免疫標記技術(shù)

關(guān)于免疫標記技術(shù)第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日根據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性和標記分子的敏感性建立的技術(shù)，稱免疫標記技術(shù)。(

immunolabellingtechnique)第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

高敏感性的標記分子主要有熒光素、酶、放射性同位素，由此建立了免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫分析等技術(shù)。特點：敏感性高、特異性強應用：微生物鑒定、傳染病診斷、生物活性物質(zhì)的測定、基因表達產(chǎn)物的檢測。第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫熒光抗體技術(shù)Immunofluorescenceantibodytechnique

指用熒光素對抗體進行標記，然后用熒光顯微鏡觀察熒光，以分析示蹤相應的抗原或抗體的方法。Coons等1941年建立該技術(shù)，當時用熒光黃標記，但效果不好，故不能推廣。第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

當發(fā)現(xiàn)異硫氰酸熒光素（FITC）被發(fā)現(xiàn)后，以及熒光抗體純化技術(shù)的發(fā)展，顯著提高了熒光抗體技術(shù)的敏感性和特異性，故得到廣泛應用。用于病原檢測、疫病診斷等第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日1原理：熒光素在超微濃度下，亦能被短波長光激發(fā)，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光。是將抗原抗體反應的特異性、熒光檢測的敏感性以及顯微鏡技術(shù)的精確性等相互結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日2熒光素為一種化學染料。常用于標記的熒光素有：異硫氰酸熒光素（FITC）、四乙基羅丹明（RB200）、四甲基異硫氰酸羅丹明，其中FITC最常用。第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日作為標記熒光素需滿足的條件：（1）有與蛋白分子形成穩(wěn)定共價鍵的化學基團，且不形成有害產(chǎn)物。（2）熒光效率高，與蛋白結(jié)合的需要量小。（3）標記后不影響抗體的活性（4）性質(zhì)穩(wěn)定，易保存（5）激發(fā)的熒光與背景顏色有良好的反差。（6）標記簡單，能形成商品第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日3熒光抗體染色方法（1）標本制備涂片或亞印片：細菌培養(yǎng)物、感染動物的組織、血液、膿汁切片：感染組織蓋玻片：上面培養(yǎng)單層細胞標本要求很薄，并要保持抗原的完整性第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日（2）固定常用丙酮和95%乙醇，室溫固定15~30min，后用PBS反復沖洗，干后即可染色。固定目的：防止被檢材料從玻片上脫落；消除標本內(nèi)抑制抗原抗體反應的因素；檢測細胞內(nèi)的抗原，用有機溶劑固定，有利于熒光抗體滲入。第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日（3）染色方法

有直接法和間接法兩種直接法：A在標本上滴加2~4個單位的標記抗體，置濕盒中，37℃作用30minB在大量PBS中漂洗15min，第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日C干燥D封載滴加緩沖甘油，用蓋玻片封蓋檢測中，要設(shè)陽性、陰性標本對照緩沖甘油：分析純甘油9份加PBS1份第十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日直接法豬鏈球菌2型MRP的鑒定A豬鏈球菌2型肉湯培養(yǎng)物涂片，涼干BPBS漂洗5minC加入FITC標記的抗MRP抗體，置濕盒中，37℃作用30minDPBS漂洗5minE干燥、封載第十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日圖2AMRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像圖2BSS2多抗介導FITC標記的SS2的激光共聚焦圖像AB第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日A在標本上滴加抗SFV血清，置濕盒中，37℃作用30minBPBS漂洗5minC加FITC標記的抗抗體，置濕盒中，37℃作用30minDPBS漂洗E干燥、封載間接法（如檢測豬淋巴結(jié)中的SFV）第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日4熒光顯微鏡觀察第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日（1）細菌學診斷可直接檢測或鑒定新分離的細菌，具有較高的敏感性和特異性。動物糞便、黏膜拭子涂片、病變組織觸片或切片、尿沉渣等均可作為樣本對含菌少的樣本，可采用濾膜聚菌法，然后在濾膜上進行免疫熒光染色5免疫熒光技術(shù)的應用第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日（2）病毒病診斷直接檢測病變組織中的病毒，是病毒病診斷的常用手段。如豬瘟、雞傳支豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎，臨床癥狀相似，但將豬小腸做切片，即可區(qū)分對于豬瘟等不出現(xiàn)細胞病變的病毒，免疫熒光可作為病毒增殖的指征第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日（3）其他應用

免疫熒光廣泛應用于淋巴細胞CD分子和膜表面免疫球蛋白的檢測，用于淋巴細胞的分型；借助于流式細胞計數(shù)技術(shù)，可以評價機體細胞免疫狀況。如佐劑刺激機體細胞免疫功能增強，可通過檢測T細胞上的CD表達量來證實第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫酶標記技術(shù)

是根據(jù)抗原抗體反應的特異性和酶催化反應的高敏感性而建立的免疫檢測技術(shù)。1966年，Nakane報道用酶代替熒光素標記抗體，建立酶標記抗體技術(shù)，用于組織中抗原的定位。

第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日1971年，Engvall報道酶聯(lián)免疫吸附試驗，建立免疫酶定量檢測技術(shù)。1980年后，建立了檢測和鑒定蛋白質(zhì)的免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)。第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日一、原理

酶是有機催化劑，微量的酶可催化大量的化學反應，如果產(chǎn)物為有色可見物，則極為敏感。

E+S(ES)E+P

如果產(chǎn)物沒有顏色，則可通過供氫體顯色，來顯示反應的發(fā)生。E+S(ES)，(ES)+D1E+P+D2

第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

D1為供氫體，無色，底物水解時，D1由還原型變?yōu)檠趸虳2，呈現(xiàn)顏色反應。第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日基本程序1酶分子與抗原或抗體分子共價結(jié)合2酶標抗體或抗抗體與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異結(jié)合，并洗下未結(jié)合的物質(zhì)。3滴加底物溶液，底物在酶作用下顯色；或底物不顯色，但在底物水解過程中，由另外的供氫第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日體提供氫離子，使供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，呈現(xiàn)顏色反應。4根據(jù)顏色變化判斷反應的發(fā)生。第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日二、用于標記的酶標記酶應具有的特征：1高度的特異活性和敏感性；2在室溫下穩(wěn)定；3易于獲得并能商品化生產(chǎn)；4與底物反應的產(chǎn)物易于顯現(xiàn)第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日（一）辣根過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，稱（horseradishperoxidase,HRP)。。

其作用底物為過氧化氫，催化時需要供氫體。供氫體主要有：鄰苯二胺（OPD）、聯(lián)苯二胺（DAB）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日OPD的氧化產(chǎn)物可溶解于水，呈橙色，最大吸收波長為490nmTMB產(chǎn)物溶于水，呈蘭色，加氫氟酸終止反應，在650nm測定；用硫酸終止，呈黃色，450nm下測定DAB的氧化產(chǎn)物不溶于水，呈黃褐色第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日（二）堿性磷酸酶（AKP）從牛小腸黏膜和大腸桿菌中提取底物常用對硝基苯磷酸鹽，酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶解，最大吸收波長400nm。第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日三、常用的免疫酶標記技術(shù)（一）免疫組織化學染色1標本制備與免疫熒光相同2標本處理用1%~3%的H2O2甲醇處理標本，低溫條件下，作用10~15分鐘，可同時起到固定和消除內(nèi)源酶的作用。第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日3封閉10%卵白蛋白（OVA）或0.05%Tween-80和含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS對標本處理30min，能消除背景顏色。4染色方法可采用直接法、間接法等，與免疫熒光方法相似。第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日（二）酶聯(lián)免疫吸附實驗Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)

將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶反應，底物顯色后用肉眼或分光光度計判定結(jié)果。1載體聚苯乙烯微量滴定板最常用，有96孔、40孔以及酶標條。第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日2包被將抗原或抗體吸附于固相表面的過程。大多數(shù)抗原易吸附在表面。用碳酸鹽緩沖液包被，4℃過夜或37℃吸附2~3h。3洗滌用含0.05%Tween-80的PBS第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日4實驗方法直接法用于測抗原（如沙門氏菌）（1）待檢抗原包被（2）洗滌3~5次，每次3~5min（3）封閉含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度為10mmol）（4）洗滌同上（5）加酶標記的抗沙門氏菌的單抗，置濕盒中，37℃作用1~2h（6）洗滌同上（7）加底物顯色，測OD值第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日間接法：用于測抗體（如測AIV抗體）（1）AIV病毒包被（2）洗滌3~5次，每次3~5min（3）封閉含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度為10mmol）（4）洗滌同上（5）加待檢抗體，置濕盒中，37℃作用1~2h（6）洗滌同上（7）加酶標記抗抗體，置濕盒中，37℃作用1~2h（8）加底物顯色，測OD值第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日夾心法（又稱雙抗體法，用于測抗原）（1）抗AIV多抗包被（2）洗滌3~5次，每次3~5min（3）封閉含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度為10mmol）（4）洗滌同上（5）加待檢抗原，置濕盒中，37℃作用1~2h（6）洗滌同上（7）加酶標記抗AIV單抗，置濕盒中，37℃作用1~2h（8）加底物顯色，測OD值第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日雙抗體夾心法

（1）抗AIV多抗包被（2）洗滌3~5次，每次3~5min（3）封閉含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度為10mmol）（4）洗滌同上（5）加待檢抗原，置濕盒中，37℃作用1~2h第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日（6）洗滌同上（7）加抗AIV單抗，置濕盒中，37℃作用1~2h（8）洗滌同上（9）加酶標記抗AIV單抗，置濕盒中，37℃作用1~2h（10）洗滌，加底物顯色，測OD值第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日結(jié)果判定：P/N≥2.1判為陽性實驗中，要設(shè)置陽性對照、陰性對照、空白對照。實驗時，先用空白對照孔調(diào)零。第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日其他ELISA技術(shù)1阻斷ELISA2酶標抗原競爭法3酶標抗體直接競爭法4SPA-ELISA5Dot-ELISA第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)放射免疫分析

Radioimmunoassay(RIA)是將放射性同位素測量的敏感性和抗原抗體反應的特異性結(jié)合起來而建立的一種免疫分析技術(shù)。

第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日1959年Yalow和Berson共同建立了該技術(shù)，可精確地測定體液中微量活性物質(zhì)的量。1977年獲諾貝爾獎。具有特異性強、靈敏度高、準確性好等優(yōu)點。第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日一、原理

放射性同位素核衰變時，會發(fā)出α、β、γ射線，或從核外俘獲一個正電子。各種射線均可用儀器檢測，且靈敏度很高。3H放出β射線，能量低，用液體閃爍計數(shù)器檢測；32P、35S放出中等能量的β射線，125I放出γ射線，均可用井型計數(shù)器檢測。第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日1競爭性RIA原理定量分析微量半抗原物質(zhì)均采用該法。同時在溶液中加入標記抗原（*Ag）、非標記抗原（Ag）和抗體（Ab），使*Ag與Ag競爭性地與Ab結(jié)合，根據(jù)免疫沉淀物中，*Ag.Ab的減少來測定Ag的量。第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日*Ag+Ab*Ag-Ab+Ag

Ag-Ab

當反應體系中存在一定量的*Ag和Ab時，結(jié)合型*Ag-Ab(B)和游離型*Ag（F）的比例是一定的，他們保持著可逆的動態(tài)平衡。第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日

在此反應液中加入待檢的Ag，則Ag與*Ag競爭地與Ab結(jié)合，Ag的量越多，B/F的比值或B%越小。因此，只要把反應液中的B和F分開，然后分別測定B和F的放射性，即可計算出B/F值和結(jié)合百分率（B%）。第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日

用已知濃度的標準物（Ag）和一定量的*Ag、Ab反應，測出不同濃度Ag下的B/F，以標準物的濃度為橫坐標，以B/F為縱坐標，即可繪制競爭性抑制反應曲線。實驗中，測出待檢抗原的B/F，即可在標準曲線上查出其含量。第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日2固相夾心RIA

與夾心ELISA的原理相似，以一定量的抗體包被反應管，然后加入系列稀釋的待檢抗原，最后加入放射性同位素標記的抗體，計數(shù)結(jié)果。根據(jù)標準樣品制備的標準曲線進行定量測定。其只能檢測完全抗原。第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日3放射免疫檢測與免疫酶組織化學染色法的原理相似。用放射性同位素標記抗原或抗體，加入到組織制片或固定檢樣上，用放射自顯影以顯示組織或固定檢樣中相應的抗原或抗體的位置。可進行定性和定位檢測。第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日二標記用的同位素作為標記用的同位素需滿足以下條件：1為低序號的常見元素2放射強度低或中等3半衰期適中（既能保證檢測時間，又便于環(huán)境處理）。第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日三、常用放射免疫分析技術(shù)（一）液相放射免疫測定放免通常指液相法1試驗基本過程：（1）適量處理待測樣品（2）按一定要求加樣，