遺傳進(jìn)化無參-slaf測序項(xiàng)目方案模板

背 材料與方 材 參考組確 實(shí)驗(yàn)建庫及高通量................................................................................................... 信息分析流 3.1質(zhì)量值分布檢 3.3數(shù)據(jù)產(chǎn)出和質(zhì)量統(tǒng) SLAF開 SLAF統(tǒng) SLAF分 SNP信息統(tǒng) PCA分 簡化組遺傳進(jìn)化文章賞 參考文 科它應(yīng)用數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究群體中頻率和型頻率以及影響這些頻率的選擇效所帶來的各種型在數(shù)量上的分布稱為群體的遺傳結(jié)構(gòu)獲知了不同世代中遺傳結(jié)構(gòu)的演SLAF-seq[1]技術(shù)作為一種新發(fā)展的技術(shù)，通過限制性內(nèi)切酶消化組DNA，選取一定長度的片段進(jìn)序，降低了組的復(fù)雜度，并且不依賴組序列，因而成為SNP標(biāo)記開發(fā)的首選。相對于傳統(tǒng)的技術(shù)，SLAF-seq技術(shù)不僅節(jié)省成本和時間，而且本研究利用SLAF-seq簡化組技術(shù)，選擇足夠多的樣本，獲得高密度覆蓋全基SNP標(biāo)記，進(jìn)行群體進(jìn)化的研究。材本本個XX參考組確根據(jù)項(xiàng)目物種的組大小以及GC含量等信息選取項(xiàng)目物種或近緣物種的組作酶切方案確實(shí)驗(yàn)建庫及高根據(jù)選定的最適酶切方案，對檢測合格的各樣品組DNA分別進(jìn)行酶切。對得到的酶切片段（SLAF）進(jìn)行3′端加A處理、連接Dual-index接頭、PCR擴(kuò)增、純化、IlluminaHiSeq2500，PE125（PE250）進(jìn)實(shí)驗(yàn)建庫評

1SLAF實(shí)驗(yàn)流通過水稻晴作為control的數(shù)據(jù)來評估實(shí)驗(yàn)過程是否正常，確定酶切方案槍法和逐步克隆方法進(jìn)序目前已完成全部核組、葉綠體組和線粒體組測序工作，精確度達(dá)到99.99%。主要從以下幾個方面進(jìn)行評估：比對效率統(tǒng)計(jì)，即將reads與參考組進(jìn)行比對酶切效率評估，即統(tǒng)計(jì)reads片段中殘留酶切位點(diǎn)的比例利用Dual-index對得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行識別，得到各個樣品的reads。過濾reads的接頭后，進(jìn)序質(zhì)量和數(shù)據(jù)量的評估。通過Control數(shù)據(jù)評估酶切效率，以此判斷實(shí)驗(yàn)過程的準(zhǔn)確性和有效性。根據(jù)生物信息學(xué)分析，在群體中開發(fā)全組范圍的SNP質(zhì)量值分布檢通常序列5’端前幾個堿基的錯誤率相對較高，隨著序列的延伸，3’端堿基錯誤率會不斷升高，這是由高通量的技術(shù)特點(diǎn)決定的。堿基質(zhì)量30表示堿基的錯誤率為0.1%。樣品的reads質(zhì)量值分布圖見下圖：堿基分布檢SLAF所列為組酶切后的DN段，由于酶切位點(diǎn)在組上的分布是近似響，reads的前兩到三個堿基都是酶切位點(diǎn)序列，因此在堿基分布圖中會出現(xiàn)前端波動較大的現(xiàn)象。樣品的堿基含量分布圖見下圖：數(shù)據(jù)產(chǎn)出和質(zhì)量對各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，包括reads數(shù)量、Q30和GC含量，具體結(jié)果見表表1各樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)SampleBMKQ30percentageGC……………注SampleID：項(xiàng)目；BMKID：百邁客對項(xiàng)目樣品的統(tǒng)一TotalReads：各樣品的reads數(shù)Q30percentage：質(zhì)量值大于或等于30的堿基所占百分比；GCpercentage：結(jié)果中G和C兩種堿基所占總堿基的百分比；SLAF開readsSNP。SLAF開發(fā)流程見下圖SLAF統(tǒng)本項(xiàng)目共開發(fā)XXX個SLAF每個樣品的平均深度為XX，具體統(tǒng)計(jì)見表2統(tǒng)SampleBMKTotalAverage……………注SampleID：項(xiàng)目；BMKID：百邁客對項(xiàng)目樣品的統(tǒng)一SLAFnumber：對應(yīng)樣品所含有的SLAF數(shù)Totaldepth：對應(yīng)樣品的在SLAF中的總深度，即總reads數(shù)Averagedepth：平均每個SLAF上對應(yīng)樣品的reads數(shù)SLAF分SLAF，其中SNP這種類型為多態(tài)性標(biāo)記，統(tǒng)稱為Marker，本次分析共得到XXX個表3各類型SLAF結(jié)果統(tǒng) No 注：SNP：單核苷酸突變；INDEL：缺失；NoPolymorphism：沒有多態(tài)性；Unknown：類型未知；Repeat：重復(fù)序列在開發(fā)得到的XXX個SLAF中多態(tài)性標(biāo)記共有XXX個多態(tài)性比例達(dá)到XXX%SNP根XXXMarker，利用GATKSNP標(biāo)記檢測。SNP位點(diǎn)詳細(xì)4：4樣品SNP信息統(tǒng)計(jì)SampleSNPHeterHeter…注：SampleID：樣品；SNPnum：樣品中檢測到的SNP個數(shù)；Transition：轉(zhuǎn)換類型SNP個數(shù)；Transversion：顛換類型SNP個數(shù)；Ti/Tv：轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)之比；Heternum：樣品中雜合SNP位點(diǎn)個數(shù)；Heterratio：樣品中雜合SNP位點(diǎn)占所有SNP位點(diǎn)的系統(tǒng)發(fā)育分系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetictreeevolutionarytree進(jìn)化樹)是描述群體間進(jìn)化順序的分SNP檢測之后，得到的SNPs可以用于計(jì)算種群之間的距離。兩個i和j之LD=1∑

如果兩個的型是AA和

{1,如果兩個的型是AA和本實(shí)驗(yàn)通過MEGA5（Tamuraetal.,2011）軟件[2]，利用得到的SNP標(biāo)記，基于neighbor-joining（SaitouNetal1987）算法[3]對XX份材料進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，目的在于探索每個間的關(guān)系。群體結(jié)構(gòu)分則親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。群體結(jié)構(gòu)分析有助于理解進(jìn)化過程，并且可以通過型和表型的關(guān)聯(lián)研究確定所屬的亞群。在群體世系推斷分析之后，可以將樣本按區(qū)域或種群進(jìn)行劃分[4]本項(xiàng)目運(yùn)用admixture（lexanderetal.,2009）軟件[5]SNP標(biāo)記，基于數(shù)學(xué)模型對群體內(nèi)XXAdmixture（cross-validationerror）來判斷最佳K值——K值的交叉驗(yàn)證誤差最?。╟ross-validationerror，最終確定群體中最優(yōu)的類群數(shù)目，如下圖所示，K=7時具有最優(yōu)分群數(shù)。 同K值與CV值的對應(yīng)線，結(jié)果顯示K=7PCA主成分分析（principalcomponentysis）是一種利用正交變換將一組可能是相關(guān)變量的觀測值轉(zhuǎn)換為一組稱為主成分線性不相關(guān)的變量值。PCA在遺傳學(xué)當(dāng)中主要用于聚類分本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用cluster（Readetal2001）軟件[6]SNP標(biāo)記，對群體內(nèi)XX份PCAXX份材料的主成分聚類情況，從而知道哪些樣品的注：圖中通過PCA分析將樣品聚為三維，pca1代表第一主成分，pca2代表第二主成分，pca3代表第三主成分。一個點(diǎn)代表一個樣品。不同顏色代表不同的亞種類型，綠色表示亞種類型為1的樣品，紫色表示亞種類型為2的樣品，黃色表示未給定亞種類文章：PopulationgenomicevidenceforadaptivedifferentiationinBalticSeathree-spinedsticklebacks.BMCBiology,2015.這篇文章是對的海三刺魚進(jìn)行的群體適應(yīng)性分化的用材料是位于的海10個地點(diǎn)的三刺魚群體，每個群體取36個，對這些群體進(jìn)行簡化，共獲得14萬SNP進(jìn)行分析。和溫度的適應(yīng)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)有297個包含的SNP既在群體分化區(qū)域又與環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)。通過對297個進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)15個與早期研究中三刺魚在海洋與淡水的分化有關(guān)，還有22個與適應(yīng)鹽度有關(guān)。SunX,LiuD,ZhangX,etal.,SLAF-seq:AnEfficientMethodofLarge-ScaleDeNovoSNPDiscoveryandGenotyUsingHigh-ThroughputSequencing.PLosone,2013,8:e58700.KTamura,etal.,MEGA5:molecularevolutionarygeneticsysis likelihood,evolutionarydistance,and umparsimonymethods.MolBiolEvol,2011,28(10):2731-2739.NSaitouandMNei,Theneighbor-joiningmethod:anewmethodforreconstructingphylogenetictrees.MolBiolEvol,1987,4(4):406-425.Wright,S.,Thegeneticalstructureofpopulations.Ann.Eugen.1951,15,DHAlexander,etal.,Fastmodel-basedestimationofancestryinunrelatedGenomeRes.,2009,19:1655-KanazinV,TalbertH,SeeD,etal.,Discoveryandassayofsingle-nucleotidepolymorphismsinbarley(Hordeumvulgare).PlantMolecularBiology,2002,48:529-537.JuliaC.Jones,ShaohuaFan,PaoloFranchini,etal.,TheevolutionatyhistoryofXiphorusfishandtheirsexuallyselectedsword:agenome-wideapproachusingrest