基因工程的基本操作步驟 課件

1.2基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序1基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體2一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因也有一些具有調(diào)控作用的因子2、獲取目的基因的方法（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成________________________________________一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指___________3(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.基因文庫(kù)

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。2.基因文庫(kù)的分類(lèi):種類(lèi)基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.基因文庫(kù)將含有某種4基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程限制酶拼接到載體上導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)受體菌群體的培養(yǎng)而儲(chǔ)存一種生物的全部基因。

基因組文庫(kù)3.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程限制酶拼接到載體上導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增基因組5提取生物某發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈CDNA(只含該生物部分基因)與載體連接導(dǎo)入到受體菌群儲(chǔ)存

cDNA文庫(kù)提取生物某發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶6基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較7原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子啟動(dòng)子原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上8真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA9原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白10真核生物mRNA的形成編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄加工（剪切、拼接）成熟mRNA只對(duì)應(yīng)外顯子部分初級(jí)轉(zhuǎn)錄物補(bǔ)充資料真核生物mRNA的形成編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編11基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較12依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性4.從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息4.從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法13①概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：___________、_______________、___________、___________

、__________

②原理：__________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制模板DNA四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（二）利用PCR擴(kuò)增目的基因④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：_______________________________________________________指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增①概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng)14⑥過(guò)程a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、復(fù)性（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈⑦前提__________________________________________________

有一段已知目的基因的核苷酸序列⑥過(guò)程a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板b、復(fù)性（復(fù)15蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成（DNA合成儀）（三）人工合成若基因_____，核苷酸序列______，可用此法。較小已知（化學(xué)合成法）蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推16mRNAcDNA單鏈cDNA分子逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（三）人工合成（反轉(zhuǎn)錄法）與直接提取的DNA相比cDNA不含有_____

和_____等結(jié)構(gòu)。mRNAcDNA單鏈cDNA分子逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（三）人17真核生物mRNA的形成編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄加工（剪切、拼接）成熟mRNA只對(duì)應(yīng)外顯子部分初級(jí)轉(zhuǎn)錄物補(bǔ)充資料真核生物mRNA的形成編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編18a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在

并遺傳給子代b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用1、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的二、表達(dá)載體的構(gòu)建a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和192、基因表達(dá)載體的組成：

目的基因標(biāo)記基因啟動(dòng)子終止子2、基因表達(dá)載體的組成：目的基因標(biāo)記基因20啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合21①用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。②用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建③將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同

(插入式)①用一定的_________切割3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建③將切22①用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。②用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。③將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同用同種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，使之露出相同的黏性末端，在加入DNA連接酶。①用一定的_________切割③將切下的目的基因片段插入質(zhì)23三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca+處理法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雽⒛康?41、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力②原理：

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物25③過(guò)程：1、將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上2、將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌3、用農(nóng)桿菌感染植物體細(xì)胞③過(guò)程：1、將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上2、將重組26（2）基因槍法適用于單子葉植物（2）基因槍法適用于27（3）花粉管通道法（3）花粉管通道法282、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：取卵顯微注射受精卵早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法取卵顯微注射受精293、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞①原核生物特點(diǎn)：

繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子感受態(tài)細(xì)胞3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞30四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因四、目的基因的檢測(cè)與鑒定大腸桿菌四環(huán)素氨芐青霉四、目的基因的檢測(cè)與鑒定大腸桿菌31四、目的基因的檢測(cè)與鑒定抗原－抗體雜交法分子雜交法DNA分子雜交法目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否導(dǎo)入方法檢測(cè)對(duì)象結(jié)果個(gè)體水平的鑒定是否顯示出雜交帶四、目的基因的檢測(cè)與鑒定抗原－抗體雜交法分子雜交法DNA分子32

基因探針：（制作探針的要求）①含有目的基因②單鏈③標(biāo)記——放射性同位素或熒光基因探針：（制作探針的要求）①含有目的基因②單鏈③標(biāo)33四、目的基因的檢測(cè)與鑒定個(gè)體水平的鑒定（受體是否表現(xiàn)出相應(yīng)性狀）1、鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉是否具有抗蟲(chóng)性可采用

___________實(shí)驗(yàn)2、如何鑒定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否成功？接蟲(chóng)在轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草田中澆灌鹽水，觀察其是否有抗鹽特性3、用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人血清白蛋白，如何確定轉(zhuǎn)基因羊培養(yǎng)成功？檢測(cè)羊乳中是否含有人的血清白蛋白四、目的基因的檢測(cè)與鑒定個(gè)體水平的鑒定（受體是否表現(xiàn)出相應(yīng)性34歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR技術(shù)人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：是否有轉(zhuǎn)基因特性歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因35一、乳腺生物反應(yīng)器1.目的基因是什么？藥用蛋白基因2.目的基因前需加的什么啟動(dòng)子？乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子3.受體細(xì)胞是什么？受精卵4.分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞是？乳腺分泌細(xì)胞5.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法？顯微注射法一、乳腺生物反應(yīng)器1.目的基因是什么？藥用蛋白基因2.目的基練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近，科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中。請(qǐng)回答：1）將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫荏w細(xì)胞，常用方法是___________。顯微注射2）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是，通常要將外源基因轉(zhuǎn)到________中，原因是：受精卵①具有發(fā)育的全能性；②體積大，易操作。3）在研制膀胱生物反應(yīng)器時(shí)，應(yīng)使外源基因在小鼠的_________細(xì)胞中特異表達(dá)。膀胱上皮練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱1）將人的生長(zhǎng)激素練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近，科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中。請(qǐng)回答：4）通常采用_____________技術(shù)檢測(cè)外源基因

是否插入了小鼠的基因組DNA分子雜交6）與乳腺生物反應(yīng)器相比，膀胱反應(yīng)器有什么優(yōu)點(diǎn)？①不受性別的限制；②沒(méi)有是否處于生殖期的限制。5）檢測(cè)人的生長(zhǎng)激素是否成功表達(dá)可采用

___________

技術(shù)

抗原--抗體雜交練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱4）通常采用___1、基因治療概念：二、基因治療曙光初照

將健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，從而達(dá)到治療疾病的目的。（增補(bǔ)策略）2、基因治療的類(lèi)型體外基因治療體內(nèi)基因治療3、基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀：處于初期的臨床試驗(yàn)階段1、基因治療概念：二、基因治療曙光初照將健康的外源基三、蛋白質(zhì)工程的崛起蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿(mǎn)足人類(lèi)對(duì)生產(chǎn)和生活的需求。前提：了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能途徑：目的：改造基因（基因修飾或基因合成）定向改造或制造蛋白質(zhì)獲得自然界沒(méi)有的蛋白質(zhì)三、蛋白質(zhì)工程的崛起蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預(yù)防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白VP1?？茖W(xué)家嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因番茄來(lái)生產(chǎn)口蹄疫疫苗，過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)據(jù)圖回答。（1）口蹄疫病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，要獲得VP1基因可用

_____________的方法合成DNA，再用_____________將VP1基因片段切下。反轉(zhuǎn)錄法限制酶1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預(yù)防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白VP1?？茖W(xué)家嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因番茄來(lái)生產(chǎn)口蹄疫疫苗，過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)據(jù)圖回答。（2）過(guò)程⑥的培養(yǎng)基中除了加入各種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和____________等激素外，還需要添加____________篩選出含有重組質(zhì)粒的葉片小段。1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接2、某研究小組進(jìn)行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工

作，下圖為他們前期研究工作的簡(jiǎn)要操作流程圖：（1）實(shí)驗(yàn)步驟①所代表的反應(yīng)過(guò)程是____________；在步驟②之前擴(kuò)增H基因常采用的方法是____________。逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（2）步驟②構(gòu)建重組表達(dá)載體A和重組表達(dá)載體B必須使用的酶________________________。限制酶、DNA連接酶（3）構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，一般需要將H基因與載體結(jié)合，常用做基因工程載體的是__________；在檢測(cè)受體細(xì)胞中是否已經(jīng)導(dǎo)入目的基因時(shí)，常常要借助載體上____________的表達(dá)。質(zhì)粒標(biāo)記基因2、某研究小組進(jìn)行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工3、科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗鹽基因，轉(zhuǎn)入煙草并培育成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草。圖6是轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過(guò)程，含目的基因的DNA和質(zhì)粒上的箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)分析回答：（1）在基因工程中，抗鹽基因被稱(chēng)為_(kāi)____________，它可用PCR技術(shù)擴(kuò)增，該技術(shù)需用_____________酶。目的基因熱穩(wěn)定DNA聚合（2）用圖中的質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是_____________。圖中①、②過(guò)程為防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，應(yīng)選用限制酶___________對(duì)外源DNA、質(zhì)粒進(jìn)行切割。3、科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗鹽基因，轉(zhuǎn)入煙草并培育成轉(zhuǎn)基因抗鹽3、科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗鹽基因，轉(zhuǎn)入煙草并培育成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草。圖6是轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過(guò)程，含目的基因的DNA和質(zhì)粒上的箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)分析回答：（3）為篩選出已導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中加_____________。M抗生素（4）為確定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否培育成功，在個(gè)體水平上鑒定之前，常用__________________________作探針進(jìn)行分子雜交測(cè)試。放射性同位素標(biāo)記的抗鹽基因3、科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗鹽基因，轉(zhuǎn)入煙草并培育成轉(zhuǎn)基因抗鹽4、在某些深海魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因afp對(duì)提高農(nóng)作物的抗寒能力有較好的應(yīng)用價(jià)值。右圖所示是獲得轉(zhuǎn)基因萵苣的技術(shù)流程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：(1)獲取目的基因的主要途徑包括從自

然界已有的物種中分離和________。(2)①過(guò)程需要的酶有__________、__________。(3)重組質(zhì)粒除了帶有抗凍蛋白基因afp以外，還必須含有啟動(dòng)子、終止子和________，這樣才能構(gòu)成一個(gè)完整的基因表達(dá)載體。人工合成限制酶DNA連接酶標(biāo)記基因4、在某些深海魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因afp對(duì)提高農(nóng)作物的抗寒4、在某些深海魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因afp對(duì)提高農(nóng)作物的抗寒能力有較好的應(yīng)用價(jià)值。右圖所示是獲得轉(zhuǎn)基因萵苣的技術(shù)流程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：(4)如果受體細(xì)胞C1是土壤農(nóng)桿菌，則將目的基因?qū)胨哪康氖抢棉r(nóng)桿菌的________，使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞C2，并將其插入到受體細(xì)胞C2中____________上，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)，形成轉(zhuǎn)基因萵苣。經(jīng)②過(guò)程獲得的轉(zhuǎn)基因萵苣中的目的基因是否表達(dá)，在分子水平上可用___________法進(jìn)行檢測(cè)，如果出現(xiàn)雜交帶，說(shuō)明目的基因已經(jīng)表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因萵苣培育成功。轉(zhuǎn)化作用染色體DNA抗原-抗體雜交4、在某些深海魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因afp對(duì)提高農(nóng)作物的抗寒根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：（1）限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段，其末端類(lèi)型有________和________。（2）質(zhì)粒運(yùn)載體用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下：AATTC……GG……CTTAA為使運(yùn)載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，還可用另一種限制性?xún)?nèi)切酶切割，該酶必須具有的特點(diǎn)是________________。（3）按其來(lái)源不同，基因工程找那個(gè)所使用的DNA連接酶有兩類(lèi)，即________DNA連接酶和________DNA連接酶。粘性末端平末端切割產(chǎn)生的DNA片段末端與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的相同；大腸桿菌T4根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：（1）限制性?xún)?nèi)切酶切割（4）反轉(zhuǎn)錄作用的模板是________，產(chǎn)物是________。若要在體外獲得大量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，常采用________技術(shù)。（5）基因工程中除質(zhì)粒外，________和__________也可作為運(yùn)載體（6）若用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，原因是________________________。mRNAcDNAPCR噬菌體動(dòng)植物病毒是未處理的大腸桿菌吸收質(zhì)粒（外源DNA）的能力極弱（4）反轉(zhuǎn)錄作用的模板是________，產(chǎn)物是_____1.2基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序50基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體51一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因也有一些具有調(diào)控作用的因子2、獲取目的基因的方法（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成________________________________________一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指___________52(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.基因文庫(kù)

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。2.基因文庫(kù)的分類(lèi):種類(lèi)基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.基因文庫(kù)將含有某種53基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程限制酶拼接到載體上導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)受體菌群體的培養(yǎng)而儲(chǔ)存一種生物的全部基因。

基因組文庫(kù)3.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程限制酶拼接到載體上導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增基因組54提取生物某發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈CDNA(只含該生物部分基因)與載體連接導(dǎo)入到受體菌群儲(chǔ)存

cDNA文庫(kù)提取生物某發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶55基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較56原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子啟動(dòng)子原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上57真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA58原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白59真核生物mRNA的形成編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄加工（剪切、拼接）成熟mRNA只對(duì)應(yīng)外顯子部分初級(jí)轉(zhuǎn)錄物補(bǔ)充資料真核生物mRNA的形成編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編60基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較61依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性4.從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息4.從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法62①概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：___________、_______________、___________、___________

、__________

②原理：__________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制模板DNA四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（二）利用PCR擴(kuò)增目的基因④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：_______________________________________________________指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增①概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng)63⑥過(guò)程a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、復(fù)性（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈⑦前提__________________________________________________

有一段已知目的基因的核苷酸序列⑥過(guò)程a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板b、復(fù)性（復(fù)64蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成（DNA合成儀）（三）人工合成若基因_____，核苷酸序列______，可用此法。較小已知（化學(xué)合成法）蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推65mRNAcDNA單鏈cDNA分子逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（三）人工合成（反轉(zhuǎn)錄法）與直接提取的DNA相比cDNA不含有_____

和_____等結(jié)構(gòu)。mRNAcDNA單鏈cDNA分子逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（三）人66真核生物mRNA的形成編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄加工（剪切、拼接）成熟mRNA只對(duì)應(yīng)外顯子部分初級(jí)轉(zhuǎn)錄物補(bǔ)充資料真核生物mRNA的形成編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編67a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在

并遺傳給子代b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用1、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的二、表達(dá)載體的構(gòu)建a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和682、基因表達(dá)載體的組成：

目的基因標(biāo)記基因啟動(dòng)子終止子2、基因表達(dá)載體的組成：目的基因標(biāo)記基因69啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合70①用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。②用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建③將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同

(插入式)①用一定的_________切割3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建③將切71①用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。②用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。③將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同用同種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，使之露出相同的黏性末端，在加入DNA連接酶。①用一定的_________切割③將切下的目的基因片段插入質(zhì)72三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca+處理法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雽⒛康?31、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力②原理：

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物74③過(guò)程：1、將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上2、將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌3、用農(nóng)桿菌感染植物體細(xì)胞③過(guò)程：1、將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上2、將重組75（2）基因槍法適用于單子葉植物（2）基因槍法適用于76（3）花粉管通道法（3）花粉管通道法772、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：取卵顯微注射受精卵早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法取卵顯微注射受精783、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞①原核生物特點(diǎn)：

繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子感受態(tài)細(xì)胞3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞79四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因四、目的基因的檢測(cè)與鑒定大腸桿菌四環(huán)素氨芐青霉四、目的基因的檢測(cè)與鑒定大腸桿菌80四、目的基因的檢測(cè)與鑒定抗原－抗體雜交法分子雜交法DNA分子雜交法目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否導(dǎo)入方法檢測(cè)對(duì)象結(jié)果個(gè)體水平的鑒定是否顯示出雜交帶四、目的基因的檢測(cè)與鑒定抗原－抗體雜交法分子雜交法DNA分子81

基因探針：（制作探針的要求）①含有目的基因②單鏈③標(biāo)記——放射性同位素或熒光基因探針：（制作探針的要求）①含有目的基因②單鏈③標(biāo)82四、目的基因的檢測(cè)與鑒定個(gè)體水平的鑒定（受體是否表現(xiàn)出相應(yīng)性狀）1、鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉是否具有抗蟲(chóng)性可采用

___________實(shí)驗(yàn)2、如何鑒定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否成功？接蟲(chóng)在轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草田中澆灌鹽水，觀察其是否有抗鹽特性3、用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人血清白蛋白，如何確定轉(zhuǎn)基因羊培養(yǎng)成功？檢測(cè)羊乳中是否含有人的血清白蛋白四、目的基因的檢測(cè)與鑒定個(gè)體水平的鑒定（受體是否表現(xiàn)出相應(yīng)性83歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR技術(shù)人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：是否有轉(zhuǎn)基因特性歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因84一、乳腺生物反應(yīng)器1.目的基因是什么？藥用蛋白基因2.目的基因前需加的什么啟動(dòng)子？乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子3.受體細(xì)胞是什么？受精卵4.分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞是？乳腺分泌細(xì)胞5.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法？顯微注射法一、乳腺生物反應(yīng)器1.目的基因是什么？藥用蛋白基因2.目的基練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近，科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中。請(qǐng)回答：1）將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫荏w細(xì)胞，常用方法是___________。顯微注射2）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是，通常要將外源基因轉(zhuǎn)到________中，原因是：受精卵①具有發(fā)育的全能性；②體積大，易操作。3）在研制膀胱生物反應(yīng)器時(shí)，應(yīng)使外源基因在小鼠的_________細(xì)胞中特異表達(dá)。膀胱上皮練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱1）將人的生長(zhǎng)激素練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近，科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中。請(qǐng)回答：4）通常采用_____________技術(shù)檢測(cè)外源基因

是否插入了小鼠的基因組DNA分子雜交6）與乳腺生物反應(yīng)器相比，膀胱反應(yīng)器有什么優(yōu)點(diǎn)？①不受性別的限制；②沒(méi)有是否處于生殖期的限制。5）檢測(cè)人的生長(zhǎng)激素是否成功表達(dá)可采用

___________

技術(shù)

抗原--抗體雜交練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱4）通常采用___1、基因治療概念：二、基因治療曙光初照

將健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，從而達(dá)到治療疾病的目的。（增補(bǔ)策略）2、基因治療的類(lèi)型體外基因治療體內(nèi)基因治療3、基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀：處于初期的臨床試驗(yàn)階段1、基因治療概念：二、基因治療曙光初照將健康的外源基三、蛋白質(zhì)工程的崛起蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿(mǎn)足人類(lèi)對(duì)生產(chǎn)和生活的需求。前提：了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能途徑：目的：改造基因（基因修飾或基因合成）定向改造或制造蛋白質(zhì)獲得自然界沒(méi)有的蛋白質(zhì)三、蛋白質(zhì)工程的崛起蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預(yù)防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白VP1?？茖W(xué)家嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因番茄來(lái)生產(chǎn)口蹄疫疫苗，過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)據(jù)圖回答。（1）口蹄疫病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，要獲得VP1基因可用

_____________的方法合成DNA，再用_____________將VP1基因片段切下。反轉(zhuǎn)錄法限制酶1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預(yù)防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白VP1?？茖W(xué)家嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因番茄來(lái)生產(chǎn)口蹄疫疫苗，過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)據(jù)圖回答。（2）過(guò)程⑥的培養(yǎng)基中除了加入各種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和____________等激素外，還需要添加____________篩選出含有重組質(zhì)粒的葉片小段。1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接2、某研究小組進(jìn)行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工

作，下圖為他們前期研究工作的簡(jiǎn)要操作流程圖：（1）實(shí)驗(yàn)步驟①所代表的反應(yīng)過(guò)程是____________；在步驟②之前擴(kuò)增H基因常采用的方法是____________。逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（2）步驟②構(gòu)建重組表達(dá)載體A和重組表達(dá)載體B必須使用的酶________________________。限制酶、DNA連接酶（3）構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，一般需要將H基因與載體結(jié)合，常用做基因工程載體的是__________；在檢測(cè)受體細(xì)胞中是否已經(jīng)導(dǎo)入目的基因時(shí)，常常要借助載體上____________的表達(dá)。質(zhì)粒標(biāo)記基因2、某研究小組進(jìn)行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工3、科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗鹽基因，轉(zhuǎn)入煙草并培育成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草。圖6是轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過(guò)程，含目的基因的DNA和質(zhì)粒上的箭頭表示相關(guān)限制