基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件

基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件1外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞7基因的體外重組與轉(zhuǎn)化外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連27基因的體外重組與轉(zhuǎn)化1DNA片段的體外連接2重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞3重組噬菌體DNA的體外包裝與轉(zhuǎn)導(dǎo)4重組克隆載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染7基因的體外重組與轉(zhuǎn)化1DNA片段的體外連接23重組過程中，需要考慮的因素：（1）連接效率高、易于篩選；（2）便于回收外源基因；（3）在載體的啟動(dòng)子控制之下，并置于正確的閱讀框之中，以便表達(dá)?；虻闹亟M是依賴于限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和修飾酶的作用，分別對外源基因和載體進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將外源基因和載體巧妙地連接在一起。重組過程中，需要考慮的因素：基因的重組是依賴于限制性內(nèi)切酶、41DNA片段的體外連接一、粘性末端的連接二、平末端的連接三、PCR產(chǎn)物的連接四、體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)五、體外連接的結(jié)果體外連接1DNA片段的體外連接一、粘性末端的連接二、平末端的連接5DNA連接酶：由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子。；只能連接粘性末端T4DNA連接酶：

由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。1970年：容易制備，而且可以連接平末端DNA分子及單鏈DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中應(yīng)用廣泛。DNA連接酶：由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能6ＤＮＡ連接酶ＤＮＡ連接酶7基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件8一、粘性末端的連接利用粘性末端單鏈間的堿基互補(bǔ)，并用DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。一、粘性末端的連接利用粘性末端單鏈間的堿基互補(bǔ)，并用DNA連91.兩段DNA的連接依靠粘性末端1.兩段DNA的連接依靠粘性末端102.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端113.載體與載體的連接3.載體與載體的連接12二、平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

二、平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近131972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚物加尾法

2.人工加尾形成“粘性末端”

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaise14④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點(diǎn)④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。15用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)16

17

18④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也19（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大20Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH21基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件22接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。23堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的濃度，增加重組子比例。這樣就會(huì)出現(xiàn)ＤＮＡ自生連接問題，為此通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其５’末端的磷酸基，防止環(huán)化，通過接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的24載體自連及去磷酸化示意圖載體自連及去磷酸化示意圖25常用堿性磷酸酶BAP（大腸桿菌）CIP(小牛腸)分子量80,000溫度60℃—65℃最適PH8.0熱穩(wěn)定性好，100℃暫時(shí)性失活，室溫放置可恢復(fù)活性，苯酚完全失活分子量100,000溫度37℃最適PH10.0附近（高底物濃度）PH8.0附近（低底物濃度）65℃30分鐘處理99％的活性不可逆失活，隨具體條件改變有變動(dòng)，完全失活苯酚處理常用堿性磷酸酶BAP（大腸桿菌）CIP(小牛腸)分子量80265‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP處理-OHHO-5‘p-GATCCCGG-OHP-CCGG-OH27Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’HO-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH28基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件29連接體系載體DNA50ng0.5ul目的DNA19ng?ul雙蒸水?ul5ul連接反應(yīng)液（2×）5ul總體積10ul用加樣器柔和吹打混勻,16℃連接2小時(shí)。附注：載體和目的基因的摩爾比為1:350ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb6.3ng*3=19ng連接體系載體DNA301.載體和插入片段的摩爾濃度比載體：插入片段的摩爾數(shù)的變化范圍可為8：1到1：16，但通常的變化范圍是3：1到1：3。在最小的反應(yīng)體積中，通常一個(gè)連接反應(yīng)用10-50ng的載體DNA。2.平末端連接在22℃保溫4-16小時(shí)，粘性末端在22℃保溫3小時(shí)，或16℃保溫16小時(shí)。大多數(shù)連接反應(yīng)用T4DNA連接酶，但大腸桿菌的DNA連接酶可用于粘性末端的連接，平末端連接時(shí)用此酶，活力較低。3.載體和插入片段的純度應(yīng)較高，溶解的溶劑最好使用滅菌的雙蒸水而不是TE，畢竟TE中含有離子，可能影響連接反應(yīng)。連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問題1.載體和插入片段的摩爾濃度比載體：插入片段的摩爾數(shù)的變化31三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識(shí)別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護(hù)堿基）避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體32引物1GCAGAATTC

互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’

GCAGAATTC

互補(bǔ)序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互補(bǔ)序列PCR產(chǎn)物5’--3’

3’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

引物1GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--33GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’

3-’

5’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物

互補(bǔ)序列-5’

3’-引物2GCTAGCCGG互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’334帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTCPCR產(chǎn)物5’--352.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有一個(gè)ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個(gè)3’端人為地各加一個(gè)T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在平端載體上添加T！2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有一個(gè)36AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATAAAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物T37四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相38EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾392.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不403.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入414.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’

3’

載體插入片斷4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體42五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果431.載體自身環(huán)化連接2.載體之間互相連接3.插入片段互相連接4.一個(gè)載體與幾個(gè)插入片段重組五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組7（能存活）（能存活）（不能存活）（能存活）（能存活）1.載體自身環(huán)化連接2.載體之間互相連接3.插入片段互44

1972年，美國斯坦福大學(xué)的伯格（P.Berg）等人于把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來，構(gòu)成了一個(gè)重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。1972年，美國斯坦福大學(xué)的伯格（P.Berg）等人45美國總統(tǒng)國家科學(xué)獎(jiǎng)中國科學(xué)院愛因斯坦講席教授、美國國家科學(xué)院院士、美國斯坦福大學(xué)教授斯坦利?科恩(StanleyN.Cohen)美國總統(tǒng)國家科學(xué)獎(jiǎng)中國科學(xué)院愛因斯坦講席教授、美國國家科學(xué)46StanleyCohen教授發(fā)明該專利時(shí)的筆記照片-重組DNA專利從批準(zhǔn)該專利到該專利1997年12月2日失效的17年中，該專利一共許可了468家公司，兩所大學(xué)共獲得了許可費(fèi)收入約2.55億美元。

StanleyCohen教授發(fā)明該專利時(shí)的筆記照片-重組D472

重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌1.熱休克法2.電轉(zhuǎn)化法4.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法2重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組DN48重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化49

由流動(dòng)鑲嵌模型發(fā)展而來的生物膜結(jié)構(gòu)模型由流動(dòng)鑲嵌模型發(fā)展而來的生物膜結(jié)構(gòu)模型50黑膜試驗(yàn)黑膜試驗(yàn)51不同分子通過無膜蛋白的人工脂雙層不同分子通過無膜蛋白的人工脂雙層521.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備1.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備53

原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）1)受體細(xì)胞的選擇限制缺陷型:

避免修飾和降解重組缺陷型：

避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型：

較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補(bǔ)型：

利于篩選感染缺陷型：

防止感染實(shí)驗(yàn)中使用的受體細(xì)胞為大腸桿菌DH5alpha菌株。原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）1)受體細(xì)胞的選擇限制缺陷型:54使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.55基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件56用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理57CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性改變CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性改變58CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2594.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.5Onice5-10min4℃離心3000g10min收集菌用冰冷的50mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的50mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的50mMCaCl2重懸（15%甘油）3離心3重懸2冰浴4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.5Onice560CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞流程１．將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)16～20小時(shí)。２．挑取單菌落轉(zhuǎn)入10mlLB培養(yǎng)基（100ml-胰蛋白胨1g，酵母提取液0.5g，NaCl1g，dH2O）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。３．從中吸取1ml轉(zhuǎn)入50mlLB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)，測OD600達(dá)0.4～0.6。４．培養(yǎng)物在冰浴中放置10分鐘。５．取1.5ml加入預(yù)冷的Eppendorf管中，于5000rpm下室溫離心2--5分鐘。６．棄上清，加入1ml用冰預(yù)冷的0.05MCaCl2，混勻，置冰上10分鐘。７．5000rpm4℃離心10分鐘，棄上清，加100ul0.05MCaCl2重懸，置冰浴備用或于4℃短期保存。８．若欲將制備的感受態(tài)細(xì)胞長期保存，將制備的細(xì)胞重懸于含有15％甘油的0.05MCaCl2中，放入-80℃冰箱或液氮中凍存。。CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞流程１．將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上61轉(zhuǎn)化-熱激發(fā)取制備好的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰浴上；向感受態(tài)細(xì)胞中加入連接產(chǎn)物（不超過轉(zhuǎn)化體系的1/10體積），柔和混勻后冰浴上放置30min；將連接體系放入42℃水浴中熱激90sec；迅速轉(zhuǎn)入冰浴2min；加入0.8mlLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min；取適量培養(yǎng)物涂布于Amp+LB固體培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化-熱激發(fā)取制備好的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰浴上；62轉(zhuǎn)化示意圖轉(zhuǎn)化示意圖631. 0℃的CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)；2.加入DNA，Ca2+又與DNA結(jié)合形成羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上；3.經(jīng)短暫的42℃熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。1. 0℃的CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca264二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformat65每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法

2.轉(zhuǎn)化率簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（2）電轉(zhuǎn)化法每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法2.6610ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置67電擊法(Genetransferbyelectroporation)（2）高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法電擊法(Genetransferbyelectrop68LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L

電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F

脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化法步驟：LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°694.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的70用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化71環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接:干擾因素②線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒

5.影響轉(zhuǎn)化率的因素環(huán)形重組質(zhì)粒②線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形72①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞

（competentcells)①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的73把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。（1）體外包裝（invitropackaging）

（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。3

重組噬菌體DNA的體外包裝與轉(zhuǎn)導(dǎo)把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染74基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件75cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。

但當(dāng)溫度升高到44℃—45℃時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體

但由于該噬菌體的S基因上有一個(gè)突變，所以細(xì)菌還不裂解。cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在3276cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA77噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（4）

互補(bǔ)型噬菌體

外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體2噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但78(5)體外包裝過程

(5)體外包裝過程79體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

轉(zhuǎn)導(dǎo)

7體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌804重組克隆載體導(dǎo)入真核細(xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞二、導(dǎo)入植物細(xì)胞三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞外源基因?qū)胝婧思?xì)胞4重組克隆載體導(dǎo)入真核細(xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞二、導(dǎo)入植物細(xì)胞81轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）；不育的菌株（不會(huì)與其他酵母接合）。一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31轉(zhuǎn)化率高的菌株；一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura382（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)球感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。

轉(zhuǎn)化（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法酵母原生質(zhì)83原生質(zhì)球(Spheroplast)指細(xì)胞壁未被全部去掉的細(xì)菌細(xì)胞，它呈圓球狀，可以人為地通過溶菌酶或青霉素處理革蘭氏陰性細(xì)菌而獲得。該類菌細(xì)胞壁肽聚糖雖被除去，但外壁層中脂多糖、脂蛋白仍然保留，外壁的結(jié)構(gòu)尚存。所以，原生質(zhì)球較之原生質(zhì)體對外界環(huán)境具一定抗性，并能在普通培養(yǎng)基上生長。原生質(zhì)球(Spheroplast)指細(xì)胞壁未被全部去掉的84

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感85葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1.葉盤法（leafdisk)葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入86植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液電轉(zhuǎn)儀1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electroporation)植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液電轉(zhuǎn)儀87又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入3.基因槍法（genegun）又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicr88基因槍法(Biolistic-bombardment)支撐板基因槍法(Biolistic-bombardment)支撐板894.農(nóng)桿菌（agrobacterium）介導(dǎo)4.農(nóng)桿菌（agrobacterium）介導(dǎo)90基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件91（1）原理：三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法HEPES[4-羥乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸]緩沖鹽水（將1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027gNa2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖(glucanordextran)和1gHEPES溶解在90ml的蒸餾水，用0.5MNaOH調(diào)節(jié)至所需pH值，再用蒸餾水定容至100ml即可。）與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會(huì)形成含磷酸鈣和DNA的沉淀。依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有10%的細(xì)胞能吸收DNA沉淀。（1）原理：三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法HEPES92（2）特點(diǎn)：（2）特點(diǎn)：93脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如LifeTechnologies）。2.脂質(zhì)體（lipofectin）載體法脂類包埋DNA，通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如LifeTechnologies）。94直接把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。3.顯微注射法(microinjection)直接把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。3.95二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入外源DNA。4.DEAE---葡萄糖傳染法葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到細(xì)胞表面后被細(xì)胞吞入，部分DNA可以進(jìn)入到細(xì)胞核里。二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）96DEAE-dextran細(xì)胞外源DNA預(yù)處理攝入DEAE-dextran外源DNA細(xì)胞混合DEAE-dextran對細(xì)胞有毒!5.病毒（virus）介導(dǎo)DEAE-dextran細(xì)胞外源DNA預(yù)處理攝入DEAE-d97外源基因?qū)爰?xì)胞的方法7外源基因?qū)爰?xì)胞的方法798演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！99基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件100外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞7基因的體外重組與轉(zhuǎn)化外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連1017基因的體外重組與轉(zhuǎn)化1DNA片段的體外連接2重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞3重組噬菌體DNA的體外包裝與轉(zhuǎn)導(dǎo)4重組克隆載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染7基因的體外重組與轉(zhuǎn)化1DNA片段的體外連接2102重組過程中，需要考慮的因素：（1）連接效率高、易于篩選；（2）便于回收外源基因；（3）在載體的啟動(dòng)子控制之下，并置于正確的閱讀框之中，以便表達(dá)。基因的重組是依賴于限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和修飾酶的作用，分別對外源基因和載體進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將外源基因和載體巧妙地連接在一起。重組過程中，需要考慮的因素：基因的重組是依賴于限制性內(nèi)切酶、1031DNA片段的體外連接一、粘性末端的連接二、平末端的連接三、PCR產(chǎn)物的連接四、體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)五、體外連接的結(jié)果體外連接1DNA片段的體外連接一、粘性末端的連接二、平末端的連接104DNA連接酶：由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子。；只能連接粘性末端T4DNA連接酶：

由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。1970年：容易制備，而且可以連接平末端DNA分子及單鏈DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中應(yīng)用廣泛。DNA連接酶：由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能105ＤＮＡ連接酶ＤＮＡ連接酶106基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件107一、粘性末端的連接利用粘性末端單鏈間的堿基互補(bǔ)，并用DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。一、粘性末端的連接利用粘性末端單鏈間的堿基互補(bǔ)，并用DNA連1081.兩段DNA的連接依靠粘性末端1.兩段DNA的連接依靠粘性末端1092.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端1103.載體與載體的連接3.載體與載體的連接111二、平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

二、平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近1121972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚物加尾法

2.人工加尾形成“粘性末端”

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaise113④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點(diǎn)④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。114用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)115

116

117④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也118（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大119Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH120基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件121接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。122堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的濃度，增加重組子比例。這樣就會(huì)出現(xiàn)ＤＮＡ自生連接問題，為此通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其５’末端的磷酸基，防止環(huán)化，通過接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的123載體自連及去磷酸化示意圖載體自連及去磷酸化示意圖124常用堿性磷酸酶BAP（大腸桿菌）CIP(小牛腸)分子量80,000溫度60℃—65℃最適PH8.0熱穩(wěn)定性好，100℃暫時(shí)性失活，室溫放置可恢復(fù)活性，苯酚完全失活分子量100,000溫度37℃最適PH10.0附近（高底物濃度）PH8.0附近（低底物濃度）65℃30分鐘處理99％的活性不可逆失活，隨具體條件改變有變動(dòng)，完全失活苯酚處理常用堿性磷酸酶BAP（大腸桿菌）CIP(小牛腸)分子量801255‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP處理-OHHO-5‘p-GATCCCGG-OHP-CCGG-OH126Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’HO-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH127基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件128連接體系載體DNA50ng0.5ul目的DNA19ng?ul雙蒸水?ul5ul連接反應(yīng)液（2×）5ul總體積10ul用加樣器柔和吹打混勻,16℃連接2小時(shí)。附注：載體和目的基因的摩爾比為1:350ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb6.3ng*3=19ng連接體系載體DNA1291.載體和插入片段的摩爾濃度比載體：插入片段的摩爾數(shù)的變化范圍可為8：1到1：16，但通常的變化范圍是3：1到1：3。在最小的反應(yīng)體積中，通常一個(gè)連接反應(yīng)用10-50ng的載體DNA。2.平末端連接在22℃保溫4-16小時(shí)，粘性末端在22℃保溫3小時(shí)，或16℃保溫16小時(shí)。大多數(shù)連接反應(yīng)用T4DNA連接酶，但大腸桿菌的DNA連接酶可用于粘性末端的連接，平末端連接時(shí)用此酶，活力較低。3.載體和插入片段的純度應(yīng)較高，溶解的溶劑最好使用滅菌的雙蒸水而不是TE，畢竟TE中含有離子，可能影響連接反應(yīng)。連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問題1.載體和插入片段的摩爾濃度比載體：插入片段的摩爾數(shù)的變化130三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識(shí)別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護(hù)堿基）避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體131引物1GCAGAATTC

互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’

GCAGAATTC

互補(bǔ)序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互補(bǔ)序列PCR產(chǎn)物5’--3’

3’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

引物1GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--132GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’

3-’

5’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物

互補(bǔ)序列-5’

3’-引物2GCTAGCCGG互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’3133帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTCPCR產(chǎn)物5’--1342.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有一個(gè)ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個(gè)3’端人為地各加一個(gè)T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在平端載體上添加T！2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有一個(gè)135AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATAAAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物T136四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相137EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾1382.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不1393.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入1404.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’

3’

載體插入片斷4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體141五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果1421.載體自身環(huán)化連接2.載體之間互相連接3.插入片段互相連接4.一個(gè)載體與幾個(gè)插入片段重組五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組7（能存活）（能存活）（不能存活）（能存活）（能存活）1.載體自身環(huán)化連接2.載體之間互相連接3.插入片段互143

1972年，美國斯坦福大學(xué)的伯格（P.Berg）等人于把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來，構(gòu)成了一個(gè)重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。1972年，美國斯坦福大學(xué)的伯格（P.Berg）等人144美國總統(tǒng)國家科學(xué)獎(jiǎng)中國科學(xué)院愛因斯坦講席教授、美國國家科學(xué)院院士、美國斯坦福大學(xué)教授斯坦利?科恩(StanleyN.Cohen)美國總統(tǒng)國家科學(xué)獎(jiǎng)中國科學(xué)院愛因斯坦講席教授、美國國家科學(xué)145StanleyCohen教授發(fā)明該專利時(shí)的筆記照片-重組DNA專利從批準(zhǔn)該專利到該專利1997年12月2日失效的17年中，該專利一共許可了468家公司，兩所大學(xué)共獲得了許可費(fèi)收入約2.55億美元。

StanleyCohen教授發(fā)明該專利時(shí)的筆記照片-重組D1462

重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌1.熱休克法2.電轉(zhuǎn)化法4.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法2重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組DN147重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化148

由流動(dòng)鑲嵌模型發(fā)展而來的生物膜結(jié)構(gòu)模型由流動(dòng)鑲嵌模型發(fā)展而來的生物膜結(jié)構(gòu)模型149黑膜試驗(yàn)黑膜試驗(yàn)150不同分子通過無膜蛋白的人工脂雙層不同分子通過無膜蛋白的人工脂雙層1511.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備1.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備152

原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）1)受體細(xì)胞的選擇限制缺陷型:

避免修飾和降解重組缺陷型：

避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型：

較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補(bǔ)型：

利于篩選感染缺陷型：

防止感染實(shí)驗(yàn)中使用的受體細(xì)胞為大腸桿菌DH5alpha菌株。原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）1)受體細(xì)胞的選擇限制缺陷型:153使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.154基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件155用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理156CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性改變CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性改變157CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl21584.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.5Onice5-10min4℃離心3000g10min收集菌用冰冷的50mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的50mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的50mMCaCl2重懸（15%甘油）3離心3重懸2冰浴4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.5Onice5159CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞流程１．將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)16～20小時(shí)。２．挑取單菌落轉(zhuǎn)入10mlLB培養(yǎng)基（100ml-胰蛋白胨1g，酵母提取液0.5g，NaCl1g，dH2O）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。３．從中吸取1ml轉(zhuǎn)入50mlLB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)，測OD600達(dá)0.4～0.6。４．培養(yǎng)物在冰浴中放置10分鐘。５．取1.5ml加入預(yù)冷的Eppendorf管中，于5000rpm下室溫離心2--5分鐘。６．棄上清，加入1ml用冰預(yù)冷的0.05MCaCl2，混勻，置冰上10分鐘。７．5000rpm4℃離心10分鐘，棄上清，加100ul0.05MCaCl2重懸，置冰浴備用或于4℃短期保存。８．若欲將制備的感受態(tài)細(xì)胞長期保存，將制備的細(xì)胞重懸于含有15％甘油的0.05MCaCl2中，放入-80℃冰箱或液氮中凍存。。CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞流程１．將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上160轉(zhuǎn)化-熱激發(fā)取制備好的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰浴上；向感受態(tài)細(xì)胞中加入連接產(chǎn)物（不超過轉(zhuǎn)化體系的1/10體積），柔和混勻后冰浴上放置30min；將連接體系放入42℃水浴中熱激90sec；迅速轉(zhuǎn)入冰浴2min；加入0.8mlLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min；取適量培養(yǎng)物涂布于Amp+LB固體培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化-熱激發(fā)取制備好的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰浴上；161轉(zhuǎn)化示意圖轉(zhuǎn)化示意圖1621. 0℃的CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)；2.加入DNA，Ca2+又與DNA結(jié)合形成羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上；3.經(jīng)短暫的42℃熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。1. 0℃的CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2163二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformat164每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法

2.轉(zhuǎn)化率簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（2）電轉(zhuǎn)化法每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法2.16510ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置166電擊法(Genetransferbyelectroporation)（2）高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法電擊法(Genetransferbyelectrop167LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L

電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F

脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化法步驟：LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°1684.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的169用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化170環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接:干擾因素②線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒

5.影響轉(zhuǎn)化率的因素環(huán)形重組質(zhì)粒②線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形171①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞

（competentcells)①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的172把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。（1）體外包裝（invitropackaging）

（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。3

重組噬菌體DNA的體外包裝與轉(zhuǎn)導(dǎo)把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染173基因的體外重組和轉(zhuǎn)化課件174cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。

但當(dāng)溫度升高到44℃—45℃時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體

但由于該噬菌體的S基因上有一個(gè)突變，所以細(xì)菌還不裂解。cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32175cI857其它基因溶源狀態(tài)