微生物藥物的發(fā)酵工藝課件

微生物藥物發(fā)酵過程福建省微生物研究所周劍（副研究員）2014.05.23微生物藥物發(fā)酵過程福建省微生物研究所1微生物藥物工業(yè)生產(chǎn)的組成(原料藥）發(fā)酵分離菌種菌種選育菌種分離純化菌種制備保存搖瓶種子制備罐上種子制備發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵液預(yù)處理產(chǎn)物提取產(chǎn)物精制純化微生物藥物微生物藥物工業(yè)生產(chǎn)的組成(原料藥）發(fā)酵分離菌種菌種選育菌2（一）微生物藥物工業(yè)生產(chǎn)菌種工業(yè)生產(chǎn)用菌株不同于實驗室研究菌株，不但要求其產(chǎn)物合成能力能夠穩(wěn)定的表達(dá)，還應(yīng)追求產(chǎn)量盡可能的高，作為目標(biāo)產(chǎn)品的類似物盡可能的少，發(fā)酵產(chǎn)物盡可能的易于提取精制等。在工業(yè)生產(chǎn)中，需要對生產(chǎn)菌株不斷的純化、復(fù)壯和改良。（一）微生物藥物工業(yè)生產(chǎn)菌種工業(yè)生產(chǎn)用菌株不同于實驗室研究菌3工業(yè)生產(chǎn)菌株應(yīng)滿足的要求：能夠產(chǎn)生較高濃度的目標(biāo)產(chǎn)物；微生物藥物工業(yè)發(fā)酵中高濃度產(chǎn)物一般是胞外產(chǎn)物；產(chǎn)物便于分離提取；能利用易得廉價原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纖維素物質(zhì)等；不致病，不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，具備適中的發(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)，即發(fā)酵條件較溫和；容易進(jìn)行代謝調(diào)控。工業(yè)生產(chǎn)菌株應(yīng)滿足的要求：4菌種的選育1.尋找產(chǎn)生新化合物的菌種（略）2.現(xiàn)有微生物藥物產(chǎn)生菌種的選育目的：a.提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率水平，降低雜質(zhì)組分含量b.提高菌種對工業(yè)化生產(chǎn)條件的適應(yīng)力方法：a.自然純化選育b.傳統(tǒng)誘變選育（紫外線、誘變劑、離子束）c.代謝調(diào)控和條件模型選育d.基因工程選育菌種的選育5工業(yè)用菌種的分離純化正常菌退化菌傳代傳代傳代微生物遺傳變異是絕對的，穩(wěn)定是相對的；退化性的變異是多數(shù)的，進(jìn)化性的變異是少數(shù)的。不對工業(yè)用菌種加以分離純化，剔除變異菌，那么通過傳代的累積效應(yīng)，退化變異菌種將占據(jù)種群遺傳優(yōu)勢。最終導(dǎo)致生產(chǎn)水平的波動和下降。工業(yè)用菌種的分離純化正常菌退化菌傳代傳代傳代微生物遺傳變異是6菌種分離純化流程（例）保存菌種涂布平板點種平板斜面稀釋涂布單菌落點種接斜面擴(kuò)增生產(chǎn)能力鑒定斜面斜面菌種分離純化流程（例）保存菌種涂布平板點種平板斜面稀釋涂布單7菌種制備保存方式：1.短期制備保存短期制備保存方式主要用于生產(chǎn)用菌種的擴(kuò)增制備和短時保存。保證培養(yǎng)物能夠短時的保存在常溫或者冷藏條件下，隨時應(yīng)用于生產(chǎn)。主要包括：菌落平板試管/茄子瓶斜面麩皮/米孢子培養(yǎng)物2.中長期制備保藏中長期制備保存方式主要用于菌種中長期保存，保證菌種的遺傳特性和活力，保證生產(chǎn)菌種有可靠來源。主要包括：冷凍甘油管保藏冷凍干燥管保藏液氮甘油管保藏沙土/石蠟管保藏

基本原則：低營養(yǎng)/干燥/缺氧/低溫/密封菌種制備保存方式：基本原則：低營養(yǎng)/干燥/缺氧/低溫/密封8（二）微生物藥物發(fā)酵生產(chǎn)過程發(fā)酵生產(chǎn)流程概況生產(chǎn)菌種培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)一級種子罐培養(yǎng)二級種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物藥物的發(fā)酵生產(chǎn)包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)兩個階段。種子培養(yǎng)階段通過連續(xù)的擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得足夠量健壯均一的種子投入發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵生產(chǎn)包括生長期和生產(chǎn)期，生長期仍以菌量的擴(kuò)增為目的；當(dāng)營養(yǎng)消耗等條件適宜后，微生物即開始產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，進(jìn)入生產(chǎn)期。（二）微生物藥物發(fā)酵生產(chǎn)過程發(fā)酵生產(chǎn)流程概況生產(chǎn)菌種培養(yǎng)搖瓶9發(fā)酵種子培養(yǎng)過程遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期種子生長曲線種齡菌量種子的評價指標(biāo)：生長健壯旺盛，移入下一級后能迅速生長，遲滯期短菌體穩(wěn)定均一，生長同步性好菌體總量和生長密度適宜無雜菌污染發(fā)酵種子培養(yǎng)過程遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期種子生長曲線種齡菌量10發(fā)酵種子培養(yǎng)的調(diào)控

1.培養(yǎng)基碳源、氮源、無機鹽、生長因子是微生物生長的四大營養(yǎng)要素。一般而言，種子配方中碳/氮比要求均衡，量以滿足生長為宜，優(yōu)質(zhì)有機氮源要有一定比例。碳氮源種類選擇上則必須了解菌種的利用能力，并配合考慮種齡種量和發(fā)酵配方中碳氮源組成。2.環(huán)境因素影響菌種生理活性的因素包括了溫度、pH、溶氧、滲透壓、離子強度等。不同的菌種都有著其最適應(yīng)的范圍，從而進(jìn)行正常的生理代謝。所有上述因素的選擇在種子階段都應(yīng)以菌種的生長最適條件來進(jìn)行選擇。3.種子級數(shù)的設(shè)計種子培養(yǎng)級數(shù)越多，培養(yǎng)周期越長，過程中可能出現(xiàn)的不穩(wěn)定因素越多。在設(shè)備條件允許的情況下，應(yīng)盡可能縮減種子培養(yǎng)級數(shù)，提高每一級培養(yǎng)下菌體的擴(kuò)增量，保證下一級需要。

發(fā)酵種子培養(yǎng)的調(diào)控11發(fā)酵生產(chǎn)流程培養(yǎng)基投料溶解移入發(fā)酵罐定容調(diào)節(jié)滅菌前pH值高壓蒸汽滅菌降溫至培養(yǎng)溫度種子液移入調(diào)節(jié)空氣流量、攪拌速度、罐頂壓至規(guī)定值，開始發(fā)酵發(fā)酵生產(chǎn)流程培養(yǎng)基投料溶解移入發(fā)酵罐定容調(diào)節(jié)滅菌前pH值高壓12發(fā)酵生長曲線遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期發(fā)酵周期生長期生產(chǎn)期次生代謝發(fā)酵原理：當(dāng)微生物生長到一定階段，由于營養(yǎng)減少和有害代謝物積累，使比生長速率下降趨零。為了維持生存，微生物體觸發(fā)有關(guān)次生代謝基因，產(chǎn)生次生代謝物。以取得環(huán)境競爭優(yōu)勢，保存自身。發(fā)酵生長曲線遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期發(fā)酵周期生長期生產(chǎn)期次生13影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)基1.碳源碳源用于提供微生物能量來源、構(gòu)建細(xì)胞和形成產(chǎn)物。碳源包括單糖、雙糖、多糖、天然復(fù)合物、油脂、低級醇烴等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源達(dá)到5%以上就形成高滲透壓溶液，影響發(fā)酵。同時在一定濃度下碳源會阻遏產(chǎn)物合成酶，形成碳分解代謝物阻遏。2.氮源氮源是微生物蛋白質(zhì)和其他含氮有機物的來源，也參與形成含氮產(chǎn)物。氮源包括無機氮源和有機氮源，如氨鹽、硝酸鹽、玉米漿粉、蛋白胨等。無機氮中的銨離子及有機氮通過降解得到的銨離子也有阻遏產(chǎn)物合成酶的性質(zhì)。3.礦物鹽磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽是微生物能量代謝和生長的參與因素。鋅、鐵、鉬、鈷等是微生物所需要的微量元素。碳酸鈣可以調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，但鹽濃度達(dá)到一定程度則成為生長抑制和產(chǎn)抗調(diào)節(jié)因素。影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)基1.碳源144.生長因子許多微生物生長需要它們所不能合成的生長因子，如特殊氨基酸、維生素、生物素、嘌呤等。一般在天然復(fù)合物（如酵母粉、玉米漿）中有存在，但有時也必須單獨添加以保證需要。5.消泡劑發(fā)酵過程中，由于營養(yǎng)物分解代謝和菌體老化，加上發(fā)酵罐內(nèi)通氣和攪拌效果，易導(dǎo)致泡末產(chǎn)生，造成溶氧不足和逃液等問題?？赏ㄟ^消泡劑的添加控制泡末。一般消泡劑為高分子聚合物，如泡敵，聚乙二醇等。油類也具有類似效果，如豆油、葵花子油等。6.前體物質(zhì)次生代謝產(chǎn)物的合成往往需要特定化學(xué)結(jié)構(gòu)物質(zhì)作為反應(yīng)起始物。這些物質(zhì)雖然也能夠通過微生物代謝合成得到，但如果予以人為添加則可以有效減少限制，促進(jìn)產(chǎn)物合成。如青霉素發(fā)酵中添加苯乙酸，紅霉素發(fā)酵中添加正丙醇，達(dá)托霉素發(fā)酵中添加癸酸，雷帕霉素、環(huán)孢菌素等添加特定氨基酸效價可以提高好幾倍。影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)基4.生長因子影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)基15發(fā)酵工業(yè)中，一些常見前體物質(zhì)產(chǎn)品前體產(chǎn)品前體青霉素G青霉素V金霉素灰黃霉素紅霉素達(dá)托霉素苯乙酸苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇癸酸核黃素類胡蘿卜素L-異亮氨酸L-色氨酸L-絲氨酸西索霉素丙酸鹽β-紫羅酮-氨基丁酸鄰氨基苯甲酸甘氨酸蛋氨酸發(fā)酵工業(yè)中，一些常見前體物質(zhì)產(chǎn)品前體產(chǎn)品前體青霉素G苯乙酸核16前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利如苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%，癸酸必須培養(yǎng)15h后加入。前體添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，分解等。

因此，前體在使用過程中，常采用流加方法。用法：前體普遍采用流加的方法，流加有利于提高前體的轉(zhuǎn)化率。前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利如17產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。產(chǎn)物促進(jìn)劑產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入18

促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的（機理不詳）。有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)；也有人認(rèn)為表面活性劑對酶的表面失活有保護(hù)作用；有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的19在發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計中，一般先用合成成分鑒別特殊需要，再轉(zhuǎn)為天然培養(yǎng)基，以擴(kuò)大生產(chǎn)。在發(fā)酵培養(yǎng)基成分選擇是，除傳統(tǒng)營養(yǎng)外，可選用各種農(nóng)副產(chǎn)品、工業(yè)副產(chǎn)品、廢料等。開發(fā)天然培養(yǎng)基時，應(yīng)考慮：新選微生物及其工藝的特殊營養(yǎng)需求；為保持培養(yǎng)基成分穩(wěn)定，改善儲藏條件和加工條件；原料的性質(zhì)及配制、滅菌、發(fā)酵條件對產(chǎn)物提取的影響；培養(yǎng)基價格。發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計在發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計中，一般先用合成成分鑒別特殊需要，再轉(zhuǎn)為天然20培養(yǎng)基優(yōu)化（1）目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方。（2）只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照他人所使用的比較適合某一類菌種、某一類產(chǎn)品發(fā)酵的經(jīng)驗配方。（3）采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實驗設(shè)計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基優(yōu)化（1）目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計21培養(yǎng)基優(yōu)化的基本原則注意事項：（1）菌種特性，同化能力（2）合適的C、N比。（3）合適的快速利用碳源、氮源。（4）合適的生理性酸性與堿性（5）pH、離子強度等沒有最好，只有更好培養(yǎng)基優(yōu)化的基本原則注意事項：沒有最好，只有更好22提高生產(chǎn)率降低物耗、能耗、三廢排放提高發(fā)酵單位縮短生產(chǎn)時間價廉的原料替代，降低成本培養(yǎng)基優(yōu)化目標(biāo)提高生產(chǎn)率降低物耗、能耗、三廢排放提高發(fā)酵單位縮短生產(chǎn)時間價23正交實驗均勻設(shè)計神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)其他方法聚類分析響應(yīng)面分析單因子實驗成本發(fā)酵單位方法結(jié)果培養(yǎng)基優(yōu)化的基本方法正交均勻神經(jīng)其他聚類響應(yīng)面單因子成本方法結(jié)果培養(yǎng)基優(yōu)化的基本24影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件1.溫度溫度影響微生物酶系的活力，這些酶分別決定微生物的初級代謝生長和次級代謝產(chǎn)抗。不同微生物菌種的生長溫度不一樣，而生長和產(chǎn)抗階段的最適溫度也有差異。發(fā)酵溫度的設(shè)計要綜合考慮能源消耗、發(fā)酵周期、穩(wěn)定培養(yǎng)和產(chǎn)率水平因素，必要時可考慮變溫培養(yǎng)。2.pHpH對微生物的影響，主要也是作用于酶。另外對營養(yǎng)利用和細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有重要影響。無控制的條件下，pH呈現(xiàn)如下變化規(guī)律。有機氮分解，形成大量NH4+NH4+消耗利用碳源消耗產(chǎn)生有機酸菌體老化，進(jìn)入鳥氨酸循環(huán)形成大量NH4+菌體二次生長影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件1.溫度有機氮分解，25影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件

pH的調(diào)節(jié)首要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的設(shè)計，如生理酸堿性物質(zhì)的搭配、緩沖體系的設(shè)計等。另外可以加入外源性的酸堿物質(zhì)調(diào)控，如鹽酸、氨水等。在流補體系中，往往通過葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同時也兼具營養(yǎng)補充功能。3.氧的供應(yīng)工業(yè)微生物大都為好氧微生物，氧的供應(yīng)和利用影響初級生長和次級代謝。工業(yè)發(fā)酵中，將無菌空氣通入培養(yǎng)基，通過攪拌槳分散氣體以實現(xiàn)有效利用，同時維持一定罐頂壓以增大氧的溶解度。反映氧的供給和利用情況的數(shù)值包括：DO溶解氧、OUR攝氧率、Kla氧傳遞速率等，可通過溶氧電極、發(fā)酵尾氣分析儀等獲得。類似的，生長和產(chǎn)抗往往有不同的氧需求。通過調(diào)節(jié)通氣量、攪拌速率、罐壓可以有效控制和保證氧的供給。而發(fā)酵黏度、泡沫等因素往往導(dǎo)致氧利用的惡化，需要警惕和控制。影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件26影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件

4.滅菌條件發(fā)酵罐和培養(yǎng)基滅菌是無菌培養(yǎng)的必要前提，同時也導(dǎo)致營養(yǎng)損失和毒性物質(zhì)積累。因此對于敏感菌種往往需要對部分養(yǎng)分單獨滅菌，以降低影響。但是這些影響因素往往會成為控制生長、調(diào)節(jié)微生物產(chǎn)抗的必要因素。通過滅菌溫度、時間的調(diào)整來控制微生物發(fā)酵也是常用的手段。5.剪切力發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)中，攪拌促進(jìn)氧的分散利用，但槳葉尖端末速形成的剪切力也會損傷菌體，造成菌體斷裂破碎，進(jìn)而導(dǎo)致二次生長、黏度提高、菌種變異等情況，使發(fā)酵惡化。對于剪切，可以篩選耐剪切力菌種，提高菌種抵抗能力。在設(shè)備上也可以選擇低剪切、高分散效率的攪拌槳，如軸流推進(jìn)式槳葉。影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件4.滅菌條件27影響發(fā)酵的相關(guān)因素—其他因素

1.種子質(zhì)量的影響2.設(shè)備的影響良好可靠的發(fā)酵設(shè)備是發(fā)酵生產(chǎn)的必要因素。設(shè)備對于發(fā)酵生產(chǎn)的負(fù)面影響表現(xiàn)如：軸封磨損、管路接頭縫隙、過濾器失效導(dǎo)致染菌問題；攪拌不平衡導(dǎo)致罐體震動，影響供氧；開關(guān)閥門動作失靈導(dǎo)致溫度、pH控制不穩(wěn)等等。3.人員操作的影響人員操作是發(fā)酵生產(chǎn)控制的重要因素,對發(fā)酵生產(chǎn)各環(huán)節(jié)都有決定性影響。只有嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作，才能避免由于粗略和錯誤的影響。4.環(huán)境因素環(huán)境因素往往導(dǎo)致發(fā)酵水平的季節(jié)性波動。如環(huán)境空氣的溫濕度會使無菌空氣的溫濕度有差異，導(dǎo)致培養(yǎng)體積隨時間的增減，影響發(fā)酵環(huán)境。（健壯均一、足夠數(shù)量、縮短遲滯期）影響發(fā)酵的相關(guān)因素—其他因素（健壯均一、足夠數(shù)量、縮短遲滯期28發(fā)酵終點的判斷

1.發(fā)酵的評價指標(biāo)發(fā)酵產(chǎn)率：單位體積的產(chǎn)物含量g/L發(fā)酵總億：發(fā)酵液中產(chǎn)物總產(chǎn)量十億單位/kg發(fā)酵系數(shù)：產(chǎn)物總產(chǎn)量/總發(fā)酵體積*總發(fā)酵時間kg/m3*h發(fā)酵成本：發(fā)酵(原料+動力+人員+其他)成本/總產(chǎn)量元/kg2.終點判斷標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵終點的判斷主要從技術(shù)和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)兩方面來衡量。技術(shù)上需要尋找發(fā)酵總億與發(fā)酵系數(shù)的平衡點，當(dāng)總億增加，發(fā)酵系數(shù)卻趨低時即應(yīng)考慮放罐。同時從分離角度考慮，一方面殘余營養(yǎng)物要盡量減少，另一方面菌體自溶不能大量出現(xiàn)。此外，一旦難分離雜質(zhì)組分有升高趨勢，也將影響分離得率和總的成本。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，發(fā)酵終點應(yīng)處于最低發(fā)酵成本位置，但同時也應(yīng)兼顧分離提取需要。發(fā)酵終點的判斷1.發(fā)酵的評價指標(biāo)29（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹30（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹31微生物藥物的發(fā)酵工藝課件32微生物藥物的發(fā)酵工藝課件33微生物藥物的發(fā)酵工藝課件34微生物藥物的發(fā)酵工藝課件35微生物藥物的發(fā)酵工藝課件36工業(yè)發(fā)酵攪拌器技術(shù)的發(fā)展適用發(fā)酵過程的攪拌器徑向流圓盤攪拌器：

－Rushton渦輪

－半彎管圓盤渦輪

－BT-6軸向流攪拌器：

－窄葉高效軸流

A310，CBY,HE3，ZCX等

－寬葉高效軸流

A315，KSX,MaxFlo等

工業(yè)發(fā)酵攪拌器技術(shù)的發(fā)展適用發(fā)酵過程的攪拌器徑向流圓盤攪拌器37工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)紅霉素370噸發(fā)酵罐工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)紅霉素370噸發(fā)酵罐38工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)酶制劑-糖化酶工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)酶制劑-糖化酶39長城最新發(fā)酵攪拌技術(shù)發(fā)酵罐設(shè)計幾點經(jīng)驗發(fā)酵罐的長徑比H/D的考慮：考慮氣體的停留時間以及熱管的布置國內(nèi)一般考慮2.5到3。考慮攪拌的整體穩(wěn)定、換熱的能力以及罐體水柱背壓對壓縮機背壓的影響從而極大影響壓縮機能耗，國外例如DSM青霉素H/D=2，韓國希杰氨基酸H/D=1；由于攪拌能力提高靠大H/D提高氣含率，與低H/D沒有太大區(qū)別。氣含率的控制：對于目前高的氣含率提供好的供氧，但降低了罐容，我建議對于通氣比在1：0.5以內(nèi)的攪拌控制氣含率在6~8%，抗生素在8~12%之間。

長城最新發(fā)酵攪拌技術(shù)發(fā)酵罐設(shè)計幾點經(jīng)驗發(fā)酵罐的長徑比H/D的40長城最新發(fā)酵攪拌技術(shù)3換熱管的布置：豎型列管，大蛇管，排管，圓形列管束（列管式換熱器型），彈簧管，蜂窩擋板等等。采用形式與發(fā)酵液黏度、固形物含量，發(fā)酵液熱值等等有關(guān)。擋板（換熱管就是一定的擋板）的大小靠近全擋板的75%到80%為佳。豎管大蛇管彈簧管長城最新發(fā)酵攪拌技術(shù)3換熱管的布置：豎型列管，大蛇管，排41工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)小結(jié)大量的工業(yè)生物過程需要攪拌技術(shù)和設(shè)備，攪拌設(shè)備隨著發(fā)酵罐的容積的增大也越來越大；新的攪拌技術(shù)也不斷應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵過程。發(fā)酵罐的高徑比設(shè)計，換熱管的設(shè)計等都與攪拌設(shè)計密切相關(guān)，有許多經(jīng)驗可供參考。

工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)小結(jié)大量的工業(yè)生物過程需要攪拌技術(shù)和設(shè)備42（四）幾種抗生素的發(fā)酵工藝實例（1）青霉素的發(fā)酵工藝青霉素的產(chǎn)生菌——產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）51-20和點青霉（P.notatum），目前全世界用于青霉素生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株幾乎都是以產(chǎn)黃青霉為出發(fā)菌株，經(jīng)不同的改良途徑得到的。目前青霉素的發(fā)酵單位最高達(dá)到120000U/ml。（四）幾種抗生素的發(fā)酵工藝實例（1）青霉素的發(fā)酵工藝青霉素的43In1928,AlexanderFleming(left),aScottishbacteriologist,discoveredamoldwithbacteria-killingpowerssoincredibleitwaseffectiveevenwhendiluted800times.CourtesyoftheUSDA.Right,astrainofP.notatumwasusedforsomeofthefirsttestsofpencillin.CourtesyoftheFDA’sCenterforDrugEvaluationandResearch.In1928,AlexanderFleming(l44甘油、葡萄糖和蛋白胨組成的培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)砂土孢子生產(chǎn)孢子的制備大米或小米固體培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7d，孢子成熟后真空干燥，低溫保藏備用。甘油、葡萄糖和蛋白胨組成的培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)砂土孢子生產(chǎn)孢子的制45采用三級發(fā)酵，其目的是使青霉菌菌體數(shù)量逐步擴(kuò)大和適應(yīng)發(fā)酵，其次是使發(fā)酵罐連續(xù)使用，縮短發(fā)酵周期。一級發(fā)酵：小罐，使孢子萌芽形成菌絲；二級發(fā)酵：大量繁殖青霉菌菌絲體；三級發(fā)酵：繼續(xù)大量繁殖菌絲體，生產(chǎn)青霉素。大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)采用三級發(fā)酵，其目的是使青霉菌菌體數(shù)量逐步擴(kuò)大和適應(yīng)發(fā)酵，其46發(fā)酵的影響因素及控制碳源、氮源的影響和控制：葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌體的生長；乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素發(fā)酵中采用連續(xù)流加葡萄糖的方法，在發(fā)酵初期使青霉菌大量迅速強壯地繁殖菌絲體；發(fā)酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。玉米漿是青霉素發(fā)酵最好的氮源。

玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、生長素和一些前體物質(zhì)，含大約40%～50%固體物質(zhì)。在玉米浸泡過程中若長有乳酸菌和酵母菌，則提高玉米漿的質(zhì)量；若長有腐敗性細(xì)菌則降低玉米漿的質(zhì)量。（含有大量乳酸）玉米漿是微生物生長很普遍應(yīng)用的有機氮源，它還能促進(jìn)青霉素等抗生素的生物合成。發(fā)酵的影響因素及控制碳源、氮源的影響和控制：葡萄糖是容易利用47前體的影響和控制：苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可以作為青霉素G側(cè)鏈的前體物直接結(jié)合到青霉素分子中，也可以作為養(yǎng)料和能源被利用。苯乙酸、苯乙酰胺等對菌體生長和生物合成均有毒性。采用間歇或連續(xù)添加低濃度前體物質(zhì)的方法，保持前體的供應(yīng)率僅大于生物合成的需要，可以起到提高產(chǎn)量的作用。前體的影響和控制：苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘48pH的影響和控制：青霉素發(fā)酵的最適pH一般認(rèn)為是6.2-6.8，應(yīng)盡量避免pH超過7.0。當(dāng)pH高于最適pH時，通過補糖和生理酸性物質(zhì)（硫酸銨等無機氮源）降低pH；當(dāng)pH低于最適pH時，通過補加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通氣量，促進(jìn)有機酸氧化來提高pH?？衫米詣蛹尤胨峄驂A的方法維持pH。pH的影響和控制：青霉素發(fā)酵的最適pH一般認(rèn)為是6.2-6.49溫度的影響和控制：青霉菌生長的適宜溫度是30℃，分泌青霉素的適宜溫度是20℃，通常采用分段變溫控制法，使溫度適合不同階段的需要。0-56h維持在27.2℃，然后恒速降溫至18.7℃，并維持到184h，最后24h回復(fù)到27.2℃培養(yǎng)。這樣變溫培養(yǎng)法可比常溫25℃培養(yǎng)產(chǎn)量增加16%。溫度的影響和控制：青霉菌生長的適宜溫度是30℃，分泌青霉素的50補料控制：中間補糖以控制糖濃度和pH；補加氮源可延長發(fā)酵周期、調(diào)節(jié)pH、提高青霉素產(chǎn)量，控制發(fā)酵液中的氨基氮含量在0.01%-0.05%。補加表面活性劑，如新潔爾滅50mg/L、聚氧乙烯、山梨糖醇酐等也能增加青霉素的產(chǎn)量。補料控制：中間補糖以控制糖濃度和pH；51加入少量可溶性高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮（PVP），能使青霉素產(chǎn)率提高38%。（1）當(dāng)發(fā)酵罐使用較大的攪拌功率和較快的攪拌葉尖速時，這些高分子化合物能使臨近攪拌葉的液體速度梯度降低，避免打斷菌絲，而且促進(jìn)氧在培養(yǎng)基中充分溶解的同時還有利于除去CO2。（2）菌絲生長時，由于高分子化合物起到分散劑的作用，菌絲不致成團(tuán)，界面面積得以增加，因而增加了氧傳遞到菌絲體內(nèi)的總速度。加入少量可溶性高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二乙胺或聚乙烯吡咯52鐵離子的影響和控制：Fe3+對青霉素生物合成有顯著影響，一般當(dāng)發(fā)酵液中含量超過30-40μg/ml，則發(fā)酵單位增長緩慢。鐵制發(fā)酵罐在使用前必須進(jìn)行處理，可在罐壁涂上環(huán)氧樹脂等保護(hù)層，使Fe3+含量控制在30μg/ml以下。鐵離子的影響和控制：Fe3+對青霉素生物合成有顯著影響，一般53冷凍干孢子瓊脂斜面米孢子種子罐發(fā)酵罐提取工序菌種工藝：自身耐受性突變前體或前體類似物抗性突變營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變耐消泡劑的菌株細(xì)胞膜滲透性良好的菌株構(gòu)建基因工程菌株發(fā)酵的優(yōu)化控制碳、氮源pH溫度微量元素：鐵離子的影響補料:糖、硫酸銨、尿素、玉米漿前體化合物、水溶性高分子化合物、表面活性劑青霉素生產(chǎn)工藝流程冷凍干孢子瓊脂斜面米孢子種子罐發(fā)酵罐提取工序菌種工藝：發(fā)酵的54（2）達(dá)托霉素的發(fā)酵工藝達(dá)托霉素的產(chǎn)生菌——玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)（2）達(dá)托霉素的發(fā)酵工藝55daptomycin的分子結(jié)構(gòu)福建省微生物研究所由連接到一個環(huán)狀13-氨基酸肽的N-末端色氨酸上的癸酰基側(cè)鏈構(gòu)成。

daptomycin的分子結(jié)構(gòu)福建省微生物研究所由連接56達(dá)托霉素的作用機制福建省微生物研究所改變細(xì)胞膜電位，攪亂細(xì)胞膜對氨基酸等的轉(zhuǎn)運從而阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的生物合成；改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的性質(zhì)，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜使細(xì)菌內(nèi)容物外泄等。daptomycin是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能抑制G＋細(xì)菌細(xì)胞膜上特有成分脂磷壁酸合成的抗生素。

達(dá)托霉素的作用機制福建省微生物研究所改變細(xì)胞膜電位，攪亂細(xì)胞57化學(xué)半合成法首先經(jīng)玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵獲得達(dá)托霉素原形藥然后經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化、化學(xué)半合成最終形成達(dá)托霉素。工藝路線長，存在兩步發(fā)酵，發(fā)酵效率和提取收率低，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。生物定向合成法利用癸酸作為發(fā)酵的前體物直接由微生物發(fā)酵產(chǎn)生達(dá)托霉素。一步發(fā)酵，發(fā)酵效率高，工藝路線短，提取收率也比較高。達(dá)托霉素生物合成途徑化學(xué)半合成法生物定向合成法達(dá)托霉素生物合成途徑58

從抗生素A21978C到daptomycin

從抗生素A21978C到daptomycin59誘變推理選育高產(chǎn)菌種搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化常規(guī)誘變：紫外輻射、NTG、抗生素處理等遺傳穩(wěn)定性菌種保藏工藝單因素、正交、響應(yīng)曲面法等搖瓶流加癸酸鹽癸酸耐受性菌種遺傳改良誘變推理選育高產(chǎn)菌種搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化常規(guī)誘變：紫外輻射、NT60菌種工藝菌種用冷凍干燥法或甘油管法保存，并嚴(yán)格控制有效使用期；所有生產(chǎn)用菌種或斜面都保存于低溫冷庫內(nèi)（0-4℃），并限制其使用期限；嚴(yán)格控制生產(chǎn)菌落在斜面上的傳代次數(shù)，一般以3代為限，用單菌落轉(zhuǎn)種，以使用新鮮斜面為原則；定期進(jìn)行菌種的純化篩選，淘汰退化的菌落；不斷選育高單位的新菌種。達(dá)托霉素產(chǎn)生菌容易發(fā)生變異菌種工藝菌種用冷凍干燥法或甘油管法保存，并嚴(yán)格控制有效使用期61大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)采用高度通氣攪拌、3-4級的擴(kuò)大深層培養(yǎng)法發(fā)酵。菌種（冷凍干燥管或甘油管）→斜面→搖瓶種子（1-2級）→種子罐種子（1-3級）→大罐發(fā)酵（7-8d）發(fā)酵過程控制pH（流加氨水）適當(dāng)時機補料前體物質(zhì)癸酸（采用不同的形式：癸酸鹽或溶于有機溶劑）大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)采用高度通氣攪拌、3-4級的擴(kuò)大深層培養(yǎng)法發(fā)酵62發(fā)酵的影響因素及控制碳源、氮源的影響和控制：首選碳源是馬鈴薯糊精；可利用碳源：葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、麥芽糊精等等有機氮源以黃豆餅粉為佳，無機氮源以硫酸銨和尿素最常用，氨水可用來調(diào)節(jié)發(fā)酵pH。有機氮源：酵母粉、黃豆粉、黃豆餅粉、玉米漿粉、蛋白胨、棉籽粉無機氮源：硫酸銨、尿素、硝酸銨、檸檬酸三銨、磷酸氫二銨等發(fā)酵的影響因素及控制碳源、氮源的影響和控制：首選碳源是馬鈴薯63無機鹽及微量元素的影響和控制：磷酸鹽對菌體生長和抗生素的合成非常重要，一般采用較低的磷酸鹽濃度，15-150mmol/L（46.5-465mg/L）；Fe2+一般適用量在20μg/ml（FeSO4、(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O

）生物素（biotin）、維生素C、維生素B12；無機鹽及微量元素的影響和控制：磷酸鹽對菌體生長和抗生素的合成64通氣和攪拌的影響和控制：增加通氣量，保持一定攪拌速度，避免長期停止攪拌和悶罐。通氣和攪拌的影響和控制：增加通氣量，保持一定攪拌速度，避免長65溫度、pH的影響和控制：玫瑰孢鏈霉素發(fā)酵溫度以30℃為宜；玫瑰孢鏈霉素菌絲生長的最適pH為7.0左右，適于達(dá)托霉素合成的pH為6.5-6.8。溫度、pH的影響和控制：玫瑰孢鏈霉素發(fā)酵溫度以30℃為宜；66補加葡萄糖、硫酸銨和氨水，不僅為菌體生長和產(chǎn)物合成提供營養(yǎng)物質(zhì)，還能調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。前體物癸酸對細(xì)胞毒性大，很小劑量就可以抑制細(xì)胞生長，甚至導(dǎo)致死亡；但是作為達(dá)托霉素的側(cè)鏈，在發(fā)酵適當(dāng)時機加入可以大大提高達(dá)托霉素產(chǎn)量（約5~10倍）由于癸酸對細(xì)胞具有毒性，而且其在常溫下是呈固體狀。所以必須通過溶劑溶解后再由補料的方式流加。一般采用油酸甲酯、乙醇等溶解癸酸，但是溶解在油酸甲酯或乙醇中的癸酸仍然對細(xì)胞具有較大毒性，并且溫度低時容易結(jié)晶析出，影響流加效果。而癸酸鹽在常溫下能夠以液體的形式存在，并且游離癸酸根離子對細(xì)胞的毒性相對效價。因此可以作為達(dá)托霉素側(cè)鏈的供體。

補料控制補加葡萄糖、硫酸銨和氨水，不僅為菌體生長和產(chǎn)物合成提供營養(yǎng)物67種子罐為200L，裝料70%，培養(yǎng)溫度：30±1℃，罐壓：0.03-0.05MPa，空氣流量：1：1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速150～300rpm，發(fā)酵過程用濃氨水調(diào)節(jié)pH不低于6.5。菌容達(dá)到30%左右，約30h移入2噸二級罐（培養(yǎng)基同發(fā)酵罐）裝液量為70%，移種量為5%～10%，培養(yǎng)溫度：30±1℃，罐壓：0.03-0.05MPa，空氣流量：1：1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速150～250rpm，發(fā)酵過程用濃氨水調(diào)節(jié)pH不低于6.5。在培養(yǎng)15hr左右（菌容為20%），移入發(fā)酵罐10噸，移種量15%，培養(yǎng)溫度：30±1℃，罐壓：0.03-0.05MPa，空氣流量：1：1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速150～250rpm，發(fā)酵過程用濃氨水調(diào)節(jié)pH不低于6.5。發(fā)酵24h后開始補料流加癸酸鹽溶液（癸酸鈉、癸酸鉀、癸酸銨），流速0.5----3.0ml/L/H至發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中達(dá)托霉素效價達(dá)到1000～1700mg/l左右。

種子罐為200L，裝料70%，培養(yǎng)溫度：30±1℃，罐壓：068發(fā)酵前期控制：原材料、滅菌、種子質(zhì)量、菌體形態(tài)溶氧對發(fā)酵的影響：攪拌、通氣、罐壓、補水等菌體比生長速率跟抗生素產(chǎn)量的關(guān)系淀粉酶活性的變化規(guī)律糖氮、溶磷曲線規(guī)律前體物的添加策略：癸酸的組分形式、補料時機、流加速度、發(fā)酵液中殘余癸酸濃度等最大限度的發(fā)揮高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)性能連續(xù)多批次在100L發(fā)酵罐上實現(xiàn)高產(chǎn)，在工廠3噸發(fā)酵罐以及10噸生產(chǎn)罐上實現(xiàn)工藝重復(fù)。達(dá)托霉素發(fā)酵過程控制研究發(fā)酵前期控制：原材料、滅菌、種子質(zhì)量、菌體形態(tài)最大限度的發(fā)揮69發(fā)酵曲線分析發(fā)酵曲線分析70微生物藥物的發(fā)酵工藝課件71發(fā)酵曲線分析發(fā)酵曲線分析72發(fā)酵液預(yù)處理：加熱、調(diào)酸、加絮凝劑、硅藻土過濾：濾布的孔徑、陶瓷膜的孔徑超濾、納濾溶媒萃取樹脂分離分離提煉工藝發(fā)酵液預(yù)處理：加熱、調(diào)酸、加絮凝劑、硅藻土分離提煉工藝73

本實驗室在一株鏈霉菌NOV-0827產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)香豆素類抗生素新生霉素（novobiocin），大環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素BE-14106（GT-32A）和GT-32B。

（3）新化合物的發(fā)現(xiàn)及發(fā)酵工藝優(yōu)化本實驗室在一株鏈霉菌NOV-0827產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)74原始菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天。待菌體發(fā)育成熟后，將斜面接入種子培養(yǎng)基，種子在28℃，轉(zhuǎn)速220rpm條件下培養(yǎng)48h后，再以5%的接種量接到裝液量60ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，220rpm條件下培養(yǎng)144h。流程為：斜面

7天，28℃種子培養(yǎng)基

48h，28℃發(fā)酵培養(yǎng)基

144h，28℃

發(fā)酵液菌株發(fā)酵基本流程原始菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天。待菌體發(fā)育成熟75原始菌株經(jīng)自然選育，得到了14株不同形態(tài)的菌株，編號依次為1#-14#。再對這14株菌株進(jìn)行篩選，以新生霉素的產(chǎn)量為指標(biāo)，篩選出效價較高的4#和5#菌株。菌株形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：無孢子的菌株相對于有孢子的菌株，新生霉素的效價更高。各篩選菌株相對效價的比較圖

篩選菌株形態(tài)圖注：從左至右依次為：1#、8#（有孢子);4#、5#（無孢子）原始菌株經(jīng)自然選育，得到了14株不同形態(tài)的菌株，編號依次為176傳代次數(shù)相對效價（100%）1#8#4#5#F1100100100100F2107.496.2118.492.3F3113.5100.8120.699.4F498.2114.3123.6101.2F5107.8108.5118.9103.6篩選菌株傳代穩(wěn)定性考察對篩選出的4株菌株進(jìn)行分別5次傳代培養(yǎng)，以生長良好的第一代菌株為對照，分別考察各代新生霉素產(chǎn)量的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：各篩選菌株的遺傳穩(wěn)定性良好，可作為下一步的實驗菌。傳代次數(shù)相對效價（100%）1#8#4#5#F110010077顯微鏡下菌絲體形態(tài)圖注：A：4倍；B：10倍；C：40倍；D：100倍ABCD對種子及發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行取樣、涂片、染色后，鏡檢觀察菌絲體形態(tài)，鏡檢結(jié)果顯示：菌絲體長勢良好，菌絲茁壯、茂密、舒展，無結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。顯微鏡下菌絲體形態(tài)圖ABCD對種子及發(fā)酵培養(yǎng)78

在本部分的研究中，對原始出發(fā)菌株經(jīng)自然選育和初步篩選，得到了1株編號為4#，菌株形態(tài)觀察無孢子的菌株，其新生霉素的效價最高。且傳代穩(wěn)定性實驗表明其遺傳穩(wěn)定性良好，可作為下一步實驗菌。因此，選擇效價最高的4#菌株為下一步的實驗菌株，其新生霉素的效價較原始菌株提高了272.6%。在本部分的研究中，對原始出發(fā)菌株經(jīng)自然選育和79發(fā)酵罐總發(fā)酵液HPLC圖化合物B化合物C化合物A實驗過程中，初步發(fā)現(xiàn)了3個較明顯的化合物峰，標(biāo)記為化合物A、B、C。首先以效價較高的化合物B為指標(biāo)，利用單因素實驗優(yōu)選出合適的碳氮源及微量元素。進(jìn)一步利用正交實驗設(shè)計法，分別以化合物B和化合物C的產(chǎn)量為指標(biāo)，優(yōu)選出各自合適的培養(yǎng)基配比，得到各自培養(yǎng)基的優(yōu)勢配方。發(fā)酵罐總發(fā)酵液HPLC圖化合物B化合物C化合物A80●單因素實驗設(shè)計(碳源、氮源及微量元素的選擇)●正交實驗設(shè)計（研究碳源、氮源以及微量元素之間的交互作用）●發(fā)酵過程的影響因素及其控制（從發(fā)酵周期、淀粉酶、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、消泡劑等方面來考察）●單因素實驗設(shè)計81單因素實驗設(shè)計結(jié)果1、發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的選擇由圖可見，糊精和甘油作為新碳源，相較原始培養(yǎng)基的碳源葡萄糖和玉米淀粉，四者化合物B的效價未見顯著差異。因此，選用糊精、甘油、葡萄糖、玉米淀粉作為候選碳源進(jìn)行下一步的分析比較。單因素實驗設(shè)計結(jié)果1、發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的選擇由822、發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的選擇由圖可見，只有蛋白胨作為新氮源，相較原始培養(yǎng)基的氮源黃豆餅粉和酵母粉，三者化合物B的效價未見顯著差異。因此，選用蛋白胨、黃豆餅粉、酵母粉作為候選氮源進(jìn)行下一步的分析比較。2、發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的選擇由圖可見，只有蛋白胨833、發(fā)酵培養(yǎng)基微量元素的選擇

由圖可見，NH4Cl和MgSO4作為新微量元素，相較原始培養(yǎng)基的微量元素NaCl和KH2PO4，四者化合物B的效價未見顯著差異。因此，選用NH4Cl、MgSO4、NaCl、KH2PO4作為候選微量元素進(jìn)行下一步的分析比較。3、發(fā)酵培養(yǎng)基微量元素的選擇由圖可見，NH484正交實驗設(shè)計結(jié)果因素黃豆餅粉酵母粉蛋白胨葡萄糖甘油玉米淀粉糊精氯化銨氯化鈉磷酸二氫鉀硫酸鎂110.50.5111100.500232233330.120.10.1第一次正交設(shè)計因素水平表L12(211)（%）因素黃豆餅粉酵母粉葡萄糖甘油玉米淀粉糊精氯化鈉磷酸二氫鉀硫酸鎂12120.5220.10.050.0523231330.50.10.134341.54410.20.2第二次正交設(shè)計因素水平表L27(313)（%）根據(jù)第一次正交實驗的結(jié)果，篩選出具有統(tǒng)計學(xué)意義的因素，對有意義的因素具體取值范圍進(jìn)一步設(shè)計，以獲得各因素的最佳比例。根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，篩選出幾種效價較高的碳源、氮源及微量元素，對各因素的取值范圍進(jìn)行合理設(shè)計后，按第一次正交實驗設(shè)計表進(jìn)行實驗。正交實驗設(shè)計結(jié)果因素黃豆餅粉酵母粉蛋白胨葡萄糖甘油玉米淀粉糊85兩次正交實驗方差分析表（化合物B）對于化合物B：根據(jù)上述方差分析，結(jié)果顯示：P<0.05的因素具有統(tǒng)計學(xué)意義，能認(rèn)為它們水平的高低對于產(chǎn)物濃度有影響。得出化合物B的優(yōu)勢配方為：黃豆餅粉2%或3%，酵母粉2%，葡萄糖2%，甘油0.5%或1.5%，玉米淀粉3%，糊精3%，NaCl1%，KH2PO40.1%，MgSO40.2%。兩次正交實驗方差分析表（化合物B）對于化合物B：根據(jù)86兩次正交實驗方差分析表（化合物C）根據(jù)上述方差分析，結(jié)果顯示：全部因素均具有統(tǒng)計學(xué)意義，能認(rèn)為它們水平的高低對于產(chǎn)物濃度有影響。得出化合物C的優(yōu)勢配方為：黃豆餅粉3%，酵母粉2%，葡萄糖3%或4%，甘油0.5%，玉米淀粉2%，糊精4%，NaCl1%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%。對于化合物C：兩次正交實驗方差分析表（化合物C）根據(jù)上述方差分析，87發(fā)酵培養(yǎng)條件對產(chǎn)物的影響發(fā)酵周期對發(fā)酵的影響淀粉酶對發(fā)酵的影響搖瓶轉(zhuǎn)速及裝液量對發(fā)酵的影響接種量對發(fā)酵的影響消泡劑對發(fā)酵的影響發(fā)酵培養(yǎng)條件對產(chǎn)物的影響發(fā)酵周期對發(fā)酵的影響881、發(fā)酵周期對發(fā)酵的影響

由圖可見：化合物A的最佳發(fā)酵周期為120h；而化合物B的最佳發(fā)酵周期為168h；化合物C的最佳發(fā)酵周期為168h。1、發(fā)酵周期對發(fā)酵的影響由圖可見：化合物A的最佳發(fā)酵892、淀粉酶對發(fā)酵的影響由圖可見：加酶與否對化合物A、B、C的效價影響不顯著。2、淀粉酶對發(fā)酵的影響由圖可見：加酶與否對化合物A、903、搖瓶裝液量對發(fā)酵的影響由圖可見：化合物A的最佳裝液量為80ml；化合物B的最佳裝液量為80ml；而化合物C的最佳裝液量為90ml。3、搖瓶裝液量對發(fā)酵的影響由圖可見：化合物A的最佳裝液914、搖瓶轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響由圖可見：化合物A和C的最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為250rpm；而化合物B的最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為220rpm。4、搖瓶轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響由圖可見：化合物A和C的最佳925、接種量對發(fā)酵的影響由圖可見：化合物A、B和C的最佳接種量都為5%。5、接種量對發(fā)酵的影響由圖可見：化合物A、B和C的最936、消泡劑對發(fā)酵的影響由圖可見：消泡劑（泡敵）濃度越高，對化合物A和B有抑制作用，而對化合物C有促進(jìn)作用。6、消泡劑對發(fā)酵的影響由圖可見：消泡劑（泡敵）濃度越94小結(jié)對篩選菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了探索，首先對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。在篩選合適的碳氮源種類的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交實驗的設(shè)計方法，進(jìn)一步優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，得出各化合物最優(yōu)勢的配方組合。經(jīng)過優(yōu)化后，化合物B的效價相較于原始菌株效價，提升了323.2%；化合物C的效價相較于原始菌株效價，提升了241.4%。其次針對不同化合物的發(fā)酵條件，從發(fā)酵周期、淀粉酶、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、消泡劑等方面，對搖瓶的發(fā)酵工藝也進(jìn)行了優(yōu)化。

小結(jié)對篩選菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了探索，首先對其發(fā)酵培95菌株快速確認(rèn)目標(biāo)化合物（檢測條件建立）參考文獻(xiàn)對目標(biāo)化合物發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行初步優(yōu)化確認(rèn)幾種可能對產(chǎn)物影響較大的培養(yǎng)基，進(jìn)行單因素或兩因素多水平試驗正交實驗、響應(yīng)面曲線、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等統(tǒng)計學(xué)方法可能的代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化，添加前體物、氨基酸、pH控制、補料等等工藝菌株96大孔吸附樹脂在微生物藥物發(fā)酵過程的應(yīng)用埃博霉素、普那霉素、安絲菌素、絲裂霉素等價格昂貴/目標(biāo)化合物不穩(wěn)定/產(chǎn)量微量大孔吸附樹脂在微生物藥物發(fā)酵過程的應(yīng)用埃博霉素、普那霉素、安97吡咯類大環(huán)內(nèi)脂類多烯類吡咯類大環(huán)內(nèi)脂類多烯類98微生物藥物發(fā)酵過程福建省微生物研究所周劍（副研究員）2014.05.23微生物藥物發(fā)酵過程福建省微生物研究所99微生物藥物工業(yè)生產(chǎn)的組成(原料藥）發(fā)酵分離菌種菌種選育菌種分離純化菌種制備保存搖瓶種子制備罐上種子制備發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵液預(yù)處理產(chǎn)物提取產(chǎn)物精制純化微生物藥物微生物藥物工業(yè)生產(chǎn)的組成(原料藥）發(fā)酵分離菌種菌種選育菌100（一）微生物藥物工業(yè)生產(chǎn)菌種工業(yè)生產(chǎn)用菌株不同于實驗室研究菌株，不但要求其產(chǎn)物合成能力能夠穩(wěn)定的表達(dá)，還應(yīng)追求產(chǎn)量盡可能的高，作為目標(biāo)產(chǎn)品的類似物盡可能的少，發(fā)酵產(chǎn)物盡可能的易于提取精制等。在工業(yè)生產(chǎn)中，需要對生產(chǎn)菌株不斷的純化、復(fù)壯和改良。（一）微生物藥物工業(yè)生產(chǎn)菌種工業(yè)生產(chǎn)用菌株不同于實驗室研究菌101工業(yè)生產(chǎn)菌株應(yīng)滿足的要求：能夠產(chǎn)生較高濃度的目標(biāo)產(chǎn)物；微生物藥物工業(yè)發(fā)酵中高濃度產(chǎn)物一般是胞外產(chǎn)物；產(chǎn)物便于分離提取；能利用易得廉價原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纖維素物質(zhì)等；不致病，不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，具備適中的發(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)，即發(fā)酵條件較溫和；容易進(jìn)行代謝調(diào)控。工業(yè)生產(chǎn)菌株應(yīng)滿足的要求：102菌種的選育1.尋找產(chǎn)生新化合物的菌種（略）2.現(xiàn)有微生物藥物產(chǎn)生菌種的選育目的：a.提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率水平，降低雜質(zhì)組分含量b.提高菌種對工業(yè)化生產(chǎn)條件的適應(yīng)力方法：a.自然純化選育b.傳統(tǒng)誘變選育（紫外線、誘變劑、離子束）c.代謝調(diào)控和條件模型選育d.基因工程選育菌種的選育103工業(yè)用菌種的分離純化正常菌退化菌傳代傳代傳代微生物遺傳變異是絕對的，穩(wěn)定是相對的；退化性的變異是多數(shù)的，進(jìn)化性的變異是少數(shù)的。不對工業(yè)用菌種加以分離純化，剔除變異菌，那么通過傳代的累積效應(yīng)，退化變異菌種將占據(jù)種群遺傳優(yōu)勢。最終導(dǎo)致生產(chǎn)水平的波動和下降。工業(yè)用菌種的分離純化正常菌退化菌傳代傳代傳代微生物遺傳變異是104菌種分離純化流程（例）保存菌種涂布平板點種平板斜面稀釋涂布單菌落點種接斜面擴(kuò)增生產(chǎn)能力鑒定斜面斜面菌種分離純化流程（例）保存菌種涂布平板點種平板斜面稀釋涂布單105菌種制備保存方式：1.短期制備保存短期制備保存方式主要用于生產(chǎn)用菌種的擴(kuò)增制備和短時保存。保證培養(yǎng)物能夠短時的保存在常溫或者冷藏條件下，隨時應(yīng)用于生產(chǎn)。主要包括：菌落平板試管/茄子瓶斜面麩皮/米孢子培養(yǎng)物2.中長期制備保藏中長期制備保存方式主要用于菌種中長期保存，保證菌種的遺傳特性和活力，保證生產(chǎn)菌種有可靠來源。主要包括：冷凍甘油管保藏冷凍干燥管保藏液氮甘油管保藏沙土/石蠟管保藏

基本原則：低營養(yǎng)/干燥/缺氧/低溫/密封菌種制備保存方式：基本原則：低營養(yǎng)/干燥/缺氧/低溫/密封106（二）微生物藥物發(fā)酵生產(chǎn)過程發(fā)酵生產(chǎn)流程概況生產(chǎn)菌種培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)一級種子罐培養(yǎng)二級種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物藥物的發(fā)酵生產(chǎn)包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)兩個階段。種子培養(yǎng)階段通過連續(xù)的擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得足夠量健壯均一的種子投入發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵生產(chǎn)包括生長期和生產(chǎn)期，生長期仍以菌量的擴(kuò)增為目的；當(dāng)營養(yǎng)消耗等條件適宜后，微生物即開始產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，進(jìn)入生產(chǎn)期。（二）微生物藥物發(fā)酵生產(chǎn)過程發(fā)酵生產(chǎn)流程概況生產(chǎn)菌種培養(yǎng)搖瓶107發(fā)酵種子培養(yǎng)過程遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期種子生長曲線種齡菌量種子的評價指標(biāo)：生長健壯旺盛，移入下一級后能迅速生長，遲滯期短菌體穩(wěn)定均一，生長同步性好菌體總量和生長密度適宜無雜菌污染發(fā)酵種子培養(yǎng)過程遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期種子生長曲線種齡菌量108發(fā)酵種子培養(yǎng)的調(diào)控

1.培養(yǎng)基碳源、氮源、無機鹽、生長因子是微生物生長的四大營養(yǎng)要素。一般而言，種子配方中碳/氮比要求均衡，量以滿足生長為宜，優(yōu)質(zhì)有機氮源要有一定比例。碳氮源種類選擇上則必須了解菌種的利用能力，并配合考慮種齡種量和發(fā)酵配方中碳氮源組成。2.環(huán)境因素影響菌種生理活性的因素包括了溫度、pH、溶氧、滲透壓、離子強度等。不同的菌種都有著其最適應(yīng)的范圍，從而進(jìn)行正常的生理代謝。所有上述因素的選擇在種子階段都應(yīng)以菌種的生長最適條件來進(jìn)行選擇。3.種子級數(shù)的設(shè)計種子培養(yǎng)級數(shù)越多，培養(yǎng)周期越長，過程中可能出現(xiàn)的不穩(wěn)定因素越多。在設(shè)備條件允許的情況下，應(yīng)盡可能縮減種子培養(yǎng)級數(shù)，提高每一級培養(yǎng)下菌體的擴(kuò)增量，保證下一級需要。

發(fā)酵種子培養(yǎng)的調(diào)控109發(fā)酵生產(chǎn)流程培養(yǎng)基投料溶解移入發(fā)酵罐定容調(diào)節(jié)滅菌前pH值高壓蒸汽滅菌降溫至培養(yǎng)溫度種子液移入調(diào)節(jié)空氣流量、攪拌速度、罐頂壓至規(guī)定值，開始發(fā)酵發(fā)酵生產(chǎn)流程培養(yǎng)基投料溶解移入發(fā)酵罐定容調(diào)節(jié)滅菌前pH值高壓110發(fā)酵生長曲線遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期發(fā)酵周期生長期生產(chǎn)期次生代謝發(fā)酵原理：當(dāng)微生物生長到一定階段，由于營養(yǎng)減少和有害代謝物積累，使比生長速率下降趨零。為了維持生存，微生物體觸發(fā)有關(guān)次生代謝基因，產(chǎn)生次生代謝物。以取得環(huán)境競爭優(yōu)勢，保存自身。發(fā)酵生長曲線遲滯期對數(shù)期平臺期衰亡期發(fā)酵周期生長期生產(chǎn)期次生111影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)基1.碳源碳源用于提供微生物能量來源、構(gòu)建細(xì)胞和形成產(chǎn)物。碳源包括單糖、雙糖、多糖、天然復(fù)合物、油脂、低級醇烴等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源達(dá)到5%以上就形成高滲透壓溶液，影響發(fā)酵。同時在一定濃度下碳源會阻遏產(chǎn)物合成酶，形成碳分解代謝物阻遏。2.氮源氮源是微生物蛋白質(zhì)和其他含氮有機物的來源，也參與形成含氮產(chǎn)物。氮源包括無機氮源和有機氮源，如氨鹽、硝酸鹽、玉米漿粉、蛋白胨等。無機氮中的銨離子及有機氮通過降解得到的銨離子也有阻遏產(chǎn)物合成酶的性質(zhì)。3.礦物鹽磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽是微生物能量代謝和生長的參與因素。鋅、鐵、鉬、鈷等是微生物所需要的微量元素。碳酸鈣可以調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，但鹽濃度達(dá)到一定程度則成為生長抑制和產(chǎn)抗調(diào)節(jié)因素。影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)基1.碳源1124.生長因子許多微生物生長需要它們所不能合成的生長因子，如特殊氨基酸、維生素、生物素、嘌呤等。一般在天然復(fù)合物（如酵母粉、玉米漿）中有存在，但有時也必須單獨添加以保證需要。5.消泡劑發(fā)酵過程中，由于營養(yǎng)物分解代謝和菌體老化，加上發(fā)酵罐內(nèi)通氣和攪拌效果，易導(dǎo)致泡末產(chǎn)生，造成溶氧不足和逃液等問題?？赏ㄟ^消泡劑的添加控制泡末。一般消泡劑為高分子聚合物，如泡敵，聚乙二醇等。油類也具有類似效果，如豆油、葵花子油等。6.前體物質(zhì)次生代謝產(chǎn)物的合成往往需要特定化學(xué)結(jié)構(gòu)物質(zhì)作為反應(yīng)起始物。這些物質(zhì)雖然也能夠通過微生物代謝合成得到，但如果予以人為添加則可以有效減少限制，促進(jìn)產(chǎn)物合成。如青霉素發(fā)酵中添加苯乙酸，紅霉素發(fā)酵中添加正丙醇，達(dá)托霉素發(fā)酵中添加癸酸，雷帕霉素、環(huán)孢菌素等添加特定氨基酸效價可以提高好幾倍。影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)基4.生長因子影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)基113發(fā)酵工業(yè)中，一些常見前體物質(zhì)產(chǎn)品前體產(chǎn)品前體青霉素G青霉素V金霉素灰黃霉素紅霉素達(dá)托霉素苯乙酸苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇癸酸核黃素類胡蘿卜素L-異亮氨酸L-色氨酸L-絲氨酸西索霉素丙酸鹽β-紫羅酮-氨基丁酸鄰氨基苯甲酸甘氨酸蛋氨酸發(fā)酵工業(yè)中，一些常見前體物質(zhì)產(chǎn)品前體產(chǎn)品前體青霉素G苯乙酸核114前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利如苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%，癸酸必須培養(yǎng)15h后加入。前體添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，分解等。

因此，前體在使用過程中，常采用流加方法。用法：前體普遍采用流加的方法，流加有利于提高前體的轉(zhuǎn)化率。前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利如115產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。產(chǎn)物促進(jìn)劑產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入116

促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的（機理不詳）。有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)；也有人認(rèn)為表面活性劑對酶的表面失活有保護(hù)作用；有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的117在發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計中，一般先用合成成分鑒別特殊需要，再轉(zhuǎn)為天然培養(yǎng)基，以擴(kuò)大生產(chǎn)。在發(fā)酵培養(yǎng)基成分選擇是，除傳統(tǒng)營養(yǎng)外，可選用各種農(nóng)副產(chǎn)品、工業(yè)副產(chǎn)品、廢料等。開發(fā)天然培養(yǎng)基時，應(yīng)考慮：新選微生物及其工藝的特殊營養(yǎng)需求；為保持培養(yǎng)基成分穩(wěn)定，改善儲藏條件和加工條件；原料的性質(zhì)及配制、滅菌、發(fā)酵條件對產(chǎn)物提取的影響；培養(yǎng)基價格。發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計在發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計中，一般先用合成成分鑒別特殊需要，再轉(zhuǎn)為天然118培養(yǎng)基優(yōu)化（1）目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方。（2）只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照他人所使用的比較適合某一類菌種、某一類產(chǎn)品發(fā)酵的經(jīng)驗配方。（3）采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實驗設(shè)計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基優(yōu)化（1）目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計119培養(yǎng)基優(yōu)化的基本原則注意事項：（1）菌種特性，同化能力（2）合適的C、N比。（3）合適的快速利用碳源、氮源。（4）合適的生理性酸性與堿性（5）pH、離子強度等沒有最好，只有更好培養(yǎng)基優(yōu)化的基本原則注意事項：沒有最好，只有更好120提高生產(chǎn)率降低物耗、能耗、三廢排放提高發(fā)酵單位縮短生產(chǎn)時間價廉的原料替代，降低成本培養(yǎng)基優(yōu)化目標(biāo)提高生產(chǎn)率降低物耗、能耗、三廢排放提高發(fā)酵單位縮短生產(chǎn)時間價121正交實驗均勻設(shè)計神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)其他方法聚類分析響應(yīng)面分析單因子實驗成本發(fā)酵單位方法結(jié)果培養(yǎng)基優(yōu)化的基本方法正交均勻神經(jīng)其他聚類響應(yīng)面單因子成本方法結(jié)果培養(yǎng)基優(yōu)化的基本122影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件1.溫度溫度影響微生物酶系的活力，這些酶分別決定微生物的初級代謝生長和次級代謝產(chǎn)抗。不同微生物菌種的生長溫度不一樣，而生長和產(chǎn)抗階段的最適溫度也有差異。發(fā)酵溫度的設(shè)計要綜合考慮能源消耗、發(fā)酵周期、穩(wěn)定培養(yǎng)和產(chǎn)率水平因素，必要時可考慮變溫培養(yǎng)。2.pHpH對微生物的影響，主要也是作用于酶。另外對營養(yǎng)利用和細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有重要影響。無控制的條件下，pH呈現(xiàn)如下變化規(guī)律。有機氮分解，形成大量NH4+NH4+消耗利用碳源消耗產(chǎn)生有機酸菌體老化，進(jìn)入鳥氨酸循環(huán)形成大量NH4+菌體二次生長影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件1.溫度有機氮分解，123影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件

pH的調(diào)節(jié)首要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的設(shè)計，如生理酸堿性物質(zhì)的搭配、緩沖體系的設(shè)計等。另外可以加入外源性的酸堿物質(zhì)調(diào)控，如鹽酸、氨水等。在流補體系中，往往通過葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同時也兼具營養(yǎng)補充功能。3.氧的供應(yīng)工業(yè)微生物大都為好氧微生物，氧的供應(yīng)和利用影響初級生長和次級代謝。工業(yè)發(fā)酵中，將無菌空氣通入培養(yǎng)基，通過攪拌槳分散氣體以實現(xiàn)有效利用，同時維持一定罐頂壓以增大氧的溶解度。反映氧的供給和利用情況的數(shù)值包括：DO溶解氧、OUR攝氧率、Kla氧傳遞速率等，可通過溶氧電極、發(fā)酵尾氣分析儀等獲得。類似的，生長和產(chǎn)抗往往有不同的氧需求。通過調(diào)節(jié)通氣量、攪拌速率、罐壓可以有效控制和保證氧的供給。而發(fā)酵黏度、泡沫等因素往往導(dǎo)致氧利用的惡化，需要警惕和控制。影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件124影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件

4.滅菌條件發(fā)酵罐和培養(yǎng)基滅菌是無菌培養(yǎng)的必要前提，同時也導(dǎo)致營養(yǎng)損失和毒性物質(zhì)積累。因此對于敏感菌種往往需要對部分養(yǎng)分單獨滅菌，以降低影響。但是這些影響因素往往會成為控制生長、調(diào)節(jié)微生物產(chǎn)抗的必要因素。通過滅菌溫度、時間的調(diào)整來控制微生物發(fā)酵也是常用的手段。5.剪切力發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)中，攪拌促進(jìn)氧的分散利用，但槳葉尖端末速形成的剪切力也會損傷菌體，造成菌體斷裂破碎，進(jìn)而導(dǎo)致二次生長、黏度提高、菌種變異等情況，使發(fā)酵惡化。對于剪切，可以篩選耐剪切力菌種，提高菌種抵抗能力。在設(shè)備上也可以選擇低剪切、高分散效率的攪拌槳，如軸流推進(jìn)式槳葉。影響發(fā)酵的相關(guān)因素—培養(yǎng)條件4.滅菌條件125影響發(fā)酵的相關(guān)因素—其他因素

1.種子質(zhì)量的影響2.設(shè)備的影響良好可靠的發(fā)酵設(shè)備是發(fā)酵生產(chǎn)的必要因素。設(shè)備對于發(fā)酵生產(chǎn)的負(fù)面影響表現(xiàn)如：軸封磨損、管路接頭縫隙、過濾器失效導(dǎo)致染菌問題；攪拌不平衡導(dǎo)致罐體震動，影響供氧；開關(guān)閥門動作失靈導(dǎo)致溫度、pH控制不穩(wěn)等等。3.人員操作的影響人員操作是發(fā)酵生產(chǎn)控制的重要因素,對發(fā)酵生產(chǎn)各環(huán)節(jié)都有決定性影響。只有嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作，才能避免由于粗略和錯誤的影響。4.環(huán)境因素環(huán)境因素往往導(dǎo)致發(fā)酵水平的季節(jié)性波動。如環(huán)境空氣的溫濕度會使無菌空氣的溫濕度有差異，導(dǎo)致培養(yǎng)體積隨時間的增減，影響發(fā)酵環(huán)境。（健壯均一、足夠數(shù)量、縮短遲滯期）影響發(fā)酵的相關(guān)因素—其他因素（健壯均一、足夠數(shù)量、縮短遲滯期126發(fā)酵終點的判斷

1.發(fā)酵的評價指標(biāo)發(fā)酵產(chǎn)率：單位體積的產(chǎn)物含量g/L發(fā)酵總億：發(fā)酵液中產(chǎn)物總產(chǎn)量十億單位/kg發(fā)酵系數(shù)：產(chǎn)物總產(chǎn)量/總發(fā)酵體積*總發(fā)酵時間kg/m3*h發(fā)酵成本：發(fā)酵(原料+動力+人員+其他)成本/總產(chǎn)量元/kg2.終點判斷標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵終點的判斷主要從技術(shù)和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)兩方面來衡量。技術(shù)上需要尋找發(fā)酵總億與發(fā)酵系數(shù)的平衡點，當(dāng)總億增加，發(fā)酵系數(shù)卻趨低時即應(yīng)考慮放罐。同時從分離角度考慮，一方面殘余營養(yǎng)物要盡量減少，另一方面菌體自溶不能大量出現(xiàn)。此外，一旦難分離雜質(zhì)組分有升高趨勢，也將影響分離得率和總的成本。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，發(fā)酵終點應(yīng)處于最低發(fā)酵成本位置，但同時也應(yīng)兼顧分離提取需要。發(fā)酵終點的判斷1.發(fā)酵的評價指標(biāo)127（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹128（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹（三）發(fā)酵系統(tǒng)介紹129微生物藥物的發(fā)酵工藝課件130微生物藥物的發(fā)酵工藝課件131微生物藥物的發(fā)酵工藝課件132微生物藥物的發(fā)酵工藝課件133微生物藥物的發(fā)酵工藝課件134工業(yè)發(fā)酵攪拌器技術(shù)的發(fā)展適用發(fā)酵過程的攪拌器徑向流圓盤攪拌器：

－Rushton渦輪

－半彎管圓盤渦輪

－BT-6軸向流攪拌器：

－窄葉高效軸流

A310，CBY,HE3，ZCX等

－寬葉高效軸流

A315，KSX,MaxFlo等

工業(yè)發(fā)酵攪拌器技術(shù)的發(fā)展適用發(fā)酵過程的攪拌器徑向流圓盤攪拌器135工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)紅霉素370噸發(fā)酵罐工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)紅霉素370噸發(fā)酵罐136工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)酶制劑-糖化酶工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)酶制劑-糖化酶137長城最新發(fā)酵攪拌技術(shù)發(fā)酵罐設(shè)計幾點經(jīng)驗發(fā)酵罐的長徑比H/D的考慮：考慮氣體的停留時間以及熱管的布置國內(nèi)一般考慮2.5到3?？紤]攪拌的整體穩(wěn)定、換熱的能力以及罐體水柱背壓對壓縮機背壓的影響從而極大影響壓縮機能耗，國外例如DSM青霉素H/D=2，韓國希杰氨基酸H/D=1；由于攪拌能力提高靠大H/D提高氣含率，與低H/D沒有太大區(qū)別。氣含率的控制：對于目前高的氣含率提供好的供氧，但降低了罐容，我建議對于通氣比在1：0.5以內(nèi)的攪拌控制氣含率在6~8%，抗生素在8~12%之間。

長城最新發(fā)酵攪拌技術(shù)發(fā)酵罐設(shè)計幾點經(jīng)驗發(fā)酵罐的長徑比H/D的138長城最新發(fā)酵攪拌技術(shù)3換熱管的布置：豎型列管，大蛇管，排管，圓形列管束（列管式換熱器型），彈簧管，蜂窩擋板等等。采用形式與發(fā)酵液黏度、固形物含量，發(fā)酵液熱值等等有關(guān)。擋板（換熱管就是一定的擋板）的大小靠近全擋板的75%到80%為佳。豎管大蛇管彈簧管長城最新發(fā)酵攪拌技術(shù)3換熱管的布置：豎型列管，大蛇管，排139工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)小結(jié)大量的工業(yè)生物過程需要攪拌技術(shù)和設(shè)備，攪拌設(shè)備隨著發(fā)酵罐的容積的增大也越來越大；新的攪拌技術(shù)也不斷應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵過程。發(fā)酵罐的高徑比設(shè)計，換熱管的設(shè)計等都與攪拌設(shè)計密切相關(guān)，有許多經(jīng)驗可供參考。

工業(yè)發(fā)酵過程攪拌技術(shù)小結(jié)大量的工業(yè)生物過程需要攪拌技術(shù)和設(shè)備140（四）幾種抗生素的發(fā)酵工藝實例（1）青霉素的發(fā)酵工藝青霉素的產(chǎn)生菌——產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）51-20和點青霉（P.notatum），目前全世界用于青霉素生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株幾乎都是以產(chǎn)黃青霉為出發(fā)菌株，經(jīng)不同的改良途徑得到的。目前青霉素的發(fā)酵單位最高達(dá)到120000U/ml。（四）幾種抗生素的發(fā)酵工藝實例（1）青霉素的發(fā)酵工藝青霉素的141In1928,AlexanderFleming(left),aScottishbacteriologist,discoveredamoldwithbacteria-killingpowerssoincredibleitwaseffectiveevenwhendiluted800times.CourtesyoftheUSDA.Right,astrainofP.notatumwasusedforsomeofthefirsttestsofpencillin.CourtesyoftheFDA’sCenterforDrugEvaluationandResearch.In1928,AlexanderFleming(l142甘油、葡萄糖和蛋白胨組成的培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)砂土孢子生產(chǎn)孢子的制備大米或小米固體培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7d，孢子成熟后真空干燥，低溫保藏備用。甘油、葡萄糖和蛋白胨組成的培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)砂土孢子生產(chǎn)孢子的制143采用三級發(fā)酵，其目的是使青霉菌菌體數(shù)量逐步擴(kuò)大和適應(yīng)發(fā)酵，其次是使發(fā)酵罐連續(xù)使用，縮短發(fā)酵周期。一級發(fā)酵：小罐，使孢子萌芽形成菌絲；二級發(fā)酵：大量繁殖青霉菌菌絲體；三級發(fā)酵：繼續(xù)大量繁殖菌絲體，生產(chǎn)青霉素。大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)采用三級發(fā)酵，其目的是使青霉菌菌體數(shù)量逐步擴(kuò)大和適應(yīng)發(fā)酵，其144發(fā)酵的影響因素及控制碳源、氮源的影響和控制：葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌體的生長；乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素發(fā)酵中采用連續(xù)流加葡萄糖的方法，在發(fā)酵初期使青霉菌大量迅速強壯地繁殖菌絲體；發(fā)酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。玉米漿是青霉素發(fā)酵最好的氮源。

玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、生長素和一些前體物質(zhì)，含大約40%～50%固體物質(zhì)。在玉米浸泡過程中若長有乳酸菌和酵母菌，則提高玉米漿的質(zhì)量；若長有腐敗性細(xì)菌則降低玉米漿的質(zhì)量。（含有大量乳酸）玉米漿是微生物生長很普遍應(yīng)用的有機氮源，它還能促進(jìn)青霉素等抗生素的生物合成。發(fā)酵的影響因素及控制碳源、氮源的影響和控制：葡萄糖是容易利用145前體的影響和控制：苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可以作為青霉素G側(cè)鏈的前體物直接結(jié)合到青霉素分子中，也可以作為養(yǎng)料和能源被利用。苯乙酸、苯乙酰胺等對菌體生長和生物合成均有毒性。采用間歇或連續(xù)添加低濃度前體物質(zhì)的方法，保持前體的供應(yīng)率僅大于生物合成的需要，可以起到提高產(chǎn)量的作用。前體的影響和控制：苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘146pH的影響和控制：青霉素發(fā)酵的最適pH一般認(rèn)為是6.2-6.8，應(yīng)盡量避免pH超過7.0。當(dāng)pH高于最適pH時，通過補糖和生理酸性物質(zhì)（硫酸銨等無機氮源）降低pH；當(dāng)pH低于最適pH時，通過補加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通氣量，促進(jìn)有機酸氧化來提高pH?？衫米詣蛹尤胨峄驂A的方法維持pH。pH的影響和控制：青霉素發(fā)酵的最適pH一般認(rèn)為是6.2-6.147溫度的影響和控制：青霉菌生長的適宜溫度是30℃，分泌青霉素的適宜溫度是20℃，通常采用分段變溫控制法，使溫度適合不同階段的需要。0-56h維持在27.2℃，然后恒速降溫至18.7℃，并維持到184h，最后24h回復(fù)到27.2℃培養(yǎng)。這樣變溫培養(yǎng)法可比常溫25℃培養(yǎng)產(chǎn)量增加16%。溫度的影響和控制：青霉菌生長的適宜溫度是30℃，分泌青霉素的148補料控制：中間補糖以控制糖濃度和pH；補加氮源可延長發(fā)酵周期、調(diào)節(jié)pH、提高青霉素產(chǎn)量，控制發(fā)酵液中的氨基氮含量在0.01%-0.05%。補加表面活性劑，如新潔爾滅50mg/L、聚氧乙烯、山梨糖醇酐等也能增加