質(zhì)粒DNA的提取鑒定

質(zhì)粒DNA的提取鑒定質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!掌握堿變性法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA原理和方法。掌握瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒DNA的技術(shù)。一、實驗?zāi)康馁|(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!

質(zhì)粒（plasmid）是一種獨立的穩(wěn)定的遺傳因子，存在于細菌等細胞中。它們?yōu)殡p鏈、閉環(huán)的DNA分子，大小從1kb到200kb不等，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)并表達所攜帶的DNA基因信息，但其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要利用宿主細胞編碼的一些酶和蛋白質(zhì)，而宿主在沒有質(zhì)粒時是可以正常生長的。因此，質(zhì)粒是一種寄生性的自主復(fù)制子。細菌質(zhì)粒是基因工程中常用的基因載體，也是分子生物學(xué)中研究基因結(jié)構(gòu)、功能及其復(fù)制、表達的好材料。二、實驗原理質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!抽提中各種因素的影響，質(zhì)粒DNA可能以三種形式存在：1.共價閉環(huán)DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA），常以超螺旋形式存在；2.開環(huán)DNA（opencircularDNA，ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，形成缺刻，可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除了張力，形成松弛的環(huán)狀分子；3.線狀DNA（linearDNA，lDNA），質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂所形成。在電泳時，同一質(zhì)粒DNA的泳動速度根據(jù)遷移率從小到達分別為開環(huán)，線形和超螺旋DNA。

cccDNA含量越高，表明制備的質(zhì)粒DNA質(zhì)量越好。

質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!三、操作步驟詳見189-190頁質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!

不同的DNA片段由于其電荷、分子量大小及構(gòu)型的不同，在電泳時的泳動速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶。核酸構(gòu)型不同，在凝膠中的電泳速度差別較大。同一質(zhì)粒DNA的泳動速度次序為：

共價閉環(huán)DNA＞開環(huán)DNA＞線狀DNA。溴化乙錠可插入到DNA分子的雙鏈中。在波長254nm紫外光照射下插入溴化乙錠的DNA顯橙紅色熒光，所以溴化乙錠可以作熒光指示劑指示DNA含量和位置。四、DNA的瓊脂糖凝膠電泳原理質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!3.加樣：20ulTE+3ul上樣緩沖液，取6ul進行點樣4.電泳：電壓：60V電泳時間：0.5h電泳終止：指示劑距離凝膠前沿約1cm處5.檢測：取出膠板，用紫外檢測儀觀察結(jié)果。純的質(zhì)粒DNA只有超螺旋DNA一條帶。6.凝膠處理：鑒定后的凝膠應(yīng)放在指定的地方，待干燥后燒毀，不能倒在垃圾中，以防EB污染。五、瓊脂糖凝膠電泳操作步驟質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!堿變性抽提法法是常用的方法之一.此法基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性差異而達到分離的目的。在pH高達12.6的條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂、雙螺旋解開而變性；質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補鏈未完全分離，當(dāng)用pH4.8的Kac高鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，以可溶性狀態(tài)存在于液相中，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)等一起沉淀出來。二、實驗原理質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!50mM葡萄糖25mMTris-HCl10mMEDTA-Na2200mMNaOH1%（W/V）SDS3mMKAC25~10min30min以上質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!

1.瓊脂糖凝膠的制備：本實驗采用1.0%的瓊脂糖凝膠。稱取0.3g瓊脂糖放入錐形瓶，加入30ml電泳緩沖液，置于微波爐使其充分融化。室溫放置至60℃左右，加入EB使其終濃度為0.5ug/ml，混勻，倒膠板（30ml/板）。

2.凝膠板的制作：用1cm寬的膠帶紙沿平板電泳槽模板兩端邊緣圍成高4mm的墻，在其一端放置樣品梳。將準備好的模板置于水平臺上，迅速將上面膠液倒在模板的中央，讓膠液自由流向四周。待膠液充分冷卻凝固，將膠紙圍墻慢慢取下，制備好的凝膠板放入電泳槽中，加電泳緩沖液直至沒過膠面約1mm深，取出樣品梳。五、瓊脂糖凝膠電泳操作步驟質(zhì)粒DNA的提取鑒定共12頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!六、實驗報告要求一、原理二、操作三、結(jié)果（鉛筆繪圖：正負極，條帶數(shù)目、名稱、