四肽化合物CMS030抗移植排斥作用的實(shí)驗(yàn)研究

四肽化合物CMS030抗移植排斥作用的實(shí)驗(yàn)研究【內(nèi)容摘要】目的：cms030是從脾臟提取的四肽化合物，本研究觀察cms030對小鼠皮膚和心肌移植排擠反應(yīng)的影響。方法：通過體外t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)〔mlr〕實(shí)驗(yàn)，觀察cms030在體外的免疫抑制造用，建立小鼠皮膚移植和心肌移植模型，觀察cms030對小鼠同種移植物存活時(shí)間的影響，觀察cms030對移植受體小鼠t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和脾細(xì)胞分泌il2的影響。結(jié)果：cms030在體外能夠抑制t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和mlr，在體內(nèi)能夠明顯延長小鼠皮膚移植物和心肌移植物存活時(shí)間，抑制皮膚移植受體小鼠t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和脾細(xì)胞分泌il2水平。結(jié)論：cms030通過抑制t淋巴細(xì)胞分泌il2，抑制t淋巴細(xì)胞功能，有效拮抗移植排擠反應(yīng)?！颈疚年P(guān)鍵詞語】cms030皮膚移植心肌移植il2studyonthesuppressiveeffectsofcms030tetrameronallograftrejectioninmicezhaolan，lurong，wangsong，fuzheng，liqiuli，wangli，ljunqiang，marui，xuqiong，yaozhi.departmentofimmunology,tianjinmedicaluniversity,tianjin300070，china［abstract］objective:toinvestigatetheeffectsofcms030onskinandcardiacallograftrejectionins:theeffectsofcms030invitrowerestudiedbyconainducedtcellproliferationandmixedlymphocytereaction(mlr).thetailskingraftsofbalb/cmicewereplacedinwoundbedonthebackofc57bl/6mice,andthecardiacallograftsofnewbornc57bl/6miceweretransplantedintotheposteriorofbalb/ceffectsofcms030onthesurvivaltimeofthegraftswereobserved.conainducedlymphocyteproliferationandtheil2ofthemiceweres:theinhibitioneffectsofcms030ontcellsweredisplayedinvitroandthesurvivaltimeofgraftswassignificantlyprolongedbycms030invivo.conainducedlymphocyteproliferationandtheil2secretionofthemicewerebothreducedbysion:cms030caninhibitil2secretionoftlymphocytes,andsuppressallograftrejectionefficiently.［keywords］cms030；skintransplantation；cardiactransplantation；il2免疫抑制劑已經(jīng)廣泛用于器官移植排擠的治療，迄今仍然是臨床預(yù)防和治療排擠反應(yīng)的重要方法。然而，當(dāng)前使用的免疫抑制劑還遠(yuǎn)沒有到達(dá)高效和安全的要求，它們會(huì)降低患者的全身免疫功能，藥物的毒副作用也造成臨床用藥的極大局限，人們?nèi)栽趯ふ依硐氲拿庖咭种苿Ｆ⑴K是機(jī)體的最大免疫器官，也是最活潑踴躍的免疫器官之一，含有豐富的細(xì)胞基本營養(yǎng)成分及細(xì)胞因子，十分是促進(jìn)細(xì)胞代謝的能量中間體，如核酸、多肽類物質(zhì)及寡核苷肽。國內(nèi)外學(xué)者先后從動(dòng)物脾臟中提取出了具有免疫活性的多肽，如imencap和spleenp.m.g等脾臟提取物，用于調(diào)節(jié)免疫和腫瘤的輔助治療［1，2］。cms030是脾臟提取的小分子四肽類化合物，由苯丙氨酰、谷氨酰、谷氨酰、甲硫氨酸構(gòu)成。本研究討論cms030對淋巴細(xì)胞免疫功能的影響以及對同種移植排擠反應(yīng)的影響。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組c57bl/6j〔h2b〕小鼠和balb/c〔h2d〕小鼠，5周齡，雌雄各半，科學(xué)院動(dòng)物中心提供；c57bl/6j新生乳鼠，本教研室繁衍。皮膚移植和心肌移植受體小鼠各隨機(jī)分為3組：cms030劑量ⅰ組〔10μg/〔kg·d〕〕、cms030劑量ⅱ組〔2μg/〔kg·d〕〕、生理鹽水組〔0.5ml/天〕，藥物腹腔打針，每日1次，連續(xù)給藥5日后進(jìn)行移植手術(shù)，術(shù)后連續(xù)給藥20日。1.2重要試劑cms030由深圳康哲藥業(yè)提供；胎牛血清〔fbs〕、rpmi1640為美國hyclone公司產(chǎn)品；hanks’液為美國gibco公司產(chǎn)品；刀豆蛋白〔cona〕、四甲基偶氮唑鹽〔mtt〕為美國sigma公司產(chǎn)品；絲裂霉素〔mit〕為浙江海正藥業(yè)股份生產(chǎn)；硫化鈉由天津市北聯(lián)精細(xì)化工生產(chǎn)；il2檢測elisa試劑盒為rdsystemsinc產(chǎn)品。1.3體外t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)制備balb/c小鼠脾細(xì)胞懸液，10%fbs的rpmi1640調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106ml-1，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔參加100μl。陽性對照組參加100μlcona〔終濃度為5μg/ml〕，藥物組參加100μlcms030〔終濃度分別為40、8、1.6和0.32μg/ml〕，陰性對照組參加100μlrpmi1640。每孔總體積為200μl，設(shè)6個(gè)平行孔。96孔板置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)后，mtt法檢測吸光度〔od〕，測定波長570nm，參考波長630nm。1.4體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)〔mlr〕實(shí)驗(yàn)制備balb/c小鼠脾細(xì)胞懸液，10%fbs的rpmi1640調(diào)整細(xì)胞濃度為8×106ml-1，作為反應(yīng)細(xì)胞。制備c57bl/6j小鼠脾細(xì)胞懸液，參加mit〔終濃度為25μg/ml〕孵育45分鐘，洗滌后用10%fbs的rpmi1640調(diào)整細(xì)胞濃度為8×106ml-1，作為刺激細(xì)胞。96孔板中，藥物組和陽性對照組參加反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞各100μl，藥物組中參加20μlcms030〔濃度分別為40、8、1.6和0.32μg/ml〕，陽性對照組中參加20μlrpmi1640，陰性對照組中只參加200μl刺激細(xì)胞和20μlrpmi1640。每孔總體積220μl，設(shè)6個(gè)平行孔。96孔板置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育5日，mtt法檢測od570值。1.5小鼠心肌移植實(shí)驗(yàn)取balb/c受體小鼠，在耳廓背側(cè)中線下1/3處做一個(gè)3mm橫切口，從切口向耳尖方向鈍性分離皮下組織，制成4mm深的囊腔作為植床。取出新生c57bl/6j乳鼠心臟，置hanks’液中排空心腔內(nèi)余血，植入植床內(nèi)，輕壓囊腔上方的皮膚，排盡空氣，使心肌與四周皮膚嚴(yán)密接觸。術(shù)后第6日開始，用心電圖儀逐日檢測移植心臟的心電圖，連續(xù)3日無心電定為手術(shù)失敗，不計(jì)入統(tǒng)計(jì)，心電消失定位排擠終點(diǎn)，記錄移植物生存時(shí)間［3］。1.6小鼠皮膚移植實(shí)驗(yàn)將c57bl/6j受體小鼠背部用8%硫化鈉溶液脫毛，次日脫毛部位消毒后剪去1cm×1cm的皮片，創(chuàng)面經(jīng)壓迫止血后作為植床。取同性別balb/c小鼠尾部皮膚作為移植物平鋪于植床，用創(chuàng)可貼和醫(yī)用膠布通過胸腹部環(huán)繞包扎，使皮片和植床嚴(yán)密接觸。術(shù)后第8日拆除包扎，逐日觀察移植物顏色、硬度、結(jié)痂和脫落情況，以皮片變黑變硬，結(jié)痂脫落定為排擠終點(diǎn)，記錄移植物生存時(shí)間［4］。1.7皮膚移植受體小鼠t淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)皮膚移植受體小鼠于給藥結(jié)束后次日，無菌分離脾臟，分別制成脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106ml-1，96孔板中每孔參加100μl，cona刺激組參加100μlcona〔終濃度為5μg/ml〕，對照組參加100μlrpmi1640。每孔總體積200μl，設(shè)4個(gè)平行孔。96孔板置37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)，mtt法檢測od570值。刺激指數(shù)〔si〕＝cona刺激組od值均數(shù)對照組od值均數(shù)。1.8皮膚移植受體小鼠脾細(xì)胞分泌il2實(shí)驗(yàn)取皮膚移植小鼠脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1，24孔板中每孔參加1.5ml，參加cona〔終濃度為10μg/ml〕。孵育48小時(shí)離心后采集上清，elisa試劑盒檢測il2濃度［5］。1.9統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以x±s表示，采取kaplanmeier生存分析統(tǒng)計(jì)移植物生存時(shí)間，采取onewayanova中的studentnewmankeuls〔snk〕進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)比較。p0.05確以為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1cms030體外對t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是體外檢測藥物對淋巴細(xì)胞影響的常見方法，cona能夠特異性刺激t淋巴細(xì)胞構(gòu)成淋巴母細(xì)胞而促進(jìn)增殖，mtt法能夠檢測淋巴細(xì)胞的增殖水平。cms030藥物濃度為0.32～40μg/ml時(shí)，在體外能夠明顯抑制cona誘導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與陰性對照組比較，p0.01，見圖1。2.2cms030體外對mlr的影響mlr是模仿真實(shí)體內(nèi)細(xì)胞免疫反應(yīng)的一種實(shí)驗(yàn)方法，可用于評(píng)價(jià)機(jī)體t細(xì)胞對組織相容性抗原的特異性免疫應(yīng)答功能，提供器官移植的體外根據(jù)［6］。cms030濃度為1.6～40μg/ml時(shí)，在體外能夠抑制小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，與陰性對照組比較，p0.01，見圖2。2.3cms030對小鼠心肌移植物生存時(shí)間的影響balb/c〔h2d〕和c57bl/6j〔h2b〕是遺傳背景差別較大的兩個(gè)近交系小鼠，在移植排擠反應(yīng)的研究中，常用作受體和供體。小鼠尾背皮膚移植模型和耳后心肌移植模型是兩個(gè)經(jīng)典的移植免疫動(dòng)物模型，其特點(diǎn)是方法簡便、易操作，能夠較直觀地觀察和檢測排擠反應(yīng)，常用于同種移植排擠機(jī)制和抗排擠藥物的研究［7］。cms030給藥劑量10、2μg/〔kg·d〕能延長小鼠心肌移植物平均生存時(shí)間，與生理鹽水組比較，p0.05，見圖3。2.4cms030對小鼠皮膚移植的影響cms030給藥劑量10、2μg/〔kg·d〕時(shí)能延長小鼠皮膚移植物平均生存時(shí)間，與生理鹽水組比較，p0.01，見圖4。2.5cms030對皮膚移植受體小鼠t淋巴細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞免疫應(yīng)答在同種移植排擠反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，受體t細(xì)胞直接辨別供者抗原提呈細(xì)胞外表的同種抗原，發(fā)生激活和增殖，cd4+t細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥，cd8+t細(xì)胞特異性殺傷移植物細(xì)胞。cms030對cona刺激的t淋巴細(xì)胞增殖有一定的抑制造用，與生理鹽水組比較，p0.01，見圖5。2.6cms030對皮膚移植受體小鼠脾細(xì)胞分泌il2的影響cona能夠誘導(dǎo)t細(xì)胞分泌il2，il2是t細(xì)胞的重要活化因子，重要由t細(xì)胞分泌，能夠反映細(xì)胞免疫應(yīng)答水平［8］。cms030能夠降低cona誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞分泌il2的水平，與生理鹽水組比較，p0.01，見圖6。3討論器官移植已成為治療終末期疾病的重要手段之一，近30年來，器官移植的發(fā)展已獲得令人矚目的成就，更為安全有效的免疫抑制劑的不斷推出及臨床應(yīng)用起了主要作用，21的器官移植領(lǐng)域仍然是免疫抑制劑為主的時(shí)代［9］。特異性針對t細(xì)胞趨化、活化、分化等各個(gè)環(huán)節(jié)的免疫抑制劑是抗移植排擠藥物研究的主要發(fā)展方向。多肽類藥物能夠特異性模仿或阻斷蛋白質(zhì)間互相作用，能夠發(fā)揮特異性的免疫抑制造用，如小肽類藥物fuzeon能夠抑制病毒與淋巴細(xì)胞的融合，已經(jīng)用于治療hiv。二肽化合物mdp是分枝桿菌細(xì)胞壁中具有免疫活性的最小構(gòu)造單位，能激活單核巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用［10，11］。cms030在體外能顯著抑制cona誘導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提示cms030能夠抑制t淋巴細(xì)胞的非特異性增殖，是一種具有t淋巴細(xì)胞抑制造用的免疫活性藥物。cms030在體外mlr實(shí)驗(yàn)中顯示較強(qiáng)的抑制t淋巴細(xì)胞增殖的作用，表示清楚cms030能夠抑制特異性的t淋巴細(xì)胞功能，降低特異性抗原決定簇對t淋巴細(xì)胞的活化。體外實(shí)驗(yàn)提示，它可能對t細(xì)胞免疫功能和同種移植排擠反應(yīng)有一定的抑制造用。在小鼠心肌移植和皮膚移植動(dòng)物模型中，cms030能夠降低移植排擠反應(yīng)對移植物的損害，延長小鼠皮膚移植物和心肌細(xì)胞的存活時(shí)間，表示清楚cms030在體內(nèi)能夠發(fā)揮抗移植排擠的作用。同種移植排擠發(fā)生機(jī)制以細(xì)胞免疫為主，移植物出現(xiàn)大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤〔重要為t淋巴細(xì)胞〕，cd4+t細(xì)胞分泌il2等細(xì)胞因子，促進(jìn)cd4+t細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞增殖活化，cd4+t細(xì)胞介導(dǎo)超敏反應(yīng)性炎癥，cd8+t細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性，使移植物遭到排擠。本研究進(jìn)一步觀察cms030對皮膚移植受體小鼠t淋巴細(xì)胞功能的影響，討論cms030在移植排擠反應(yīng)中對機(jī)體細(xì)胞免疫水平的影響。cms030能抑制受體鼠t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表示清楚cms030能夠使t淋巴細(xì)胞增殖功能下降，進(jìn)而抑制機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，減輕移植排擠對移植物的損傷。移植排擠細(xì)胞免疫應(yīng)答經(jīng)過中，il2是啟動(dòng)移植排擠反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能夠直接反映細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，觀察體液il2水安然平靜t淋巴細(xì)胞il2誘生實(shí)驗(yàn)是監(jiān)測機(jī)體排擠反應(yīng)的主要指標(biāo)［12］。cms030能抑制cona誘導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞分泌的il2水平，表示清楚cms030能夠通過抑制il2的表達(dá)，降低t淋巴細(xì)胞成熟和活化的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，cms030能夠減少淋巴細(xì)胞分泌il2，降低機(jī)體細(xì)胞免疫功能，發(fā)揮對移植排擠反應(yīng)的治療作用。在本研究經(jīng)過中，cms030用藥組小鼠未發(fā)現(xiàn)有體重下降、行動(dòng)延遲緩慢等藥物副作用的表現(xiàn)，而在傳統(tǒng)免疫抑制劑的臨床應(yīng)用中，重要阻礙之一是藥物的毒副作用，如csa存在肝腎毒性，fk506具有腎毒性和神經(jīng)毒性等［13，14］。因而，cms030是一種有前途的抗移植排擠新藥，有望替代或部分替代正在使用的免疫抑制劑?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】1norenbergjp,krenningbj,koningsiretal.213bi［dota0,tyr3］octreotidepeptidereceptorradionuclidetherapyofpancreatictumorsinapreclinicalanimalmodel［j］.clincancerres,2006;12(3pt1):897903.2gronebergda,rabekf,fischera.novelconceptsofneuropeptidebaseddrugtherapy:vasoactiveintestinalpolypeptideanditsreceptors［j］.eurjpharmacol,2006;533(13):182194.3vakevaa,laurilap,meris.regulationofcomplementmembraneattackcomplexformationinmyocardialinfarction［j］.amjpathol,1993;143(1):6575.4jiankuom,xingbingw,baojunhetal.peptidenucleicacidantisenseprolongsskinallograftsurvivalbymeansofblockadeofcxcr3expressiondirectingtcellsintograft［j］.jimmunol,2003;170(3):15561565.5mayumih,shint,himenoketal.druginducedtolerancetoallograftsinmice〔ii〕.tolerancetotumorallograftsoflargedosesassociatedwithrejectionofskinallograftsandtumorallograftsofsmalldoses［j］.immunobiology,1985;169(2):147161.6馬濤,胡軍,蔡振杰etal.體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)對心臟移植急性排擠反應(yīng)的監(jiān)測作用［j］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006;27(1):2729.7duquesnoyrj,李幼平.移植免疫生物學(xué)［m］.北京：科學(xué)出版社,2000:85102.8aramburuj,yaffemb,lopezrodriguezcetal.affinitydrivenpeptideselectionofannfatinhibitormoreselectivethancyclosporina［j］.science,1999;285(5436):21292133.9magarik,miyatas,ohkuboyetal.calcineurininhibitorsexertrapidreductionofinflammatorypaininratadjuvantinducedarthritis［j］.brjpharmacol,2003;139(5):927934.10lius,luh,niujetal.differentfromthehivfusioninhibitorc34,theantihivdrugfuzeon(t20)inhibitshiv1entrybytarget