基因工程的工具課件

專(zhuān)題1基因工程現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)重組DNA導(dǎo)入形成基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因工程的概念識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。主要是原核生物4000種。1、來(lái)源：2、種類(lèi)：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端黏性末端平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”1’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)3’端5’端3’端5’端G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵8限制酶的識(shí)別序列限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱(chēng)，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)排列的，稱(chēng)為回文序列

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。限制性內(nèi)切酶作用過(guò)程點(diǎn)擊播放你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。尋根問(wèn)底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵?；虻尼樉€：DNA連接酶

G

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G用同種限制酶切割A(yù)TGCATGC連接酶連接磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用過(guò)程：二、DNA連接酶——“分子縫合針”作用部位：是磷酸二酯鍵（扶手）不是氫鍵（梯子）DNA連接酶將兩條DNA鏈連接起來(lái)的酶。核苷酸分子的連接：ATGCATGCDNA聚合酶連接單鏈，把單個(gè)脫氧核苷酸連接到DNA片段上DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象

作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵E.coliDNA連接酶：連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏性末端平末端DNA連接酶種類(lèi)2.載體的必要條件1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行鑒定和選擇4）必須是安全的，對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。5）載體DNA分子應(yīng)大小適中，以便于提取和操作3.載體的種類(lèi)①質(zhì)粒②病毒：λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒等能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，將來(lái)可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別?；蜻M(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專(zhuān)一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類(lèi)E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件1、2、3、4、5、質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒第二節(jié)基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取目的基因主要是指______________________獲取目的基因的常用方法①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲取（基因組文庫(kù)，部分基因文庫(kù)）②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（變性，復(fù)性，延伸）③通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因基因文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如:cDNA文庫(kù)）1.基因文庫(kù)將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法①鳥(niǎo)槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶與載體連接載入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離（直接分離法）（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因②反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶H2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制_____________的核酸合成技術(shù)③條件：____________________、

_______________、___________(做啟動(dòng)子)、___________等②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制模板DNA四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-95℃）：目的基因DNA受熱變性，解鏈b、復(fù)性（55℃-65℃）：引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合c、延伸（70℃-75℃）：合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因三、根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量_____________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶切口DNA連接酶相同的黏性末端二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種4.過(guò)程:二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建5.基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因啟動(dòng)子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位。終止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來(lái)。標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建小結(jié)：一、獲取目的基因的常用方法①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲?。B(niǎo)槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，逆轉(zhuǎn)錄法構(gòu)建部分基因文庫(kù)，目的基因在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制）②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（目的基因在細(xì)胞外復(fù)制）③通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種過(guò)程:二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的基本操作程序第二課時(shí)轉(zhuǎn)化——方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）農(nóng)桿菌介紹（2）原理及適用范圍三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞顯微注射法：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中采用最多，最為有 效的方法操作程序：表達(dá)載體提純從雌性動(dòng)物體內(nèi)取出卵顯微注射胚胎早期培養(yǎng)胚胎移植顯微注射儀固定吸管微量注射針針尖極細(xì)（0.1至0.5μm）3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）常用大腸桿菌：

（2）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法

首先用Ca2+處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞。第二步是將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程。檢測(cè)鑒定：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來(lái)源的DNA分子①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因方法——DNA分子雜交復(fù)性RNADNA②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法——③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原抗體雜交鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等1.2基因工程的基本操作程序基因工程程序總結(jié)一、獲取目的基因的常用方法①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲?。B(niǎo)槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，逆轉(zhuǎn)錄法構(gòu)建部分基因文庫(kù)，目的基因在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制）②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（目的基因在細(xì)胞外復(fù)制）③通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)化——方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞檢測(cè)鑒定：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1）以下說(shuō)法正確的是A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)C隨堂練習(xí)2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD隨堂練習(xí)3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、運(yùn)載體和目的基因用同一種限制酶處理A隨堂練習(xí)4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D隨堂練習(xí)5）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的