的增加而增加式（2）表明，細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間的增加而增加當(dāng)微生物處在最高的生長(zhǎng)時(shí)期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物過量，此時(shí)生長(zhǎng)速率與營養(yǎng)物濃度無關(guān)，而與細(xì)胞濃度有關(guān)，其關(guān)系表現(xiàn)為微生物細(xì)胞濃度（以重量表示）的瞬時(shí)增長(zhǎng)速率dX/dt和培養(yǎng)液中微生物細(xì)胞濃度X成正比，或任一瞬間生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比。若μ為常數(shù)，則：

對(duì)式（1）積分得：

在大多數(shù)情況下，生長(zhǎng)是以物質(zhì)的增加衡量的，因而得到應(yīng)用。此式可在△t=td（td為倍增時(shí)間）時(shí)求得，td即在時(shí)所需時(shí)間，于是td=ln2/μ=0.693/μ。

為比生長(zhǎng)速率，單位是h-1。對(duì)式（2）積分得：

lgNt-lgN0=μ(t1-t0)/2.303例題1：某微生物的＝0.125h-1，求td。2：N0時(shí)每ml培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)為104，經(jīng)過4小時(shí)后該培養(yǎng)液中細(xì)菌的數(shù)目增加到108，求此條件下細(xì)菌的比生長(zhǎng)速率（μ）μ=(lgNt-lgN0)/(t1-t0)2.303=(8-4)/42.303/h=2.303h-1代表在該條件下，每個(gè)細(xì)菌以每小時(shí)增加2.303個(gè)細(xì)菌的速度增加

比生長(zhǎng)速率的意義

比生長(zhǎng)速率是菌體繁殖速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比，它與微生物的生命活動(dòng)有聯(lián)系

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，是一個(gè)常數(shù)，這時(shí)

Monod方程是典型的均衡生長(zhǎng)模型，其基本假設(shè)如下：①細(xì)胞的生長(zhǎng)為均衡式生長(zhǎng)，因此描述細(xì)胞生長(zhǎng)的唯一變量是細(xì)胞的濃度；②培養(yǎng)基中只有一種基質(zhì)是生長(zhǎng)限制性基質(zhì)，而其它組分為過量，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)；③

細(xì)胞的生長(zhǎng)視為簡(jiǎn)單的單一反應(yīng)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率為一常數(shù)。

Monod方程中為比生長(zhǎng)速率(h-1)；為最大比生長(zhǎng)速率(h-1)，S為限制性基質(zhì)濃度(g／L)；Ks為飽和常數(shù)(g/L)，其值等于比生長(zhǎng)速率為最大比生長(zhǎng)速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。

當(dāng)一種限制性營養(yǎng)物濃度S大大低于Ks時(shí)，μ=μmaxS/Ks，即μ很小，此時(shí)生長(zhǎng)很慢當(dāng)S=Ks時(shí)，μ=0.5μmax，隨營養(yǎng)物濃度增加，μ相應(yīng)增加，逐漸趨向μmax，μ成為營養(yǎng)物濃度的重要函數(shù)，此時(shí)營養(yǎng)物濃度仍是生長(zhǎng)的限制因素，在Monod模型上表現(xiàn)為曲線當(dāng)S無限大時(shí)，μμmax，理論上最大潛力

當(dāng)營養(yǎng)物濃度S大大高于Ks時(shí)，營養(yǎng)物濃度不再影響微生物生長(zhǎng)，即S的變化不再成為生長(zhǎng)限制因素，此時(shí)，μ接近μmax，在Monod曲線上表現(xiàn)為直線在分批培養(yǎng)時(shí)，Ks表示微生物對(duì)營養(yǎng)物的親和力，在一定營養(yǎng)條件下，Ks越小，微生物對(duì)限制性營養(yǎng)物的親和力越大，限制性營養(yǎng)物的濃度必須降低到十分低的水平，才能影響微生物的生長(zhǎng)，Ks越大，親和力越小，即使限制性營養(yǎng)物濃度很高，生長(zhǎng)率也下降將Monod方程變?yōu)椴⒆鲌D。通過該圖，即可以獲得兩個(gè)重要的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。Ks和μm值隨菌種、限制性基質(zhì)種類的變化微生物限制生長(zhǎng)基質(zhì)Ksμm（hr）大腸桿菌葡萄糖0.22--大腸桿菌乳糖0.58--啤酒酵母乳糖2.6~3.00.18啤酒酵母葡萄糖0.56--纖維素分解菌葡萄糖0.860.125固氮菌葡萄糖0.16~0.330.13青霉菌氧氣0.0070.35Monod方程雖然表述簡(jiǎn)單，但它不足以完整地說明復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，并且已發(fā)現(xiàn)它在某些情況與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，因此人們又提出了另外一些方程,歸納于下表

單基質(zhì)限制的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型第三節(jié)連續(xù)培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)及連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中，絕大多數(shù)的培養(yǎng)采用純種液體培養(yǎng)方法,其操作方法主要有:間歇培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和流加培養(yǎng)三種。連續(xù)培養(yǎng)是在1949年莫諾建立的，在連續(xù)培養(yǎng)中，將新鮮的培養(yǎng)基連續(xù)地加入有均勻培養(yǎng)液的反應(yīng)器中，同時(shí)排出發(fā)酵液，使培養(yǎng)環(huán)境不隨時(shí)間變化而改變，保持培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)，并可以維持一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間。一、單級(jí)恒化器及其操作特征恒化器：指具有恒定化學(xué)環(huán)境的反應(yīng)器。在培養(yǎng)過程中，可靈活的制造多種培養(yǎng)環(huán)境來研究微生物生長(zhǎng)、發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)特征。物料衡算：對(duì)于菌體：積累的細(xì)胞=（進(jìn)入–流出）的細(xì)胞+（生長(zhǎng)-死亡）的細(xì)胞即：dx/dt=(u-D)x對(duì)于限制性底物：積累的底物=（進(jìn)入-流出）的底物-（生長(zhǎng)+形成產(chǎn)物+維持代謝）所消耗的底物即：ds/dt=D(s0-s)-(u/Yx/s+rp/Yp/s+ms)x對(duì)于產(chǎn)物：積累的產(chǎn)物=（生成-流出）的產(chǎn)物即：dp/dt=rp·x-D·p當(dāng)培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，反應(yīng)器中的菌體、底物、產(chǎn)物的積累量為零，即：

dx/dt=ds/dt=dp/dt=0則單級(jí)恒化器在穩(wěn)態(tài)條件下的物料衡算方程為：菌體：D-u=0底物：D(s0-s)-(D/Yx/s+rp/Yp/s+ms)x=0產(chǎn)物：rp·x-D·p=0若在培養(yǎng)微生物菌體的特定連續(xù)培養(yǎng)過程中存在：1）培養(yǎng)過程無產(chǎn)物形成，或形成得很少，忽略不計(jì)；2）維持代謝所消耗的底物很少，忽略不計(jì)。則：D=u;x=Yx/s(s0-s)代入莫諾方程：s=Ks·u/um-u整理后得：x=Yx/s(

s0-Ks·D/um-D)若上式D→um,s→s0,x→0時(shí)臨界稀釋率：DcritDcrit=um·s0/Ks+s0通常：Dcrit=um說明：用單級(jí)恒化器連續(xù)培養(yǎng)菌體的穩(wěn)態(tài)操作有D＜Dcrit，而當(dāng)D≥Dcrit時(shí)，反應(yīng)器中菌體濃度終將全部被洗出。參見書P113的例6-2二、部分菌體再循環(huán)的單級(jí)恒化器指連續(xù)分離單級(jí)恒化器流出的培養(yǎng)液，然后將分離后的部分菌體再接入反應(yīng)器中。優(yōu)點(diǎn)：提供了連續(xù)接種手段；增加了培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；實(shí)現(xiàn)了在較高的稀釋率下，D＞Dcrit；大大提高了單位體積反應(yīng)器的反應(yīng)效率物料衡算：對(duì)于菌體：積累的細(xì)胞=（進(jìn)入-流出）的細(xì)胞+由循環(huán)液流入的細(xì)胞即：dx/dt=ux-[1+δ(1-γ)]x對(duì)于限制性底物：積累的底物=（進(jìn)入-流出）的底物-消耗的底物+由循環(huán)液進(jìn)入的底物即：ds/dt=D(s0-s)-u·x/Yx/s當(dāng)培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，dx/dt=ds/dt=0，則：U=D[1+δ(1-γ)];x=Yx/SD/u(s0-s)引入循環(huán)濃縮因子R=1+δ(1-γ)，0＜R＜1針對(duì)莫諾方程：有x=1/R·Yx/s(s0-Ks·R·D/um-R·D)說明：在部分菌體再循環(huán)的單級(jí)恒化器中，穩(wěn)定狀態(tài)下的菌體濃度x比沒有菌體再循環(huán)的大一個(gè)1/R因子。根據(jù)臨界稀釋率Dcrit的定義，則再循環(huán)下的臨